-Methyl-bindende DNA capture Sequencing for Patient Tissues
Summary
Hier presenteren we een protocol om het gehele genoom DNA-methylatie in grootschalige klinische patiënt screening studies met behulp van de Methyl-bindende DNA Capture sequencing (MBDCap-seq of MBD-volgende) technologie en de daaropvolgende bioinformatica analyse pijplijn te onderzoeken.
Abstract
Methylering is een van de belangrijkste epigenetische veranderingen aan het DNA, die verantwoordelijk is voor de precieze regulering van genen die nodig zijn voor stabiele ontwikkeling en differentiatie van verschillende weefseltypen. Ontregeling van deze werkwijze is vaak het kenmerk van verschillende ziekten zoals kanker. Hier schetsen we een van de recente sequencing technieken, Methyl-bindende DNA Capture sequencing (MBDCap-volgende), gebruikt om methylering te kwantificeren in verschillende normale en zieke weefsels voor grote patiënt cohorten. We beschrijven een gedetailleerd protocol van deze affiniteitsverrijking benadering samen met een bioinformatica pijpleiding optimale kwantificatie te bereiken. Deze techniek is gebruikt om honderden patiënten in verschillende kankertypes sequentie als onderdeel van de 1000 methyloom project (Cancer methyloom System).
Introduction
Epigenetische regulatie van genen door middel van DNA methylatie is een van de belangrijkste mechanismen voor het lot van de cel met stabiele differentiatie van verschillende weefseltypen bepalen het lichaam 1. Ontregeling van deze werkwijze is bekend dat verschillende ziekten veroorzaken waaronder kanker 2.
Deze werkwijze omvat in hoofdzaak de toevoeging van methylgroepen op het cytosine residuen in de CpG dinucleotiden van DNA 3. Er zijn verschillende technieken die momenteel worden gebruikt om dit mechanisme te onderzoeken, elk met hun eigen voordelen zoals in vele studies 2-8. Hier zullen we een van deze technieken genoemd Methyl-bindende DNA Capture sequencing (MBDCap-volgende), waarbij we gebruik maken van een affiniteit verrijking techniek om gemethyleerde regio's van het DNA te identificeren bespreken. Deze techniek is gebaseerd op het methyl-bindingsvermogen van de MBD2 eiwit te verrijken voor de genomische DNA fragmenten die gemethyleerd CpG sites. We maken gebruik van een commerciële gemethyleerd DNA verrijking kitvoor het isoleren van deze gemethyleerde gebieden. Ons laboratorium heeft honderden patiënten monsters met deze techniek gescreend en hier geven wij een volledig geoptimaliseerd protocol dat kan worden gebruikt om grote patiëntcohorten onderzoeken.
Zoals duidelijk met enige next-generation sequencing technologie, MBDCap-seq vereist ook een specifieke bioinformatica aanpak om nauwkeurig te kwantificeren van de niveaus van methylatie over de monsters. Er zijn veel recente studies in een poging om de normalisatie en analyseproces van de sequentiedata 9, 10 optimaliseren geweest. In dit protocol, tonen we een van deze methoden implementeren van een unieke read herstel aanpak – LONUT – gevolgd door een lineaire normalisering van elk monster om onpartijdige vergelijkingen tussen groot aantal monsters van patiënten mogelijk te maken.
Protocol
Representative Results
Discussion
De MBDCap-seq techniek een affiniteitsverrijking benadering 3, beschouwd als een kosteneffectief alternatief bij het onderzoek cohorten met een groot aantal patiënten 15. De pijpleiding hier gepresenteerde beschrijft een alomvattende aanpak van steekproef inkoop tot data-analyse en interpretatie. Een van de belangrijkste stappen is het opzetten van een PCR amplificatie procedure om de PCR efficiëntie van de GC verrijkte gebieden in het genoom verbeteren omdat daar DNA methylering plaatsvindt. Ook is het van wezenlijk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk wordt ondersteund door CPRIT Research Training Award RP140105, evenals gedeeltelijk ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health (NIH) verleent R01 GM114142 en door William & Ella Owens Medical Research Foundation.
Materials
| Methylminer DNA enrichment Kit | Invitrogen | ME10025 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 112-05D | |
| Bioruptor Plus Sonication Device | diagenode | B01020001 | |
| 3M sodium acetate pH 5.2 | Sigma | S7899 | 100ml |
| SPRIworks Fragment Library System I | Beckman Coulter | A50100 | Fully automated library construction system |
| Adapter Primers | Bioo Scientific | 514104 | PCR primer mix |
| Qubit | Invitrogen | Q32854 | Fluorometric Quantitation System |
| PCR master mix | KAPA scientific | KK2621 | PCR master mix |
| AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | PCR Purification beads |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | |
| HiSeq 2000 Sequencing System | Illumina |
References
- Trimarchi, M. P., Mouangsavanh, M., Huang, T. H. Cancer epigenetics: a perspective on the role of DNA methylation in acquired endocrine. Chin. J. Cancer. 30, 749-756 (2011).
- Nair, S. S., et al. Comparison of methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP) and methyl-CpG binding domain (MBD) protein capture for genome-wide DNA methylation analysis reveal CpG sequence coverage bias. Epigenetics. 6, 34-44 (2011).
- Zuo, T., Tycko, B., Liu, T. M., Lin, J. J., Huang, T. H. Methods in DNA methylation profiling. Epigenomics. 1, 331-345 (2009).
- Clark, C., et al. A comparison of the whole genome approach of MeDIP-seq to the targeted approach of the Infinium HumanMethylation450 BeadChip((R)) for methylome profiling. PLoS One. 7, e50233 (2012).
- Walker, D. L., et al. DNA methylation profiling: comparison of genome-wide sequencing methods and the Infinium Human Methylation 450 Bead Chip. Epigenomics. , 1-16 (2015).
- Huang, Y. W., Huang, T. H., Wang, L. S. Profiling DNA methylomes from microarray to genome-scale sequencing. Technol. Cancer Res. Treat. 9, 139-147 (2010).
- Serre, D., Lee, B. H., Ting, A. H. MBD-isolated Genome Sequencing provides a high-throughput and comprehensive survey of DNA methylation in the human genome. Nucleic Acids Res. 38, 391-399 (2010).
- Brinkman, A. B., et al. Whole-genome DNA methylation profiling using MethylCap-seq. Methods. 52, 232-236 (2010).
- Wang, R., et al. LOcating non-unique matched tags (LONUT) to improve the detection of the enriched regions for ChIP-seq data. PLoS One. 8, e67788 (2013).
- Gu, F., et al. CMS: a web-based system for visualization and analysis of genome-wide methylation data of human cancers. PLoS One. 8, e60980 (2013).
- Lan, X., Bonneville, R., Apostolos, J., Wu, W., Jin, V. X. W-ChIPeaks: a comprehensive web application tool for processing ChIP-chip and ChIP-seq data. Bioinformatics. 27, 428-430 (2011).
- Jadhav, R. R., et al. Genome-wide DNA methylation analysis reveals estrogen-mediated epigenetic repression of metallothionein-1 gene cluster in breast cancer. Clin. Epigenetics. 7, 13 (2015).
- Hsu, Y. T., et al. Promoter hypomethylation of EpCAM-regulated bone morphogenetic protein gene family in recurrent endometrial cancer. Clin. Cancer Res. 19, 6272-6285 (2013).
- Wang, Y. V., et al. Roles of Distal and Genic Methylation in the Development of Prostate Tumorigenesis Revealed by Genome-wide DNA Methylation Analysis. Sci. Rep. , (2015).
- Plongthongkum, N., Diep, D. H., Zhang, K. Advances in the profiling of DNA modifications: cytosine methylation and beyond. Nat Rev Gen. 15, 647-661 (2014).
- Riebler, A., et al. BayMeth: improved DNA methylation quantification for affinity capture sequencing data using a flexible Bayesian approach. Genome Biol. 15, R35 (2014).
