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Medicine

Un Paso a Paso Protocolo para la cirugía subretiniana en conejos

Published: September 13, 2016
doi:
10.3791/53927
, , , , , , , , ,
1Department of Ophthalmology,University of Bonn, 2Department of Ophthalmology,National University of Singapore, 3Geuder AG, 4Department of Ophthalmology,University of Münster, 5Section on Epithelial and Retinal Physiology and Disease,National Eye Institute/National Institutes of Health, 6Surgical Retina Department,Singapore National Eye Centre

Summary

Epitelio pigmentario de la retina (EPR) y las estrategias de sustitución basado en la terapia génica son considerados por varias condiciones degenerativas de la retina. Para la traducción clínica, se requieren grandes modelos animales para estudiar el ojo técnicas quirúrgicas aplicables en los pacientes. Aquí presentamos un modelo de conejo para la cirugía subretiniana orientado hacia el trasplante de EPR, que es versátil y rentable.

Abstract

La degeneración macular relacionada (AMD), la retinitis pigmentosa y otras enfermedades relacionadas con el EPR son las causas más comunes de pérdida irreversible de la visión en adultos en los países industrialmente desarrollados. RPE trasplante parece ser una terapia prometedora, ya que puede reemplazar RPE disfuncional, restaurar su función, y por lo tanto la visión.

Aquí se describe un método para el trasplante de una monocapa RPE cultivadas en un andamio en el espacio subretiniano (SRS) de los conejos. Después de xenotrasplantes de vitrectomía se dieron en el SRS utilizando un tirador por encargo que consta de una boquilla metálica de calibre 20 con un émbolo revestido de politetrafluoroetileno (PTFE). La técnica actual se desarrolló en más de 150 cirugías de conejo durante 6 años. Post-operatorio de seguimiento se puede obtener utilizando no invasiva y repetitiva de imágenes in vivo como dominio espectral tomografía de coherencia óptica (OCT-SD), seguido por la histología de perfusión-fijo.

ThMétodo E tiene pasos bien definidos para facilitar el aprendizaje y la alta tasa de éxito. Los conejos se consideran un gran modelo animal del ojo útil en los estudios preclínicos para la traducción clínica. En este contexto, los conejos son una alternativa rentable y tal vez conveniente a otros modelos animales de ojos grandes.

Introduction

La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) es la causa más común de discapacidad visual en los adultos de 50 años o más en los países industrialmente desarrollados, ya que causa la pérdida de la visión central. Alrededor del 15% de estos pacientes sufren de la forma "húmeda" de la enfermedad, en la que la neovascularización se origina en la coroides y altera la función de la retina 1. Esta variante puede ser tratada mediante una terapia altamente eficaz con inyecciones repetidas intra-vítreo de los fármacos antiangiogénicos 2. Sin embargo, la gran mayoría de los pacientes (~ 85%) sufren de la forma seca, que se caracteriza por depósitos extracelulares (por ejemplo, drusas) bajo el epitelio pigmentario de la retina (RPE). Estos depósitos causan la disfunción RPE que conduce a atrofia de la retina en la mácula. Dada la falta de opciones terapéuticas curativas, AMD se convirtió en un campo de investigación intensiva en desarrollo, donde se están ensayando diversos enfoques terapéuticos curativos. reemplazo RPE quirúrgica esuna atractiva posibilidad futura para derrotar esta enfermedad debilitante 3.

El trasplante autólogo de RPE RPE subretiniano reemplaza disfuncional o perdido en la mácula, y tiene el potencial para restaurar su función fisiológica 4-9. Esta técnica quirúrgica tenía un gran avance con el desarrollo de protocolos de diferenciación de las células RPE madre embrionarias humanas (células madre) y células madre pluripotentes inducidas (IPSC), dando el científico una fuente de células de RPE ilimitada para el trasplante 10. trasplante de RPE es ahora reconocida como una atractiva primera vez en seres humanos solicitud de productos terapéuticos derivados de células madre. El ojo ofrece un excelente acceso quirúrgico y sofisticadas herramientas de monitorización in vivo en 11-13.

Para trasplantar el RPE, una forma es con una entrega mínimamente invasiva utilizando una suspensión de células, de forma alternativa, para conservar mejor las características de RPE y la función del trasplante, arti fi substr portador cialAtes (andamios) para la sustitución del EPR están siendo considerados 4,14,15. Se requieren grandes modelos animales para la validación preclínica, sin embargo, la información técnica detallada sobre el manejo de animales y la técnica quirúrgica que falta hasta la fecha 16-23.

Nosotros y otros 11,24 A pesar de algunas pruebas de lo contrario 25, sugerimos el uso de un sustrato de soporte rígido pero elástico, ya que proporciona un manejo más seguro, preserva la integridad de la monocapa y funcionalidad. Con el tiempo hemos probado varios instrumentos diseñados a medida y técnicas auxiliares para la implantación de células portadoras trasplantes RPE apoyados en el espacio subretiniano (SRS). Hemos utilizado las grabaciones de vídeo intraoperatorias, en oftalmoscopio láser de barrido vivo combinado con dominio espectral tomografía de coherencia óptica (SLO / SD-OCT), y la histología para evaluar el éxito de la implantación 14,26,27. Aquí proporcionamos nuestra recomendación actual para implantes RPE subretiniana en conejos,el cual se ensayaron en 5 cepas diferentes de conejo, 7 materiales de soporte de células y fuentes de células RPE 4 en más de 150 procedimientos.

Protocol

La ética de la manipulación de los animales en la investigación oftálmica: Se obtuvo la aprobación del comité de ética de la Facultad de Medicina, Universidad de Bonn, y se adhieren a las directrices establecidas por la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO). Por otra parte, todos los procedimientos fueron aprobados por las autoridades reguladoras del estado de Renania del Norte-Westfalia. Los animales se mantuvieron bajo techo en un centro especializado en una habitación con aire acondicionado, con temperaturas entre 18 – 20 ° C, la exposición a la luz del día regular, en jaulas individuales estandarizados con acceso libre a comida y agua. Nota: Para asegurarse de que los animales afinidad operativa, una hoja de resultados de salud de los animales se sigue que incluye los siguientes criterios de exclusión definitiva de animales: 20% de pérdida de peso en comparación con el peso sobre la admisión; cianosis aparente del animal; escalofríos animales, tiene calambres o no puede mover en coordinación; . ataxia / parestesia, por ejemplo, paraliza; apatía; la mutilación extrema automático (heridas en la piel, miembros amputados). </ P> 1. La esterilización de instrumentos Coloque los instrumentos reutilizables en el baño de ultrasonidos. Añadir 500 ml de agua destilada y 2 ml de desinfectante instrumento. Limpiar los instrumentos que utilizan la función de barrido durante 15 minutos. Suprimir instrumentos de baño de ultrasonidos y enjuagar bien con agua destilada durante 5 minutos. Insertar instrumentos en autoclave y utilizar el programa estándar (esterilización de instrumentos bajo 121 ºC durante 20 minutos). 2. Preparación Instrumento Establecer y mantener un campo estéril, al trabajar en una habitación cerrada, el uso de batas quirúrgicas, máscara y cubierta de pelo. Desinfectar las manos antes de usar guantes quirúrgicos estériles. Para la aproximación detallada ver 28. Coloque los instrumentos esterilizados en un campo estéril. Colocar 1 ml jeringa llena con 40 mg de triamcinolona unido a una aguja 27 G para la inyección, la jeringa 10 ml con solución salina equilibrada (BSS), y 5 ml jeringa of lubricante en cortina. Coloque seda 3-0, 7-0 vicryl, palos oculares (para detener la hemorragia conjuntival / escleral), esponjas de gasa tornado, tiras de cierre de la herida (para fijar el tubo de punta vitrectomía), y el cable de lámpara de la fibra endoillumination en una sábana. Desenvuelva 25 G araña endoiluminador y conectarse a la máquina de luz usando técnicas estériles (véase el paso 2.1). Conectar el set de vitrectomía incluyendo vitrector alta velocidad y casete de Venturi para equipo de vitrectomía utilizando técnicas estériles (véase el paso 2.1). Abra la botella de 500 ml de BSS y conectarse a la solución Venturi casete según las instrucciones del fabricante. 3. Preparación de la anestesia y el posicionamiento del Animal Pesar animales para asegurar la dosis del medicamento precisa. Preparar la anestesia intramuscular (IM) usando 1 jeringa con aguja 27 G que contiene 0,35 mg / kg de ketamina y 0,25 mg / kg de medetomidina para el arranque. Voltear la jeringa para mezclar. Preparar 2 jeringas con 1/3 tque las dosis para mantener la anestesia durante la operación. Preparar jeringa que contiene 20 ml de solución de glucosa al 5% y 18 aguja G para la inyección subcutánea como una alternativa infusión intravenosa. Dar 3 x 1 gota de ojo midriático falla antes de la vitrectomía para la dilatación de la pupila. conejo de la cubierta con una manta a la calma antes de la inyección de anestesia, se inyectan en la extremidad posterior (músculo glúteo) y masaje alrededor del sitio de la inyección durante 30 segundos. Nota: El primer tiro de la anestesia IM dura aproximadamente 1 – 2 horas. dependiendo del tamaño del conejo, tolerancia a las drogas, la capa de grasa, el estrés y la temperatura corporal. El primer signo de la anestesia desvanecimiento es un nistagmo (deberá ser supervisado por el cirujano), las inyecciones posteriores duran alrededor de 30 – 45 min. Confirmar la anestesia apropiada, mediante la verificación de la hipnosis, hiporreflexia, analgesia y relajación muscular del animal. Dar una inyección subcutánea (Pt. 3.3) en el pliegue cutáneo del cuello, una vez que el conejo es inconsciente. Añadir metilClubricante ellulose cada 5 – 10 minutos a en el ojo operado, añadir lubricante y cinta de tapas en el ojo no operado. Coloque la cubierta de conejo en la mesa quirúrgica cubierta con una cubierta tal como una manta de algodón en una posición óptima (nariz ligeramente elevada a través de un molde de la manta, por lo que está a nivel con la superficie ocular) bajo el microscopio quirúrgico. Alinear el ojo perpendicular al microscopio objetivo. Garantizar la adecuada temperatura corporal utilizando un termómetro rectal (normotermia 39 ± 1 ºC) 29. pestañas de corte con unas tijeras (un poco de ungüento en la lámina) para reducir las infecciones postoperatorias. Desinfectar el ojo utilizando 2 – 3 gotas de 0,1 g / ml povidona yodada tópica durante 1 min y aclarar con BSS estéril. Cubrir el ojo con paño estéril con la apertura de pre-corte en el medio para el ojo y luego cubrir con caída (pegajoso) incisión quirúrgica 12 x 17 cm. 4. La vitrectomía Proptose y el ojo seguro con seda 3-0 usando invpinza y erted, lleve a cabo una peritomía conjuntival. Incisión en la conjuntiva con una tijera Vannas cerca del limbo, pero lo suficientemente lejos de los vasos sanguíneos (~ 1 mm de distancia). Diseccionar la conjuntiva mediante la creación de una "T-corte". En primer lugar ampliar la peritomía con la tijera paralelo al limbo y luego una incisión en la conjuntiva verticalmente en forma de una "T" durante aproximadamente 6 – 7 mm. separe con cuidado la conjuntiva sin rodeos. Realizar una sclerotomy utilizando una cuchilla de 23 G microvitreoretinal (MVR) a las 8 de la mañana del ojo derecho / OD (4 horas el ojo izquierdo / OS) insertando cuidadosamente la punta afilada de la cuchilla en dirección hacia el nervio óptico. retraer lentamente la cuchilla en la misma dirección y evitar la ampliación de la esclerotomía. Insertar y lado de encargo de sutura puerto de infusión cánula 27 mediante una sutura de seda 7-0 y ajuste de la presión intraocular (PIO) a los 24 mmHg. Realizar una sclerotomy con 25 g de trocar cabeza plana a las 2 en punto de OD (10 O '; Reloj en OS) similar a la etapa 4.2. Inserte 25 G luz de la lámpara en trocar de punta plana, fijar con cinta adhesiva y encienda la fuente de luz a aproximadamente 30%. Si es necesario, retire epitelio de la córnea edematosa utilizando un bisturí # 20 para una mejor visualización intraocular. Realizar una sclerotomy similar a la etapa 4.2 a las 10 en punto de OD (dos en OS), (pre) punta de la cuchilla de vitrectomía lugar 7-0 suturas alrededor sclerotomy sin atar el nudo en forma de U, y la inserción. Iniciar la vitrectomía 30 alrededor del orificio de entrada, y luego continuar sobre el disco óptico y los medullares fibrae utilizando vitrector alta velocidad por cortar el humor vítreo en trozos pequeños en el máximo. 2.000 – 3.000 cortes / min, aspiración a la max. 200 mmHg mediante la configuración del parámetro indicado de la máquina de vitrectomía (Tabla 1) Realizar un desprendimiento del vítreo posterior (DVP) separando el humor vítreo de la retina mediante la celebración de la alta velocidad a través de vitrector la parte posterior del poste unaND (si es posible con suavidad) superior del disco 31 mientras se aspira únicamente a la max. 200 mmHg sin cortar. Inyectar ca. 50 l (20 mg) de triamcinolona o fluoresceína diluido (ca. 0,1 mg / ml) por vía intravítrea para visualizar y facilitar (cerca total) eliminación del vítreo que flota sobre el polo posterior y periferia media durante la vitrectomía. Evitar cruzar debajo de la lente. Se recomienda el sangrado para afeitarse vítreo periférico por un asistente (especializada), si se desea taponamiento de gas. Añadir 20 unidades / ml de heparina y 0,5 mg de epinefrina a concentración final de 0,001 mg / ml en la solución de infusión BSS en paralelo o después de la etapa 4.10. Nota: Como la heparina / epinefrina no se inyectan intraocular sus efectos se retrasan dependiendo de la tasa de flujo de infusión. 5. Carga tirador Nota: El trabajo descrito en este documento no entra dentro de los principios de la Declaración de Helsinki; no involucró pacientes humanos. Aquí, staándar células RPE fueron aisladas de los ojos humanos fetales, cultivadas y diferenciadas en poliéster no revestida de 10 micras de espesor (PET) inserta de acuerdo con el protocolo publicado previamente 14. Un permiso para trabajar con el material fetal humano se obtuvo del comité de ética de la Universidad de Bonn. Alternativamente, HES-RPE fueron enviados desde el laboratorio Skottman (manuscrito en preparación.), Donde se cultivan de acuerdo con la técnica descrita por Vaajasaari et al 32.; para estas células un permiso se ha obtenido del Instituto Koch R., Berlín, Alemania. Enjuague de cultivo celular antes de la preparación de la 3x implante con BSS oftálmica grado. Llene una placa de cultivo celular estándar (100 x 20 mm) con 10 ml de BSS oftálmica grado. Añadir la inserción de cultivo celular en el BSS y el centro del plato con un microscopio óptico. Perforar un implante de 2,4 x 1,1 mm con un óvalo, aguja roma, hecho a medida para obtener un sustrato plano, en forma de frijolcon dos bordes largos y dos bordes redondos. Inundar suavemente la aguja a través del segundo puerto con BSS para hacer salir el implante en la estación de carga por encargo BSS llenado (Figura 1). Opcionalmente cortar un extremo redondo del implante (<0,5 mm), para obtener un tercer borde. Asegúrese de que el implante está en la orientación correcta, asegurando que la monocapa está al revés en el soporte celular. Para cambiar el posicionamiento de utilizar cuidadosamente dos escalpelos. Empuje el implante suave y completamente en el instrumento tirador utilizando el soporte de la aguja hasta que todo el implante se fija en el interior de la punta. El émbolo debe permanecer retraída. Mantenga la punta de disparos "cargado" en la estación de carga bajo BSS hasta el momento de la implantación. 6. Implantación Enfoque de retina neural con extensible 41 G aguja de inyección subretinal conectado a una jeringa estanca a los gases (asegúrese de que todas las burbujas de aire han sido evacuadosa partir de tubo!). Inyectar BSS (con calcio y magnesio / CM) subretinally y de ese modo crear un desprendimiento de retina de la ampolla (BRD) de aproximadamente 2-3 diámetro de disco (DD). Dos BRD por ojo se puede levantar con seguridad. Agrandar retinotomía a 1,5 mm con 23 g verticales VR-tijeras. El espacio subretinal es ahora accesible para la implantación o más maniobras. Extender sclerotomy (precisamente) con un cuchillo de incisión de 1,4 mm a 20 G enfoque. Intentar pasar a través del uso de un tirador sclerotomy maniquí 20 G, ampliar según sea necesario para garantizar una transición sin problemas, sin embargo, ceñido del tirador cargado. Pasar con el tirador cargado 27 a través de sclerotomy idealmente a 24 mmHg. Enfoque retinotomía borde y expulsar el implante subretinally desde una posición epirretiniana. Ajustar el implante con semicerrados 23 g tijeras, pinzas o aguja 41 G para asegurarse de que se sitúe bajo la retina- razonablemente lejos de la retinotomía. 7.Poner fin a la operación Retire 25 G de la lámpara y la cánula de infusión. Suturar todas las esclerotomías. Inyectar 25 l (10 mg) de triamcinolona por el sclerotomy 8:00 (antes de la sutura última sclerotomy). Comprobar / ajustar la PIO mediante palpación e inyectar BSS a través de 30 G de la aguja / jeringa, si es necesario. conjuntiva sutura con Vicryl 7-0. Retire proptosing 3-0 cabestrillo de seda lentamente (Evitar profunda plexo venoso orbital!). Añadir dexametasona ungüento / antibiótico bajo la tapa. Posición durante 1 hora cubierto con una manta con el ojo operado hacia arriba (w / o gas), o hacia abajo (con aire / gas). No deje desatendida animales hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener la posición decúbito esternal. No transporte de conejo antes de la anestesia se desvanece por completo, esto puede acelerarse mediante la inyección de medetomidina agente de igualdad de marcha atrás a la cantidad de medetomidina dado. 8. Post-operatorio Cuidado de Animales Guardarconejos en condiciones adecuadas (temperatura, luz, alimento, agua, espacio, etc.) y una estrecha vigilancia en una instalación especializada. Asegúrese de que los animales esté bien descansado, es decir., No hay largos períodos de privación de alimentos o agua. Busque cualquier heridas o lesiones, especialmente en los sitios de inyección. Mantenga las heridas secas para prevenir infecciones. Dar antibióticos cuando se sospecha de infección: dexametasona 1 mg / g, neomicina sulfato de 3.500 UI / g, sulfato de polimixina B se aplicó 6.000 UI / g de ungüento dos veces al día durante 1 semana postoperatoria sobre la superficie ocular. Añadir dexametasona ungüento / antibiótico para el próximo 7 días postoperatorios dos veces al día para una mejor regeneración de la superficie ocular y la reducción del dolor post-operatorio. Dar analgésicos sistémicos (Carprofene 4 mg / kg dos veces al día) durante 48 h inicial. No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener la posición decúbito esternal. No devuelva un animal quese ha sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado. No exponer a los animales a sufrimientos innecesarios. 9. SLO / SD-OCT Orientación Preparar e inyectar la anestesia intramuscular (IM) usando 1 jeringa con aguja de 27 G que contiene 0,175 mg / kg de ketamina y 0,125 mg / kg de medetomidina para el arranque. Voltear la jeringa para mezclar. Añadir un lubricante por lo menos cada 5 minutos para hidratar los ojos y mantener una clara imagen SD-OCT, opcionalmente una lente de contacto personalizado puede ser utilizado. Adjuntar una plataforma de acero en el reposacabezas para estabilizar el animal en la posición requerida. Colocar el conejo en la plataforma de acero, colocando su ojo perpendicular a la sonda. Mantenga la cabeza del conejo del hueso de la mejilla inferior (mandíbula) evitando la tráquea. la cabeza del animal de la inclinación de aproximadamente 45º hacia la OCT SD-sonda para optimizar el ángulo de visión sobre el implante. Utilizar una lente de 30 grados y los siguientes parámetros para opttremo de imágenes de OCT [SA]: 30 grados ajustes para sola línea escanea con el modo de ART se ajusta al 100 (de promedio) y 20 x 20 ajustes de grado para las exploraciones de volumen con el modo de arte fijado a 15; No se requiere el modo de alta resolución. Utilice SLO formación de imágenes de infrarrojos de reflectancia para encontrar el plano focal del implante (Fig 2A.); un enfoque óptimo se alcanza cuando (todos) los bordes del implante son agudos 14. Añadir dexametasona 1 mg / g, neomicina sulfato de 3.500 UI / g, polimixina B sulfato de 6.000 UI / g pomada debajo de la tapa cuando haya terminado.

Representative Results

Los resultados del método descrito para el implante subretiniano se muestra en la Tabla 2. El injerto debajo de la retina tuvo una tasa de éxito de aproximadamente 61% cuando se realiza una vitrectomía del núcleo y se elevó hasta el 76%, cuando se indujo desprendimiento vítreo posterior. Estos números incluyen ca. 21% de los animales que murieron ya sea durante la operación o durante los 3 primeros días del postoperatorio. Esta técnica se puede utilizar para implantar dos andamios sobre diferentes áreas de la retina de un ojo de forma simultánea. Los conejos fueron sometidos postoperatorio en vivo seguimiento utilizando SD-OCT y el procesamiento histológico como se describe por Stanzel et al. 27 (Figura 2). Fig. Escaneo oftalmoscopio láser imagen reflectancia en el infrarrojo de RPE cultivadas implantado en una membrana de poliéster (PET) 2A muestra después de un trasplante sin complicaciones. loshalo alrededor del implante corresponde a la atrofia de los fotorreceptores. fig. 2B muestra adelgazamiento correspondiente SD-OCT, la notificación de la retina, la capa nuclear principalmente externa (ONL), banda reflectante hiper en SD-OCT por encima del implante, mientras que la retina neural adyacente al implante muestra casi normales bandas de reflexión. Estos resultados sugieren una entrega atraumática. Fig. 2C muestra Hematoxilina / Eosina (H / E) del implante, que muestra la cicatrización subretiniana y atrofia ONL alrededor del sitio retinotomía probablemente como resultado de la manipulación iatrogénica, una capa pigmentada todavía irregular contiguos de más de PET. la membrana de Bruch por debajo del implante también parecía ser contigua, y el coriocapilar contiene algunos eritrocitos dispersos. Estos resultados morfológicos son comparables a la SD-OCT y reforzar la tesis de un parto traumático. Higo Ure 1: Cargando tirador con Human IPSC-RPE cultivadas en PET Soporte celular. A) muestra punzonado de un implante utilizando por encargo de la aguja. B) del implante en forma de grano de corte del cultivo de células. C) Posicionamiento del implante antes de la carga. D) Carga de un tirador con implante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura . Figura 2: humana cultivadas HES-RPE en PET Cell Carrier 4 semanas de conejo Subretiniana espacio. A) Imagen de reflectancia en el infrarrojo SLO Muestra, la línea verde demarca la sección transversal mostrada en la Fig. 2B. B) Corresponde SD-OCT. C) H / E mancha, véase el texto o 26,27 para más detalles.ove.com/files/ftp_upload/53927/53927fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Parámetro configuración utilizada vitrectomía 6.000 cortes / min Vacío 200 mmHg Hora de levantarse 1 segundo Aire 24 mmHg Irrigación 24 cm de H2O DiathErmy 30% Tabla 1: Configuración de parámetros de la máquina de vitrectomía. vitrectomía Implante conejos operados implantes con éxito implante fallido Muerte Tasa de éxito% vitrectomía central MASCOTA 30 19 4 7 63.33 PET + RPE 70 42 12 dieciséis 60 PVD, ± plasmina w / PPV MASCOTA 28 21 2 5 75 PET + RPmi 22 17 2 3 77.27 Tabla 2: Resumen de los últimos 150 operaciones incluyendo Método y Tipo de implantes.

Discussion

El uso de un modelo de conejo, se presenta un método seguro y reproducible para la entrega transvítrea de RPE cultivadas en portadores de células en el espacio subretiniano con un instrumento de tirador de diseño personalizado. El método descrito ofrece una técnica quirúrgica corta / optimizado para facilitar el aprendizaje, ya que implica técnicas estándar en la vitrectomía con maniobras subretiniana. Resultado se ve facilitada en gran medida por una interfaz vitreorretiniana limpio, y la infusión intraocular que evita la turbulencia del fluido sobre el sitio de implantación, la inducción de la ampolla desprendimiento de retina (BRD) a baja presión intraocular, la prevención de retina y daños esclerótica a través de la sequedad, y el posicionamiento apropiado del conejo.

Advertimos sin embargo, como varias complicaciones intraoperatorias pueden ocurrir en cualquier momento, lo que dificulta el éxito de la implantación, por ejemplo intra hemorragias oculares, la anestesia decoloración fuera durante las etapas vitales, tales como la implantación, el colapso de la BRD debido a la manipulación de instrumentos o hipotonía ocular, rabbit la muerte debido a las dosis excesivas de la anestesia, la presión arterial baja durante el funcionamiento a largo causando daño cerebral hipóxico, o hipertermia. Sin embargo, estas complicaciones disminuyen con el tiempo, ya que son rápidamente abordados y resueltos mediante el aumento de la experiencia del equipo quirúrgico.

Algunas complicaciones podrían reducirse siguiendo unos simples, pero importantes pasos. El lubricante debe añadirse cada 5 – 10 minutos a para prevenir la córnea daños, escleral y conjuntival durante la operación, y mantener una clara medios intraoculares, como secado esclerótica / ennegrecido pueden ser una causa de dehiscencia de la herida, que a su vez conduce a la hipotonía ocular y / o fuga intraoperatoria de esclerotomías. La heparina se debe añadir para evitar la formación de una película de fibrina que hace que la implantación particularmente subretinal desafiante y adición simultánea de epinefrina para reducir el sangrado bajo heparina 16. veces demasiado largo heparina / exposición epinefrina (> 1 hora) se debe evitar para prevenir ede la córneama por descompensación endotelial 33, crisis hipertensiva o la muerte intraoperatoria. eliminación meticulosa vítreo se debe realizar en el puerto de instrumento (entrada) para evitar la retina y / o desprendimientos coroideos. instrumentos intraoculares debe dirigirse hacia el polo posterior para evitar el contacto de la lente (provoca la formación de cataratas iatrogénica) o (sitio de entrada) daño en la retina. Una cánula de infusión de puerto lateral intraocular se debe utilizar, ya que atenúa la corriente en chorro alrededor de la zona de implantación, evitando así la rotura incontrolada de la retinotomía, y el colapso de la BRD. inducción BRD en la línea media (eje vertical del nervio óptico) o cerca de fibras ópticas medulares deben evitarse para prevenir extensos desprendimientos de retina iatrogénicas. Finalmente, el último pero no menos importante BRD debe ser inducida a baja presión intraocular, para evitar la inyección subretiniana BSS utilizando caudales excesivos que pueden dar lugar a un daño en la retina (por ejemplo., Por el estiramiento).

Muchas variables de estudio como Carrie celularr variantes, fetal, madre adultas o fuentes de células derivadas de células RPE, opciones para los inmunosupresores, etc., pueden ser explorados 14,26,27,34. Nuevas mejoras tales como los métodos de cultivo libre de suero RPE, caracterización de xenoRPE en el espacio subretiniano, la eliminación de la capa de RPE anfitrión 14 o estrategias para el anclaje del implante son trabajo actual en progreso.

Hasta la fecha, las técnicas descritas se han utilizado en 5 cepas de conejo diferentes, incluyendo bastardo Chinchilla, Chinchilla bastardo / híbridos KBL, Nueva Zelanda Blanco / Cruz Roja, Nueva Zelanda Blanco (albino) y holandés con cinturón. Ambos conejos machos y hembras fueron operados, con los conejos al menos 1,5 kg o 2 meses de edad (dependiendo de la especie). La mayoría de las cirugías estaban en conejos pigmentados (bastardos de chinchilla o híbridos bastardos chinchilla) con pesos entre 2,5 – 3 kg.

Todas las cepas de conejo que hemos tenido la oportunidad de trabajar con parecen tener algunas peculiaridades. Teniendo en cuenta los aive disponibilidad de conejos pigmentados de la cepa de chinchilla bastardo en Alemania en 2009-13, hemos recogido la mayor experiencia con estos animales. Por desgracia, ya no está disponible, ya que la reproducción se ha interrumpido, pero se compara muy bien a New Zealand White Cross / Red excepción de la esclerótica más grueso más ventajosa y volúmenes más grandes de los ojos en el segundo. Chinchilla híbridos bastardos tienen formación significativa de fibrina intraoperatoria y requieren el uso de heparina / epinefrina como se describe anteriormente para asegurar las maniobras subretiniana exitosas. Este protocolo también se ha realizado en conejos albinos no pigmentadas (blancos de Nueva Zelanda), la creación sin embargo particularmente BRD y la implantación subretinal es más difícil dado apreciación reducida de contraste. La viabilidad de inducir un desprendimiento vítreo posterior no parecía cepa dependiente de conejo en nuestras manos.

subretiniana entrega transvítrea es probable que la futura estrategia quirúrgica de elección dado que es el más comm en la ruta de hoy en día clínicamente para acceder a la retina. Como resultado, muchos otros grupos han presentado este tipo de técnicas para la RPE cultivadas en soporte apoya en 11,15,23,35 trabajo con animales. Aramant et al. 36 tienen un instrumento, que coloca en lugar de empuja su implante suave de hidrogel encapsulado a su sitio diana subretinal. El diseño de Thumann y col. Utiliza una espátula hueca, que libera el injerto portadora apoyada por flotando fuera a través de la inyección de fluido 19. Ambos ex estrategias requieren la inserción subretiniano del instrumento, que en nuestra opinión es más propenso a las complicaciones, en comparación con un instrumento epiretinally appositioned. Montezuma et al. 22 describe un instrumento de inserción subretiniana para el suministro de implantes de chips subretiniana en los cerdos, pero ningún trabajo adicional se ha publicado desde a lo mejor de nuestro conocimiento. Hemos sido capaces de extender la técnica descrita con alguna modificación al cerdo.

jove_content "> Nuestros portadores celulares preferidas son 10 micras de espesor de tereftalato de poliéster (PET) membranas. Desde una perspectiva quirúrgica, este material tiene parámetros de rigidez y elasticidad favorables, además de su amplia versatilidad durante los experimentos de cultivo celular. Encontramos experiencias similares con tetrafluoroetileno expandido (ePTFE) 37 o nanofibras membranas electrospun de PET, poli-ácido láctico / capronolactic (PLCL) o poli -. láctico-co-glicólico (PLGA), así como de nanofibras compuesto (PLGA o PET) y PET ultrafino 26 Cuando membranas de PET se utilizan con nuestro instrumento tirador metálico, tienen una tendencia ocasional a exhibir carga electrostática, que pone a prueba su expulsión desde el tirador 27. membranas de poliamida Ultrathin podrían en nuestras manos no ser implantados en el espacio subretiniano con el protocolo descrito anteriormente ( manuscrito en preparación).

Marmor et al. han estudiado sistemáticamente reso espontánearption del líquido subretiniano en iatrogénicas desprendimientos de retina localizadas 38-41. Incluso después de la manipulación en el espacio subretiniano se encontró que éstos absorban día postoperatorio 4 en cirugías sin incidentes. retinopexia con láser no se lleva a cabo para asegurar los bordes de la retinotomía. Aún en contra de si se compara con la cirugía humana, no se requiere taponamiento aire / gas. A menos que se puede lograr la eliminación meticulosa de vítreo periférico, en particular en el cuadrante superior, esto puede de hecho resultar en desgarros retinianos gigantes procedentes de la retinotomía. Sólo se recomienda para llevar a cabo el intercambio de aire fluido con la subsiguiente taponamiento de gas SF6 20% de salvar los desprendimientos de retina iatrogénicas intraoperatorias o en caso de una posición de implante en particular necesita ser asegurado.

Aunque la ablación inducida mecánicamente de la retina neural puede causar daños en los fotorreceptores y RPE en conejos 42,43, su extensión varía mucho (incluso con BSS regular) dependiente de factores tales como el tipo de IOP, jeringa usada, volumen de inyección con la retina de ese modo de extensión inducidos, etc. También hemos probado la frecuencia recomendada de Ca / Mg-libre BSS facilitaron desprendimiento 42-44, pero se encontró que causa la opacificación del cristalino intraoperatoria (particularmente con temperatura elevada), y significativamente retrasa o incluso afecta la retina re-anexo 27. Por lo tanto, se recomienda volumen de 30 l de BSS regular con una jeringa de 100 l – subretiniana inyección lenta de 20; movimientos de la aguja de inyección deben ser mínimos por lo que los sellos retinotomía alrededor de ella y evitar daños en la membrana de Bruch. Algunos de los daños iatrogénicos se pueden resolver por RPE cicatrización de la herida, y la preservación relativa observada de grosor ONL después de reinserción, sugiere que el complejo / fotorreceptor RPE puede tolerar este deterioro, como también se describe por otros 45.

productos terapéuticos basados ​​en células o prótesis de retina requieren ánima preclínical prueba antes de la aprobación regulatoria y el inicio de los estudios de seguridad humanos. El primero puede variar de país a país. El modelo de conejo descrito aquí puede servir como una plataforma rentable y menos exigente para el establecimiento o incluso llevar a cabo todos los requisitos de las autoridades reguladoras. Por otra parte, puede servir posteriormente para la formación de cirujanos en los ensayos clínicos multicéntricos o eventuales mejoras adicionales de la técnica a lo largo del camino.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Con el apoyo de subvenciones de la Fundación Rüdiger en 2008 y 2010 (BVS), BONFOR / Gerok Beca O-137.0015 (BVS), BONFOR / Gerok Beca O-137.0019 (FT), Deutsche Forschungsgemeinschaft / DFG (BVS) STA 1135 / 2-1, chino Consejo beca Nº 2008627116 (ZL) y una subvención sin restricciones por Geuder AG, Heidelberg (Fig. 2). Miembros del laboratorio de H. Skottman, Universidad de Tampere Finlandia se agradece para proporcionar HES RPE se muestra en la figura 2 se derivan.

Materials

s30 ultrasonic cleaning unit Elmasonic 100 4631 2.75L
DE-23  autoclave Systec C 2209 23L
Syringe  BD  300013
300995 
301285
300294
300330 		 1ml x3
2ml x3
5ml x1
10ml x1
20ml x1
Needle  BD 305196
305136		 18G x 1 
27G x5
Scalpel Feather 2975#20 blade#20 x3
Surgical drape HARTMANN
LOHMANN & RAUSCHER		 277 502
25 440		 60×40 cm x2
12×17 cm
Ocular sticks LOHMANN & RAUSCHER 16 516 66×5 mm
Twister gauze sponges HARTMANN 481 274 x2
Closure strips HARTMANN 540 686 x4
Opmi Visu CS Microscope Zeiss N/a incl. fundus imaging system BIOM II
Chandelier endoillumination Geuder G-S03503 +
G-S03504		 25G incl. trocar
Light machine Geuder G-26033 Xenotron III
Vitrectomy machine Geuder G-60000 MegaTRON S4 S4/ HPS
Vitrector Geuder G-46301 MACH2 vitreous cutter 23G
Venturi cassette  Geuder G-60700
Sideport-infusion cannula Geuder custom  1x23G
3-0 silk suture ETHICON V546G x1
Caliper Geuder G-19135 x2
Vannas scissors Geuder G-19777 x1
Sclerotomie blade Ziemer 21-2301 1x23G
1x20G
7-0 silk suture ETHICON EH6162H x1
Needle holder Geuder G-32320 x2
Iris forceps Geuder G-18910 x1
Colibri forceps Geuder G-18950 x1
Extendible subretinal injection needle DORC 1270.EXT 41G
VR scissor Geuder G-36542 25G
Grieshaber forceps holder Alcon 712.00.41 23G
Curved scissor forceps tips Alcon 723.52 23G
Implant loading station Dow Corning 3097358-1004 SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit
blunt oval implant trephine  Geuder custom-made  2.4 x 1.1 mm 
Shooter dummy Geuder G-32227 x1
Shooter Geuder G-S03443 x1
Flute needle DORC 1281.SD 20G (Vacuum)
Manual microliter syringe Hamilton 24535 100µl
Tissue culture plates Greiner bio-one  664160 100 x 20 mm
Spectralis Multi-Modality
Imaging System		 Heidelberg
Engineering		 N/a Spectralis HRA
 + OCT
Drugs and solutions
Name Company Active agent Comments
Mucadont-IS Merz Hygiene virucidal instrument disinfectant  2L
Mucocit T Merz Hygiene Aldehyde-free instrument disinfectant 2L
Ketamin 10% WDT Ketamine  10ml (100mg/ml)
Domitor Orion Pharma Medetomidine hydrochloride 10ml (1mg/ml)
Antisedan Orion Pharma Atipamezole hydrochloride 10ml (5mg/ml)
Neosynephrin POS 10% URSAPHARM Phenylephrine HCl 10ml
Mydriacyl Alcon Tropicamid 10ml (5mg/ml)
Methocel 2% Omni Vision hydroxypropyl methylcellulose 10g
PURI CLEAR ZEISS Balance salt solution (BSS)  500ml
Glucose 5%   B.Braun Glucose 5%  solution 100ml
Heparin-Natrium-25 000 Ratiopharm Heparin 5ml (2500 unit/ml)
Suprarenin SANOFI Epinephrine 1ml (1mg/ml)
Triamcinolone University of Bonn pharmacy preservative-free Triamcinolone  1ml (40mg/ml) 
Isoptomax eye ointment Alcon dexamethasone 1 mg/g
neomycin sulfate 3,500 IU/g
polymyxin B sulfate 6,000 IU/g		 10ml
Betaisodona Mundipharma Povidon-Iod 30ml (1g/10ml)
Optive ALLERGAN sodium carboxymethylcellulose glycerol 10ml
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Al-Nawaiseh, S., Thieltges, F., Liu, Z., Strack, C., Brinken, R., Braun, N., Wolschendorf, M., Maminishkis, A., Eter, N., Stanzel, B. V. A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits. J. Vis. Exp. (115), e53927, doi:10.3791/53927 (2016).
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