A Passo a Passo Protocolo de Cirurgia sub-retiniana em Coelhos

Ética de movimentação de animais na investigação oftalmológica: Obtivemos a aprovação do comitê de ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Bonn, e aderir às diretrizes estabelecidas pela Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO). Além disso, todos os procedimentos foram aprovados pelas autoridades reguladoras estaduais de North Rhine-Westphalia. Os animais foram mantidos dentro de casa em um centro especializado em um quarto com ar condicionado, com temperaturas entre 18-20 ° C, a exposição à luz do dia regular, em gaiolas individuais padronizados com livre acesso a comida e água. Nota: Para garantir os animais afinidade operatório, uma folha de pontuação da saúde animal é seguido que inclui os seguintes critérios de exclusão animais definitiva: perda de peso de 20% em relação ao peso no momento da admissão; aparente cianose do animal; arrepios animais, tem cólicas ou não pode se mover em coordenação; . ataxia / parestesia, por exemplo, paralisa; apatia; mutilação extrema auto (feridas na pele, membros decepados). </ P> 1. Esterilização Instrument Coloque os instrumentos reutilizáveis ​​em banho ultra-sônico. Adicionar 500 ml de água destilada e 2 ml de instrumento desinfectante. instrumentos limpos utilizando a função de varredura por 15 min. Retirar instrumentos de banho ultra-sônico e enxaguar abundantemente com água destilada por 5 min. Insira instrumentos em autoclave e usar o programa padrão (esterilização de instrumentos sob 121 ºC durante 20 min). 2. Preparação Instrumento Estabelecer e manter um campo esterilizado, trabalhando em uma sala fechada, usando uniformes cirúrgicos, máscara e tampa do cabelo. Desinfectar as mãos antes de usar luvas cirúrgicas estéreis. Para abordagem detalhada ver 28. Coloque instrumentos esterilizados em uma cortina estéril. Coloque 1 ml cheia com 40 mg de triamcinolona ligado a uma agulha de 27 G para a injecção, seringa de 10 ml com solução de sal de Equilíbrio (BSS), e 5 ml de seringa ólubrificante f em cortina. Coloque seda 3-0, 7-0 vicryl, varas oculares (para parar a hemorragia conjuntival / escleral), esponjas de gaze twister, tiras de fechamento da ferida (para fixar o tubo de ponta vitrectomia) e fio de fibra candelabro endoillumination em um pano. Desembrulhar 25 G candelabro endoilluminator e se conectar a máquina a luz utilizando técnicas estéreis (veja o passo 2.1). Ligue set vitrectomia incluindo vitreófago alta velocidade e Venturi cassete para máquina de vitrectomia usando técnicas estéreis (veja o passo 2.1). Abrir 500 ml garrafa de BSS e ligar solução para Venturi cassete de acordo com as instruções do fabricante. 3. Preparação de Anestesia e Posicionamento do animal Pesar animal para garantir a dosagem da medicação precisa. Prepare anestesia intramuscular (IM) usando uma seringa com 27 agulha G contendo 0,35 mg / kg de ketamina e 0,25 mg / kg medetomidine para arrancar. Virar a seringa para misturar. Prepare 2 seringas com 1/3 de tque as doses para manter a anestesia durante a operação. Preparar seringa contendo 20 ml de solução de glucose a 5% e 18 g de agulhas para injecção subcutânea como uma alternativa a infusão intravenosa. Dê 3 x 1 gota de olho mydriatic cai antes de vitrectomia para a dilatação da pupila. coelho tampa com cobertor para acalmar antes da injeção de anestesia, injectar no membro posterior (músculo glúteo) e massagem em torno do local da injecção durante 30 segundos. Nota: O primeiro tiro de anestesia IM dura cerca de 1-2 horas. dependendo do tamanho do coelho, tolerância a drogas, a camada de gordura, o stress e a temperatura do corpo. O primeiro signo do anestesia desaparecendo é uma nistagmo (deve ser monitorado pelo cirurgião), injecções subsequentes duram cerca de 30 – 45 min. Confirmar a anestesia adequada, verificando hipnose, hiporreflexia, analgesia e relaxamento muscular do animal. Dê a injecção subcutânea (Pt. 3.3) na dobra da pele do pescoço, uma vez que o coelho é inconsciente. Adicionar metilClubrificante ellulose cada 5 – 10 min no olho operado, adicione lubrificante e fita tampas de olho não operado. Coloque o coelho coberto na mesa cirúrgica coberto com uma tampa, como uma manta de algodão em posição ideal (nariz ligeiramente elevada através de um molde do cobertor, por isso é nível com a superfície ocular) sob o microscópio cirúrgico. Alinhar olho perpendicular ao microscópio objetivo. Garantir a temperatura adequada núcleo do corpo usando termômetro retal (normotermia 39 ± 1 ºC) 29. cílios cortados com tesouras (alguma pomada na lâmina) para reduzir infecções pós-operatórias. Desinfectar o olho utilizando 2 – 3 gotas de 0,1 g / ml de iodo-povidona topicamente durante 1 min e lavar com BSS esterilizado. Cobrir os olhos com cortina estéril com a abertura pré- corte no meio do olho e, em seguida, cubra com (pegajosa) incisão cirúrgica cortina 12 x 17 cm. 4. A vitrectomia Proptose e olho seguro com seda 3-0 utilizando invcaliper erted e, executar uma peritomia conjuntival. Faça uma incisão na conjuntiva com uma tesoura Vannas perto de limbo, mas distante o suficiente dos vasos sanguíneos (~ 1 mm Distância). Dissecar a conjuntiva através da criação de um "T-cut". Primeiro ampliar a peritomia com a tesoura paralela ao limbo e, em seguida, uma incisão na conjuntiva verticalmente em forma de um "T" para cerca de 6 – 7 mm. Separe cuidadosamente a conjuntiva sem rodeios. Executar uma esclerotomia usando uma lâmina de 23 G microvitreoretinal (MVR) às 8 horas no olho direito / OD (04:00 em olho esquerdo / OS), inserindo cuidadosamente a ponta afiada da lâmina em direcção ao nervo óptico. Lentamente retrair a lâmina no mesmo sentido e evitar o alargamento da esclerotomia. Inserir e lateral costume sutura porta-infusão de cânula 27 com sutura de seda 7-0 e definir pressão intraocular (PIO) em 24 mmHg. Executar uma esclerotomia com 25 G cabeça chata trocar a 2 horas de OD (10 o '; Relógio no OS) semelhante ao passo 4.2. Insira 25 G lustre luz para trocar cabeça chata, fixar com fita adesiva e ligue fonte de luz a cerca de 30%. Se necessário, remova epitélio corneano edematoso usando um # 20 bisturi para melhor visualização intra-ocular. Executar uma esclerotomia semelhante ao passo 4.2 em 10 horas em OD (02:00 em OS), (pré-) lugar 7-0 suturas ao redor esclerotomia sem amarrar o nó em forma de u, e inserir vitrectomia ponta de corte. Comece vitrectomia 30 à volta da porta de entrada, em seguida, continuar ao longo do disco óptico e os medullares fibrae usando vitreófago alta velocidade, cortando o humor vítreo em pequenos pedaços no máximo. 2.000 – 3.000 cortes / min, aspirando no máximo. 200 mmHg utilizando a configuração do parâmetro declarado da máquina de vitrectomia (Tabela 1) Executar um descolamento do vítreo posterior (PVD), separando o humor vítreo da retina, segurando a vitreófago alta velocidade sobre o pólo posterior and (se possível delicadamente) superior do disco 31, enquanto a aspiração única no máximo. 200 mmHg, sem corte. Injectar cerca de 50 ul (20 mg) de triamcinolona ou fluoresceína diluído (cerca de 0,1 mg / ml) por via intravítrea de visualizar e facilitar (quase total) a remoção do vítreo que flutua sobre o pólo posterior e média periferia durante a vitrectomia. Evite cruzar sob a lente. Recuo de fazer a barba vítreo periférico por um assistente (qualificados) é recomendada se tamponamento gás é desejada. Adicionar 20 unidades / ml de heparina e 0,5 mg de epinefrina a concentração final de 0,001 mg / ml para a solução de perfusão BSS em paralelo ou após o passo 4.10. Nota: A heparina / epinefrina não são injectados intra-ocular seus efeitos são retardada dependendo da taxa do fluxo da infusão. 5. carregando Shooter Nota: O trabalho aqui descrito não cai sob os princípios da Declaração de Helsinki; não envolvia pacientes humanos. Aqui, stacélulas ndard RPE foram isolados dos olhos humanos fetais, cultivadas e diferenciadas em não revestido de poliéster de 10 mm de espessura (PET) insere de acordo com nosso protocolo publicado anteriormente 14. A permissão para trabalhar com o material fetal humano foi obtido a partir da comissão de ética da Universidade de Bonn. Alternativamente, HES-RPE foram enviados do laboratório Skottman (manuscrito, em prep.), Onde foram cultivadas de acordo com a técnica descrita por Vaajasaari et al 32.; por estas células uma permissão tenha sido obtido a partir do Instituto Koch R., Berlim, Alemanha. Lavar cultura de células antes da preparação do 3x implante com BSS grau oftálmica. Encha uma placa de cultura de células padrão (100 x 20 mm) com 10 ml BSS grau oftálmica. Adicionar a inserção de cultura de célula para o BSS e centrar o prato sob um microscópio de luz. Perfurar um implante de 2,4 x 1,1 mm, com um oval, agulha romba, feitos sob medida para obter um substrato plano, em forma de feijãocom duas arestas longas e duas bordas arredondadas. Gentilmente inundar a agulha através da segunda porta com BSS para expulsar o implante no BSS preenchido estação de carregamento feito sob medida (Figura 1). Opcionalmente cortar uma extremidade redonda do implante (<0,5 mm), apenas para se obter um terceiro bordo. Certifique-se de que o implante é na orientação correcta, assegurando que a monocamada é de cabeça sobre o transportador de células. Para alterar o posicionamento usar com cuidado dois bisturis. Empurrar o implante suavemente e completamente para dentro do instrumento atirador usando o suporte de agulha até que todo o implante é presa ao interior da ponta. O êmbolo deve permanecer retraída. Mantenha a ponta shooter "carregado" na estação de carga em BSS até o momento da implantação. 6. Implantação Aproximar retina neural com extensível 41 G agulha de injeção subretinal conectado a uma seringa estanque (garantir que as bolhas de ar foram evacuadasa partir de tubos!). Injectar BSS (com cálcio e magnésio / CM) subretinally e, assim, criar um descolamento de retina bolha (BRD) de cerca de 2-3 diâmetro do disco (DD). Dois BRD por olho pode ser elevada com segurança. Ampliar retinotomia a 1,5 mm com verticais 23 g VR-tesoura. O espaço sub-retiniano está agora acessível para implantação ou mais manobras. Estender esclerotomia (precisamente) com uma incisão faca 1,4 mm a 20 abordagem G. Tentativa passando pelo esclerotomia usando um 20 G atirador manequim, ampliar, conforme necessário para garantir a transição suave, mas confortável do atirador carregado. Passe com o atirador carregado 27 a esclerotomia idealmente a 24 mmHg. Abordagem retinotomia borda e ejetar o implante subretinally de uma posição epiretinal. Ajuste o implante com semicerrados 23 g tesouras, fórceps ou 41 G agulha para se certificar de que está bem posicionada sob o retina- razoavelmente longe da retinotomia. 7.terminando Operação Retirar 25 G candelabro e cânula de infusão. Suturar todos esclerotomias. Injecte 25 ul (10 mg) triamcinolona pelo esclerotomia 08:00 (antes da sutura passado esclerotomia). Verifique / ajuste IOP por palpação e injetar BSS através de 30 agulha G / seringa, se necessário. conjuntiva sutura com 7-0 vicryl. Remover proptosing 3-0 estilingue seda lentamente (Evite plexo venoso orbital profunda!). Adicionar dexametasona / pomada antibiótica sob tampa. Posição durante 1 h coberto com o cobertor com olho operado voltado para cima (w / o de gás), ou para baixo (com ar / gás). Não deixe animais sem vigilância até que ele recupera a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não transporte de coelho antes da anestesia desaparece completamente, isso pode ser acelerado através da injeção de medetomidine agente igual revertendo a uma quantia de medetomidine dado. 8. Pós-operatório Animal Care Guardacoelhos em condições adequadas (temperatura, luz, comida, água, espaço, etc.) e um acompanhamento rigoroso em um centro especializado. Certifique-se que animal está bem descansado, ie., Há longos períodos de alimentos ou a privação de água. Procure por quaisquer ferimentos ou lesões, especialmente em locais de injecção. Mantenha feridas seco para evitar infecções. Dê antibióticos quando há suspeita de infecção: dexametasona a 1 mg / g, neomicina sulfato de 3.500 Ul / g, sulfato de polimixina B 6000 UI / g unguento foi aplicado duas vezes por dia durante 1 semana pós-operatória sobre a superfície ocular. Adicionar dexametasona / pomada antibiótica para o próximo 7 dias de pós-operatório duas vezes por dia para uma melhor regeneração da superfície ocular e dor pós-operatória reduzida. Dê analgésicos sistémicos (Carprofene 4 mg / kg duas vezes por dia) durante 48 h inicial. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva um animal quefoi submetido a uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. Não expor animais a sofrimento desnecessário. 9. SLO / SD-OCT Orientação Preparar e injetar intramuscular (IM) a anestesia utilizando uma seringa com 27 G agulha contendo 0,175 mg / kg de ketamina e 0,125 mg / kg medetomidine para arrancar. Virar a seringa para misturar. Adicionar um lubrificante pelo menos a cada 5 minutos para hidratar os olhos e manter-SD outubro de imagem clara, opcionalmente, pode ser utilizada uma lente de contacto personalizado. Anexar uma plataforma de aço para o encosto de cabeça para estabilizar o animal na posição desejada. Coloque coelho na plataforma de aço, colocando seu olho perpendicular à sonda. Segure a cabeça do coelho do osso da bochecha inferior (mandíbula), evitando a traqueia. inclinação da cabeça do animal em cerca de 45º para o SD-OCT sonda para otimizar o ângulo de visão sobre o implante. Use uma lente de 30 graus e os seguintes parâmetros para optimal outubro de imagem [HS]: 30 graus configurações para uma única linha verifica com o modo ART definido para 100 (média) e 20 x 20 configurações de graduação para verificações de volume com o modo ART definido para 15; o modo de alta resolução não é necessária. Use SLO imagiologia reflectância de infravermelhos para encontrar o plano focal do implante (Fig. 2A); foco ideal é alcançado quando (todas) as bordas do implante são nítidas 14. Adicionar dexametasona 1 mg / g, neomicina sulfato de 3.500 UI / g, B sulfato de polimixina 6.000 UI / g pomada em tampa quando terminar.