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Medicine

Eine Schritt für Schritt-Protokoll für Subretinale Chirurgie in Kaninchen

Published: September 13, 2016
doi:
10.3791/53927
, , , , , , , , ,
1Department of Ophthalmology,University of Bonn, 2Department of Ophthalmology,National University of Singapore, 3Geuder AG, 4Department of Ophthalmology,University of Münster, 5Section on Epithelial and Retinal Physiology and Disease,National Eye Institute/National Institutes of Health, 6Surgical Retina Department,Singapore National Eye Centre

Summary

Retinalen Pigmentepithel (RPE) Ersatzstrategien und Gen-Therapie für mehrere degenerativen Retina Bedingungen betrachtet. Für die klinische Übersetzung werden große Auge Tiermodellen erforderliche chirurgische Techniken anwendbar bei Patienten zu untersuchen. Hier präsentieren wir eine Kaninchenmodell für subretinalen Chirurgie zu RPE-Transplantation ausgerichtet, die vielseitig und kosteneffizient ist.

Abstract

Die altersbedingte Makula-Degeneration (AMD), Retinitis pigmentosa und andere RPE bedingte Krankheiten sind die häufigsten Ursachen für irreversible Erblindung bei Erwachsenen in industriell entwickelten Ländern. RPE-Transplantation scheint eine vielversprechende Therapie sein, da es dysfunktionalen RPE ersetzen kann, seine Funktion wiederherstellen und dadurch Vision.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung einer gezüchteten RPE-Monoschicht auf einem Gerüst in den subretinalen Raum (SRS) von Kaninchen Umpflanzen. eine maßgeschneiderte Shooter, bestehend aus einem 20-Gauge metallischen Düse mit einem Polytetrafluorethylen (PTFE) beschichteten Kolben Nach Vitrektomie Xenotransplantate wurden in die SRS geliefert. Die aktuelle Technik entwickelte sich in mehr als 150 Kaninchen Operationen über 6 Jahre. Postoperative Nachsorge kann unter Verwendung von nicht-invasive und repetitive in – vivo – Bildgebung , wie beispielsweise spektralen Bereich der optischen Kohärenztomographie (SD-OCT) durch Perfusion fest Histologie folgen erhalten.

the Verfahren hat gut definierte Schritte für einfaches Lernen und eine hohe Erfolgsquote. Kaninchen sind ein großes Auge Tiermodell nützlich in präklinischen Studien für die klinische Übersetzung berücksichtigt. In diesem Zusammenhang Kaninchen sind eine kostengünstige und vielleicht bequeme Alternative zu anderen großen Auge Tiermodellen.

Introduction

Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist die häufigste Ursache für Sehbehinderung bei Erwachsenen im Alter von 50 oder älter in industriell entwickelten Ländern, wie sie Verlust des zentralen Sehvermögens führt. Etwa 15% dieser Patienten leiden an der "feuchten" Form der Erkrankung, bei der Neovaskularisation von der Aderhaut stammt und stört die Funktion der Retina 1. Diese Variante kann durch eine hochwirksame Therapie mit wiederholten intra vitrealen Injektionen von anti – angiogenen Medikamenten 2 behandelt werden. Doch die überwiegende Mehrheit der Patienten (~ 85%) leiden an der trockenen Form, die durch extrazelluläre Ablagerungen (zB Drusen) unter dem retinalen Pigmentepithel (RPE) gekennzeichnet ist. Diese Ablagerungen verursachen RPE Dysfunktion Retinaatrophie in der Makula führen. Da der Mangel an kurativen Therapieoptionen, entwickelte sich AMD in ein intensiv Forschungsbereich entwickelt werden, wo viele verschiedene Heil therapeutische Ansätze erprobt. Chirurgische RPE Ersatzeine attraktive Zukunft Möglichkeit , diese lähmende Krankheit 3 zu besiegen.

Autologe subretinalen RPE – Transplantation ersetzt dysfunktionalen oder RPE in Macula verloren und hat das Potential , dessen physiologische Funktion 4-9 wiederherzustellen. Diese chirurgische Technik hatte einen Durchbruch bei der Entwicklung von RPE Differenzierungsprotokolle aus humanen embryonalen Stammzellen (hES) und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS), der Wissenschaftler eine unbegrenzte Zellquelle von RPE für die Transplantation 10 geben. RPE-Transplantation wird nun als attraktive First-in-Human-Anwendung für die Stammzell abgeleitet Therapeutika anerkannt. Das Auge bietet ausgezeichnete chirurgische Zugang und anspruchsvolle In – vivo – Monitoring – Tools 13.11.

Um die RPE verpflanzen, ist eine Möglichkeit, mit einem minimal-invasive Lieferung einer Zellsuspension mit alternativ zu einer besseren RPE Eigenschaften und Transplantatfunktion, künstlichem Träger substr bewahrenAtes (Gerüsten) für die RPE Ersatz betrachtet 4,14,15 werden. Große Tiermodelle sind für die präklinische Validierung erforderlich, noch detaillierte technische Informationen über die Behandlung der Tiere und chirurgische Technik auf dem neuesten Stand 16-23 fehlt.

Wir und andere 11,24 trotz einiger gegenteiliger Beweise 25, schlagen die Verwendung eines starren noch elastischen Trägersubstrat , wie es sicherer Handhabung bietet, erhält einschichtigen Integrität und Funktionalität. Im Laufe der Zeit haben wir mehrere anwendungsspezifische Instrumente und Zusatz Techniken zur Implantation von zell Träger RPE-Transplantation in den subretinalen Raum (SRS) getestet. Wir nutzten die intraoperative Videoaufnahmen, in vivo Scanning – Laser – Ophthalmoskopie mit spektralen Bereich der optischen Kohärenztomographie kombiniert (SLO / SD-OCT) und Histologie die Implantation Erfolg 14,26,27 zu bewerten. Hier bieten wir unseren aktuellen Empfehlung für subretinaler Implantate RPE in Kaninchen,die in 5 verschiedenen Kaninchen-Stämme, 7-Zellträgermaterialien und 4 RPE Zellquellen in über 150 Verfahren getestet.

Protocol

Ethik der Behandlung der Tiere in der Augenforschung: Wir erhielten die Zustimmung der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät, Universität Bonn, und sich an die von der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Leitlinien übereinstimmt. Darüber hinaus sind alle Verfahren wurden von den staatlichen Regulierungsbehörden des Landes Nordrhein-Westfalen genehmigt. 20 ° C, Kontakt mit regelmäßigen Tageslicht, in standardisierten Einzelkäfigen mit freiem Zugang zu Futter und Wasser – Tiere wurden drinnen in einer spezialisierten Einrichtung in einem klimatisierten Raum mit einer Temperatur von 18 gehalten. Hinweis: Um die Tiere operative Affinität zu gewährleisten, eine Tiergesundheit Notenblatt folgt, welches die folgenden endgültigen Tier Ausschlusskriterien enthält: 20% Gewichtsverlust im Vergleich zum Gewicht auf die Zulassung; offensichtlich Zyanose des Tieres; Tier zittert, hat Krämpfe oder kann nicht in Koordination bewegen; . Ataxie / Parästhesien, zB Lähmungen; Apathie; extreme Selbstverstümmelung (Hautwunden, abgeschlagenen Gliedmaßen). </ P> 1. Instrumentensterilisation Legen Sie wiederverwendbare Instrumente in Ultraschallbad. In 500 ml destilliertem Wasser und 2 ml Instrument Desinfektionsmittel. Saubere Instrumente Sweep-Funktion für 15 min mit. Entfernen Sie Instrumente aus Ultraschallbad und gründlich destilliertes Wasser für 5 min mit. Legen Sie Instrumente in Autoklaven und verwenden Sie das Standardprogramm (Sterilisation von Instrumenten unter 121 ° C für 20 min). 2. Instrumentenaufbereitung Erstellung und Einführung eines sterilen Bereich aufrechtzuerhalten, indem sie in einem geschlossenen Raum arbeiten, mit dem OP-Peelings, Maske und Haarabdeckung. Desinfizieren der Hände vor dem sterilen OP-Handschuhe zu tragen. Ausführliche Ansatz siehe 28. Legen Sie sterilisierten Instrumente auf einem sterilen Tuch. Platzieren 1 ml Spritze mit 40 mg Triamcinolon gefüllt an einer 27 G Nadel für die Injektion 10 ml-Spritze mit Gleichgewicht Salzlösung (BSS) und 5 ml Spritze of Schmiermittel auf drapieren. Legen Sie 3-0 Seide, 7-0 Vicryl, Augen-Sticks, Twister Gazeschwämme, Wundverschlussstreifen (zu konjunktivalen / scleral Blutung zu stoppen) (die Vitrektomie Spitzenschlauch zu fixieren) und Kronleuchter endoillumination Faser Draht auf einem Tuch. Auszupacken 25 G Kronleuchter Endoilluminator und eine Verbindung zum Licht Maschine mit sterilen Techniken (siehe Schritt 2.1). Schließen Sie Vitrektomie Set mit hoher Geschwindigkeit vitrector und Venturi-Kassette zu Vitrektomie Maschine unter Verwendung von sterilen Techniken (siehe Schritt 2.1). Öffnen Sie 500 ml BSS Flasche und schließen Lösung Venturi Kassette nach den Anweisungen des Herstellers. 3. Herstellung von Anästhesie und Lagerung des Tier Wiegen Tier, um eine genaue Dosierung der Medikamente zu gewährleisten. Bereiten Sie die intramuskuläre (IM) Anästhesie mit 1 Spritze mit 27 G-Nadel 0,35 mg / kg Ketamin und 0,25 mg / kg Medetomidin für Start enthält. Drehen Sie die Spritze zu mischen. Bereiten Sie zwei Spritzen mit 1/3 ter dosiert die Anästhesie während des Betriebs aufrecht zu erhalten. Bereiten Spritze 20 ml einer 5% igen Glucoselösung und 18 G Nadel zur subkutanen Injektion als intravenöse Infusion alternative enthält. Geben Sie 3 x 1 Tropfen mydriatic Auge zu Vitrektomie für Pupillenerweiterung vor abfällt. Abdeckung Kaninchen mit Decke vor der Anästhesie Injektion injizieren im Hinterbein (Gesäßmuskel) und Massage um Injektionsstelle für 30 Sekunden zu beruhigen. Hinweis: Der erste Schuss von IM Narkose dauert etwa 1 bis 2 h. Je nach Größe des Kaninchens, Drogentoleranz, Fettschicht, Stress und Körpertemperatur. Das erste Zeichen der Anästhesie Fading entfernt ist ein Nystagmus, nachfolgende Injektionen letzten etwa 30 (muss vom Operateur überwacht werden) – 45 min. Bestätigen Sie die richtige Anästhesie, durch die Überprüfung der Hypnose, Hyporeflexie, Analgesie und Muskelrelaxation des Tieres. Geben Sie subkutane Injektion (Pt. 3.3) in Hals Hautfalte, wenn das Kaninchen bewusstlos ist. In methylcellulose Schmiermittel alle 5 – 10 min in operierte Auge, Schmiermittel und Band Deckel in nicht-operierten Auge hinzuzufügen. Legen Sie das bedeckte Kaninchen auf dem OP-Tisch drapiert mit einer Abdeckung wie ein Baumwolltuch in einer optimalen Position (Nase leicht durch eine Form der Decke angehoben, so dass er auf gleicher Höhe mit der Augenoberfläche) unter Operationsmikroskop. Richten Auge senkrecht Ziel Mikroskop. Stellen Sie sicher , die richtige Körperkerntemperatur mit Rektalthermometers (Normothermie 39 ± 1 ° C) 29. Cut Wimpern Schere (etwas Salbe auf der Klinge) unter Verwendung von postoperativen Infektionen zu reduzieren. Desinfizieren Sie das Auge mit 2 – 3 Tropfen von 0,1 g / ml PVP-Jod topisch für 1 min und Spülen mit steriler BSS. Bedecken Auge mit sterilen Tuch mit vorgeschnittenen Öffnung in der Mitte für das Auge und dann die Abdeckung mit (klebrig) chirurgischen Einschnitt drapieren 12 x 17 cm. 4. Vitrektomie Proptose und sicheres Auge mit 3-0 Seide inv miterted Sattels und führen Sie eine konjunktivale Peritomie. Inzision der Bindehaut mit einem Vannas Scheren der Nähe von Limbus, aber weit genug von den Blutgefäßen (~ 1 mm Abstand). Präparieren Sie die Bindehaut ein "T-cut" durch die Schaffung von. Erste vergrößern die Peritomie mit der Schere parallel zu Limbus und dann die Bindehaut einzuschneiden vertikal in Form eines "T" für ca. 6 – 7 mm. Trennen Sie vorsichtig unverblümt die Bindehaut. Führen Sie eine Sclerotomie eine 23 G microvitreoretinal (MVR) Klinge um 8 Uhr auf dem rechten Auge / OD (4 Uhr am linken Auge / OS) unter Verwendung von sorgfältig die scharfe Spitze der Klinge in Richtung auf den Sehnerv einsetzen. einfahren langsam die Klinge in die gleiche Richtung und vermeidet die Sklerotomie vergrößern. Stecken und Naht benutzerdefinierte Seitenanschluss-Infusionskanüle 27 mit 7-0 Seidennaht und stellen Sie den intraokularen Druck (IOP) bei 24 mmHg. Führen Sie eine Sclerotomie mit 25 G flachen Kopf Trokar um 2 Uhr auf OD (10 o '; Uhr auf OS) ähnlich 4.2 zu treten. Legen Sie 25 G Kronleuchter Licht in flachen Kopf Trokar, fixiert mit Klebeband an und schalten Sie Lichtquelle bei ca. 30%. Bei Bedarf entfernen edematous Hornhautepithel ein # 20 Skalpell für eine bessere intraokularen Visualisierung. Führen Sie eine Sclerotomie ähnlich 4.2 um 10 Uhr auf OD zu Schritt (2 Uhr am OS), (Vor-) Ort u-förmigen 7-0 Nähte um Sclerotomie ohne den Knoten zu binden, und legen Sie die Vitrektomie Cutter Spitze. Starten 30 Vitrektomie um die Eintrittsöffnung, dann weiter über die Papille und die fibrae medullares mit hoher Geschwindigkeit vitrector durch den Glaskörper in kleine Stücke schneiden bei max. 2.000 – 3.000 Schnitte / min, bei max Absaugen. 200 mmHg mit der angegebenen Parameter Aufbau der Vitrektomie – Maschine (Tabelle 1) Führen Sie eine hintere Glaskörperabhebung (PVD) durch den Glaskörper von der Netzhaut trennt durch die hohe Geschwindigkeit vitrector über den hinteren Pol eine Holdingnd (wenn möglich sanft) überlegen der Scheibe 31 , während nur bei max Absaugen. 200 mmHg ohne Schneiden. Injizieren ca. 50 & mgr; l (20 mg) Triamcinolon oder verdünnten Fluorescein (ca. 0,1 mg / ml) intravitreal zu visualisieren und zu erleichtern (in der Nähe von total) Entfernen des schwimmenden Glaskörper über den hinteren Pol und mittleren Peripherie während der Vitrektomie. Vermeiden Sie unter der Linse überqueren. Einrückungen peripheren glasig zu rasieren durch einen (Fach-) Assistent wird empfohlen, wenn Gastamponade gewünscht wird. Geben Sie 20 Einheiten / ml Heparin und 0,5 mg Epinephrin zur Endkonzentration von 0,001 mg / ml in die BSS Infusionslösung in parallel oder nach dem Schritt 4.10. Hinweis: Da Heparin / Epinephrin nicht intraokulare injiziert werden ihre Wirkung verzögert werden je nach Infusionsdurchflußrate. 5. Laden Shooter Hinweis: Die hierin beschriebene Arbeit nicht unter den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki fällt; es waren nicht mit menschlichen Patienten. Hier standard RPE – Zellen wurden von fötalen menschlichen Augen isoliert, kultiviert und differenziert auf unbeschichteten 10 um dicke Polyester (PET) fügt gemäß unserer früher veröffentlichten Protokoll 14. Eine Berechtigung mit dem menschlichen fetalen Material zu arbeiten wurde von der Ethikkommission der Universität Bonn erhalten. Alternativ hES-RPE wurden aus dem Skottman lab (Manuskript in Vorbereitung.) Geliefert, wo sie nach der Technik von Vaajasaari et al beschrieben kultiviert wurden . 32; für diese Zellen eine Genehmigung wurde von der R.-Koch-Institut, Berlin, Deutschland, erhalten. Spülen der Zellkultur vor der Herstellung des Implantats 3x mit Augen Klasse BSS. Füllen Sie eine Standard-Zellkulturschale (100 x 20 mm) mit 10 ml Augen Klasse BSS. Fügen Sie den Zellkultureinsatz in das BSS und in der Mitte der Schale unter einem Lichtmikroskop. Punch-Out ein 2,4 x 1,1 mm Implantat mit einem stumpfen, oval, maßgeschneiderte Nadel eine flache, bohnenförmige Substrat zu erhaltenmit zwei langen Kanten und zwei runden Kanten. Fluten vorsichtig die Nadel durch die zweite Öffnung mit BSS des Implantats in das BSS gefüllt zu spülen , nach Maß Ladestation (Abbildung 1). schneiden Optional eine Runde Ende des Implantats (<0,5 mm), um nur dritte Kante zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass das Implantat in der richtigen Orientierung ist, indem sichergestellt wird, dass die Monoschicht auf der Zellträger Kopf ist. So ändern Sie sorgfältig zwei Skalpelle Positionierung verwenden. Schieben das Implantat sanft und vollständig in den Schützen Instrument unter Verwendung des Nadelhalters, bis das gesamte Implantat innerhalb der Spitze befestigt ist. Der Kolben sollte zurückgezogen bleiben. Halten Sie die "geladen" Shooter Spitze in Ladestation unter BSS bis zum Zeitpunkt der Implantation. 6. Implantierung Nähern Sie sich neuronale Netzhaut mit ausfahrbaren 41 G subretinalen Injektionsnadel gas Spritze verbunden (sicherzustellen, dass alle Luftblasen wurden evakuiertvon Leitungen!). Injizieren BSS (mit Calcium und Magnesium / CM) subretinal und dadurch eine Bleb Netzhautablösung (brd) erstellen von etwa 2 – 3 Disc-Durchmesser (DD). Zwei brd pro Auge kann sicher angehoben werden. Vergrößern Retinotomie bis 1,5 mm mit einer vertikalen 23 G VR-Schere. Der subretinalen Raum ist nun für die Implantation oder weitere Manövrieren. Extend Sclerotomie (genau) mit einem 1,4 mm Schneidmesser bis 20 G-Ansatz. Der Versuch, durch die Sclerotomie Gabe eines 20 G-Shooter Dummy verwenden, vergrößern bei Bedarf glatt, noch eng Übergang des geladenen Shooter zu gewährleisten. Fahren Sie mit dem geladenen Shooter 27 bis Sclerotomie idealerweise bei 24 mmHg. Ansatz Retinotomie Rand und Auswerfen des Implantats subretinal aus epiretinales Position. Stellen Sie das Implantat mit halbgeschlossenen 23 G Scheren, Pinzetten oder 41 G-Nadel sicherzustellen, dass es von der Retinotomie maßen gut weg unter dem retina- positioniert ist. 7.Außerbetrieb Entfernen Sie 25 G-Kronleuchter und Infusionskanüle. Suture alle Sklerotomien. Injizieren von 25 ul (10 mg) Triamcinolon durch den 8.00 Uhr Sklerotomie (vor dem Vernähen letzten Sklerotomie). Prüfen / einstellen IOP durch Palpation und injizieren BSS über 30 G-Nadel / Spritze, wenn nötig. Suture Bindehaut mit 7-0 Vicryl. Entfernen proptosing 3-0 Seide Schlinge langsam (tief orbitalen Venenplexus vermeiden!). In Dexamethason / antibiotische Salbe unter dem Deckel. Position für 1 Stunde mit Decke bedeckt mit operierten Auge nach oben (w / o Gas) oder nach unten (mit Luft / Gas). Lassen Sie keine Tier unbeaufsichtigt, bis es genügend Bewusstsein wiedererlangt sternal recumbence aufrecht zu erhalten. Nicht Kaninchen transportieren, bevor die Betäubung vollständig verblasst, kann dies durch Medetomidin Mittel Umkehren Injizieren beschleunigt werden gleich gegeben von Medetomidin betragen. 8. Post-operative Animal Care BehaltenKaninchen unter geeigneten Bedingungen (Temperatur, Licht, Nahrung, Wasser, Raum, etc.) und eine ständige Überwachung in einer spezialisierten Einrichtung. Stellen Sie sicher , dass Tier gut ausgeruht, dh., Keine längere Zeiträume von Lebensmitteln oder Wasserentzug. Achten Sie auf Wunden oder Verletzungen, vor allem an der Injektionsstelle. Halten Wunden trocken Infektionen zu verhindern. Geben Sie Antibiotika, wenn Verdacht auf eine Infektion: Dexamethason 1 mg / g, Neomycin-Sulfat 3.500 IE / g, Polymyxin B-Sulfat 6.000 IE / g Salbe aufgetragen wurde zweimal täglich für 1 Woche postoperativ auf der Augenoberfläche. In Dexamethason / antibiotische Salbe zur postoperativen nächsten 7 Tage zweimal täglich für eine bessere Augenoberfläche Regeneration und reduziert postoperative Schmerzen. Geben systemische Analgetika (Carprofene 4 mg / kg zweimal täglich) für die erste 48 Stunden. Verwenden Sie kein Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten sternal recumbence wiedergewonnen hat. Verwenden Sie kein Tier zurückgeben,Chirurgie an der Gesellschaft von anderen Tieren unterzogen, bis sie vollständig erholt hat. Setzen Sie Tiere unnötige Ängste. 9. SLO / SD-OCT Guidance intramuskuläre (IM) Anästhesie mit 1 Spritze mit 27 G-Nadel enthält 0,175 mg / kg Ketamin und 0,125 mg / kg Medetomidin für den Start vorbereiten und injizieren. Drehen Sie die Spritze zu mischen. Fügen Sie ein Schmiermittel mindestens alle 5 min Auge zu befeuchten und klare SD-OCT-Bildgebung halten, gegebenenfalls eine benutzerdefinierte Kontaktlinse verwendet werden. Bringen Sie eine Stahlplattform an der Kopfstütze des Tieres in die gewünschte Position zu stabilisieren. Legen Sie Kaninchen auf Stahlplattform, platzieren ihre Auge senkrecht zur Sonde. Halten Sie den Kopf des Kaninchens aus der unteren Wangenknochen (Mandibula) Vermeidung der Luftröhre. Tilt Tierkopf um etwa 45 ° in Richtung der SD-OCT-Sonde den Blickwinkel auf das Implantat zu optimieren. Verwenden Sie einen 30-Grad-Objektiv und die folgenden Parameter für optimal OCT-Bildgebung [HS]: 30 Grad Einstellungen für einzelne Zeile scannt mit ART-Modus auf 100 (Mittelung) eingestellt und 20 x 20 Grad Einstellungen für Lautstärke-Scans mit ART-Modus auf 15 festgelegt; Hochauflösungsmodus ist nicht erforderlich. Verwenden SLO Infrarotreflexionsabbildungs ​​der Brennebene des Implantats (Fig . 2A) zu finden; optimale Schärfe ist erreicht , wenn (alle) sind die Implantatkanten scharf 14. In Dexamethason 1 mg / g, Neomycin-Sulfat 3.500 IE / g, Polymyxin B-Sulfat 6.000 IE / g Salbe unter dem Deckel, wenn Sie fertig.

Representative Results

Die Ergebnisse aus dem beschriebenen Verfahren zur subretinalen Implantation sind in Tabelle 2 gezeigt Engraftment unter der Netzhaut eine Erfolgsquote von ca. 61% hatte , als ein Kern – Vitrektomie durchgeführt wurde , und stieg bis zu 76%, wenn hintere Glaskörperabhebung induziert wurde. Diese Zahlen umfassen 21% der Tiere ca. die entweder intraoperativ oder starben in den ersten drei postoperativen Tage. Diese Technik kann verwendet werden, um zwei Gerüste auf verschiedenen Netzhautbereiche gleichzeitig in einem Auge zu implantieren. Die Kaninchen unterzog sich Operation in vivo Follow – up mit SD-OCT und histologische Verarbeitung wie von Stanzel et al. 27 (Abbildung 2). Abb. 2A zeigt Laserrasterophthalmoskop Infrarot – Reflexionsbild von implantierten kultivierten RPE auf einem Polyester – Membran (PET) nach einer unkomplizierten Transplantation. DasHalo um Implantat entspricht Atrophie Photorezeptor. Abb. 2B zeigt entsprechende SD-OCT, Retinal Ankündigung, vor allem Kernschicht (ONL) Verdünnung, hyper reflektierende Band auf SD-OCT über Implantat äußere, während das neuronale Netzhaut an das Implantat angrenzenden zeigt nahezu normale Reflexionsbänder. Diese Ergebnisse legen nahe , eine atraumatische Lieferung. Abb. 2C zeigt Hematoxiline / Eosin (H / E) Fleck des Implantats , die subretinalen Narben und ONL Atrophie um die Retinotomie Website , wahrscheinlich als Folge einer iatrogenen Manipulation zeigt, eine zusammenhängende noch unregelmäßig pigmentierte Schicht über PET. Bruch-Membran unter dem Implantat erschien auch zusammenhängend sein, und die Choriokapillaris enthält einige verstreute Erythrozyten. Diese morphologischen Ergebnis sind vergleichbar mit der SD-OCT und stärken die These von einer atraumatischen Lieferung. Feige ure 1: Laden Shooter mit menschlichen iPS-RPE Cultured auf PET – Zellträger. A) zeigt Stanzen ein Implantat aus maßgeschneiderte Nadel. B) bohnenförmige Implantat geschnitten aus der Zellkultur. C) Positionierung des Implantats vor dem Laden. D) Laden von Shooter mit Implantat. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen . Abbildung 2: Kultivierte menschliche hES-RPE auf PET – Zellträger 4 Wochen in Kaninchen subretinalen Raum. A) zeigt SLO Infrarot – Reflexionsbild, die grüne Linie abgrenzt den Querschnitt in Fig. 2B. B) entsprechende SD-OCT. C) H / E – Färbung, siehe Text oder 26,27 für weitere Einzelheiten.ove.com/files/ftp_upload/53927/53927fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Parameter Gebrauchte Einstellungen Vitrektomie 6000 Schnitte / min Vakuum 200 mmHg Die Anstiegszeit 1 Sek Luft 24 mmHg Bewässerung 24 cm H 2 O DiathErmy 30% Tabelle 1: Parameter Setup der Vitrektomie – Maschine. Vitrektomie Implantieren Kaninchen betrieben Erfolgreiche Implantat fehlgeschlagen Implantat Tod Erfolgsrate% Core-Vitrektomie HAUSTIER 30 19 4 7 63.33 PET + RPE 70 42 12 16 60 PVD, ± Plasmin w / PPV HAUSTIER 28 21 2 5 75 PET + RPE 22 17 2 3 77,27 Tabelle 2: Zusammenfassung der letzten 150 Operationen , einschließlich Verfahren und Implantattyp.

Discussion

Unter Verwendung eines Kaninchen-Modell, ein sicheres und reproduzierbares Verfahren zur transvitreal Lieferung von kultivierten RPE auf Zellträgern in den subretinalen Raum präsentiert mit einem speziell entwickelten Shooter Instrument. Das beschriebene Verfahren bietet eine kurze / optimierte OP-Technik für einfaches Lernen, wie es Standardtechniken in Vitrektomie mit subretinalen Manöver beinhaltet. Ergebnis wird durch eine saubere vitreoretinalen Schnittstelle und intraokulare Infusion, die Fluidturbulenz über der Implantationsstelle vermeidet, Induzieren Bleb Netzhautablösung (brd) bei niedrigen IOP, verhindert Netzhaut und Sklera Schäden durch Trockenheit und entsprechende Positionierung des Kaninchens erheblich erleichtert.

Wir warnen jedoch, wie mehrere intraoperative Komplikationen jederzeit auftreten kann, um den Erfolg der Implantation zu behindern, zum Beispiel Intraokularlinse Blutungen, Anästhesie während wichtige Schritte wie die Implantation Fading off, kollabiert der brd aufgrund von Instrumenten Manipulation oder Augen Bulbushypotonie, rabbit Tod durch zu hohe Dosen von Anästhesie, niedriger Blutdruck während der langen Operation verursacht hypoxischen Hirnschäden oder Hyperthermie. Und doch sind diese Komplikationen mit der Zeit abnehmen, da sie schnell in Angriff genommen und gelöst werden durch die Erfahrung des OP-Teams zu erhöhen.

Einige Komplikationen könnten indem Sie ein paar einfache, aber entscheidende Schritte reduziert werden. 10 min Hornhaut, Lederhaut und Bindehaut-Schäden während des Betriebs zu verhindern, und eine klare intraokulare Medien zu erhalten, da getrocknet / geschwärzt Lederhaut eine Ursache für Wunddehiszenz sein kann, was wiederum zu Augen Bulbushypotonie führt und – Schmiermittel sollte alle 5 hinzugefügt werden / oder intraoperative Leckage aus Sklerotomien. Heparin sollte die Bildung eines Fibrin – Films zu verhindern hinzugefügt werden , die besonders subretinalen Implantation anspruchs macht und gleichzeitig Zugabe Epinephrin Blutungen unter 16 Heparin zu reduzieren. Zu lange Heparin / Epinephrin Belichtungszeiten (> 1 Stunde) der Cornea ede zu verhindern, vermieden werdenma durch endotheliale Dekompensation 33, hypertensive Krise oder intraoperative Verhängnis. Sorgfältige glasigen Entfernung sollte Instrument (Entry) Port ausgeführt werden Retinal und / oder choroidalen Ablösungen zu vermeiden. Intraokulare Instrumente sollten in Richtung hinteren Pol hingewiesen werden, Linse touch (verursacht iatrogenic Kataraktbildung) oder (Eintrittsstelle) Netzhautschäden zu vermeiden. Intraokulare Seitenport-Infusionskanüle verwendet werden sollte, da es den Strahlstrom um den Implantationsbereich dämpft, wodurch unkontrolliertes Einreißen des Retinotomie verhindern und Zusammenbruch der brd. brd Induktion in der Mittellinie (vertikale Achse von Sehnerv) oder in der Nähe Optik medullären Fasern sollten umfangreiche iatrogenic Netzhautablösungen vermieden werden, um zu verhindern. Schließlich nicht zuletzt brd sollten bei niedrigen IOP induziert werden, subretinalen BSS Injektion unter Verwendung unzulässig hohe Strömungsgeschwindigkeiten zu vermeiden , die zu einer Netzhautschäden führen kann (z. B. durch Strecken).

Viele Studie Variablen wie Zelle carrier Varianten, fötale, Erwachsenen oder Stammzellen abgeleitet RPE Zellquellen, Entscheidungen für Immunsuppressiva, usw., können 14,26,27,34 erkundet werden. Eine weitere Verbesserung wie Serum-freien RPE Kulturverfahren, Charakterisierung von xenoRPE in subretinalen Raum, die Entfernung von der Host – RPE – Schicht 14 oder Strategien für die Implantatverankerung sind aktuelle Arbeiten im Gange.

Bis heute wurden die beschriebenen Techniken auf 5 verschiedenen Kaninchen-Stämmen verwendet, einschließlich Chinchilla Bastard, Chinchilla Bastard / KBL-Hybriden, Neuseeland Weiß / Rotes Kreuz, New Zealand White (Albino) und niederländischen gegurtete. Sowohl männliche als auch weibliche Kaninchen wurden operiert, mit Kaninchen mindestens 1,5 kg oder 2 Monaten (je nach Art). Die meisten Operationen waren auf pigmentierte Kaninchen (Chinchilla Bastard oder Chinchilla Bastard Hybriden) mit Gewichten zwischen 2,5 bis 3 kg.

Alle der Kaninchen-Stämme hatten wir die Gelegenheit haben, mit zu arbeiten scheinen einige Besonderheiten zu haben. In Anbetracht der exclusive Verfügbarkeit von pigmentierten Kaninchen des Chinchilla Bastard Stamm in Deutschland in 2009-13, haben wir die meiste Erfahrung mit diesen Tieren gesammelt. Leider ist es nicht mehr zur Verfügung, da Zucht ist nicht mehr, aber sehr gut im Vergleich zu New Zealand White / Rotes Kreuz mit Ausnahme der vorteilhaftere dicker Lederhaut und größere Augenvolumina in den letzteren. Chinchilla Bastard-Hybriden haben erhebliche intraoperativen Fibrinbildung und erfordern Heparin / Epinephrin Verwendung wie oben beschrieben erfolgreich subretinalen Manöver zu gewährleisten. Dieses Protokoll wurde auch bei nicht pigmentierten Albino-Kaninchen (New Zealand White), aber vor allem brd Schaffung und subretinalen Implantation ist eine größere Herausforderung gegeben reduzierten Kontrastwertschätzung durchgeführt wurde. Die Machbarkeit eines hinteren Glaskörperabhebung induziert nicht Kaninchen Belastung abhängig in unseren Händen zu sein scheinen.

Transvitreal subretinalen Lieferung dürfte die künftige operative Strategie der Wahl gegeben es ist die comm heute klinisch auf dem Weg auf die Netzhaut zu gelangen. Als Folge haben viele andere Gruppen, Techniken für kultivierten RPE präsentiert auf dem Träger in der Tier Arbeit 11,15,23,35 unterstützt. Aramant et al. 36 haben , ein Instrument, das eher Orten als schiebt ihre Hydrogel verkapselt weichen Implantat in seine subretinalen Zielstelle. Das Design von Thumann et al. Verwendet einen hohlen Spatel, der löst den trägergestützten Transplantat durch Ausschalten durch Fluidinjektion 19 schwimmt. Beide früheren Strategien erfordern subretinalen Einführen des Instruments, die aus unserer Sicht anfälliger für Komplikationen ist, wenn sie einem epiretinal appositioned Instrument verglichen. Montezuma et al. 22 beschrieben ein subretinalen Einführungsinstrument für die Lieferung von subretinalen Chip – Implantate bei Schweinen aber keine weiteren Arbeiten ist seitdem auf bestem Wissen veröffentlicht. Wir waren in der Lage, die beschriebene Technik mit einigen Änderungen zu Schwein zu verlängern.

jove_content "> Unsere bevorzugten Zellträger sind 10 Mikrometer dicke Polyester-Terephthalat (PET) Membranen. Aus einer chirurgischen Sicht dieses Material günstig Steifigkeit und Elastizität Parameter hat, zusätzlich zu seiner breiten Vielseitigkeit während der Zellkultur-Experimenten. Wir fanden ähnliche Erfahrungen mit erweiterten Tetrafluorethylen (ePTFE) 37 oder Nanofaser – Membranen elektrogesponnen aus PET, Poly-Milch / capronolactic Säure (PLCL) oder Poly -. Milch-co-Glykolsäure (PLGA) sowie Verbundnanofaser (PLGA oder PET) und PET ultradünnem 26 Bei PET – Membranen werden mit unserem metallischen Shooter Instrument verwendet, haben sie eine gelegentliche Tendenz elektrostatische Ladung aufweisen müssen, die von den Schützen ihren Ausstoß Herausforderungen 27. Ultradünner Polyimid – Membranen konnten in unseren Händen nicht mit dem Protokoll oben beschrieben in den subretinalen Raum implantiert werden ( Manuskript in Vorbereitung).

Marmor et al. systematisch haben spontan Reso studiertrption von subretinaler Flüssigkeit in iatrogenic lokalisierten Netzhautablösungen 38-41. Auch nach Manipulation in den subretinalen Raum wurden diese gefunden von postoperativen Tag 4 in ereignislos Operationen wieder absorbiert werden. Laser Retinopexie nicht durchgeführt wird, die Kanten des Retinotomie zu sichern. Obwohl nicht eingängig im Vergleich zu Humanchirurgie, Luft / Gas-Tamponade ist nicht erforderlich. Es sei denn, sorgfältige Beseitigung der periphere glasigen erreicht werden, vor allem im oberen Quadranten, dies kann in der Tat in giant Netzhautrissen resultieren aus der Retinotomie Website stammen. Es wird nur Fluidluftaustausch durchzuführen mit anschließender 20% SF6-Gas-Tamponade empfohlen intraoperative iatrogenic Netzhautablösungen oder im Falle eine bestimmte Implantatposition gesichert werden muss, zu retten.

Obwohl die mechanisch induzierte Ablation der neuronalen Netzhaut kann RPE und Photorezeptorschäden bei Kaninchen 42,43 verursachen, ändert sich ihr Ausmaß stark (auch bei regelmäßiger BSS) deanhängig von Faktoren wie IOP, Spritzentyp verwendet, wobei dadurch induzierte retinale Injektionsvolumen Dehnung, etc. Wir haben auch getestet , die oft empfohlen Ca / Mg-freie BSS Ablösung erleichtert 42-44, fand aber , dass es die intraoperative Linsentrübung verursacht (insbesondere bei erhöhter Temperatur) und verzögert signifikant oder beeinträchtigt auch retinale Wiederanbringung 27. Langsam subretinalen Injektion von 20 – 30 & mgr; l Volumen von regelmäßigen BSS mit einer 100 & mgr; l-Spritze wird deshalb empfohlen; Injektionsnadel Bewegungen sollten um ihn herum, so dass die Retinotomie Dichtungen minimal sein und Bruch-Membran Schäden zu vermeiden. Einige der iatrogene Schaden durch RPE Wundheilung gelöst werden, und die beobachteten relativen Erhaltung der ONL Dicke nach Wiederbefestigung, legt nahe , dass die RPE / Photorezeptorkomplex diese Beeinträchtigung tolerieren kann, wie dies auch 45 von anderen beschrieben.

Zell-basierte Therapeutika oder Retina-Prothesen erfordern präklinische animal Prüfung vor der Zulassung und beginnenden menschlichen Sicherheitsstudien. Der ehemalige variieren von Land zu Land. Das Kaninchenmodell hier beschrieben sind, können als kostengünstige und weniger anspruchsvolle Plattform für den Aufbau oder auch die Durchführung aller Anforderungen von Regulierungsbehörden dienen. Darüber hinaus kann es anschließend für die Ausbildung von Chirurgen in eventuellen multizentrischen klinischen Studien oder weitere Verbesserungen der Technik auf dem Weg dienen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Unterstützt von Rüdiger Stiftung vergibt im Jahr 2008 und 2010 (BVS), BONFOR / Gerok Scholarship O-137,0015 (BVS), BONFOR / Gerok Scholarship O-137,0019 (FT), die Deutsche Forschungsgemeinschaft / DFG (BVS) STA 1135 / 2-1, Chinesisch Scholarship Council Nr 2008627116 (ZL) und eine uneingeschränkte Gewährung von Geuder AG, Heidelberg (Abb. 2). Mitglieder von H. Skottman Labor, Universität Tampere Finnland sind für die Bereitstellung von hES gedankt RPE in Bild 2 gezeigt abgeleitet.

Materials

s30 ultrasonic cleaning unit Elmasonic 100 4631 2.75L
DE-23  autoclave Systec C 2209 23L
Syringe  BD  300013
300995 
301285
300294
300330 		 1ml x3
2ml x3
5ml x1
10ml x1
20ml x1
Needle  BD 305196
305136		 18G x 1 
27G x5
Scalpel Feather 2975#20 blade#20 x3
Surgical drape HARTMANN
LOHMANN & RAUSCHER		 277 502
25 440		 60×40 cm x2
12×17 cm
Ocular sticks LOHMANN & RAUSCHER 16 516 66×5 mm
Twister gauze sponges HARTMANN 481 274 x2
Closure strips HARTMANN 540 686 x4
Opmi Visu CS Microscope Zeiss N/a incl. fundus imaging system BIOM II
Chandelier endoillumination Geuder G-S03503 +
G-S03504		 25G incl. trocar
Light machine Geuder G-26033 Xenotron III
Vitrectomy machine Geuder G-60000 MegaTRON S4 S4/ HPS
Vitrector Geuder G-46301 MACH2 vitreous cutter 23G
Venturi cassette  Geuder G-60700
Sideport-infusion cannula Geuder custom  1x23G
3-0 silk suture ETHICON V546G x1
Caliper Geuder G-19135 x2
Vannas scissors Geuder G-19777 x1
Sclerotomie blade Ziemer 21-2301 1x23G
1x20G
7-0 silk suture ETHICON EH6162H x1
Needle holder Geuder G-32320 x2
Iris forceps Geuder G-18910 x1
Colibri forceps Geuder G-18950 x1
Extendible subretinal injection needle DORC 1270.EXT 41G
VR scissor Geuder G-36542 25G
Grieshaber forceps holder Alcon 712.00.41 23G
Curved scissor forceps tips Alcon 723.52 23G
Implant loading station Dow Corning 3097358-1004 SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit
blunt oval implant trephine  Geuder custom-made  2.4 x 1.1 mm 
Shooter dummy Geuder G-32227 x1
Shooter Geuder G-S03443 x1
Flute needle DORC 1281.SD 20G (Vacuum)
Manual microliter syringe Hamilton 24535 100µl
Tissue culture plates Greiner bio-one  664160 100 x 20 mm
Spectralis Multi-Modality
Imaging System		 Heidelberg
Engineering		 N/a Spectralis HRA
 + OCT
Drugs and solutions
Name Company Active agent Comments
Mucadont-IS Merz Hygiene virucidal instrument disinfectant  2L
Mucocit T Merz Hygiene Aldehyde-free instrument disinfectant 2L
Ketamin 10% WDT Ketamine  10ml (100mg/ml)
Domitor Orion Pharma Medetomidine hydrochloride 10ml (1mg/ml)
Antisedan Orion Pharma Atipamezole hydrochloride 10ml (5mg/ml)
Neosynephrin POS 10% URSAPHARM Phenylephrine HCl 10ml
Mydriacyl Alcon Tropicamid 10ml (5mg/ml)
Methocel 2% Omni Vision hydroxypropyl methylcellulose 10g
PURI CLEAR ZEISS Balance salt solution (BSS)  500ml
Glucose 5%   B.Braun Glucose 5%  solution 100ml
Heparin-Natrium-25 000 Ratiopharm Heparin 5ml (2500 unit/ml)
Suprarenin SANOFI Epinephrine 1ml (1mg/ml)
Triamcinolone University of Bonn pharmacy preservative-free Triamcinolone  1ml (40mg/ml) 
Isoptomax eye ointment Alcon dexamethasone 1 mg/g
neomycin sulfate 3,500 IU/g
polymyxin B sulfate 6,000 IU/g		 10ml
Betaisodona Mundipharma Povidon-Iod 30ml (1g/10ml)
Optive ALLERGAN sodium carboxymethylcellulose glycerol 10ml
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Al-Nawaiseh, S., Thieltges, F., Liu, Z., Strack, C., Brinken, R., Braun, N., Wolschendorf, M., Maminishkis, A., Eter, N., Stanzel, B. V. A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits. J. Vis. Exp. (115), e53927, doi:10.3791/53927 (2016).
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