JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Шаг за шагом для протокола субретинальной хирургии в Кролики

Published: September 13, 2016
doi:
10.3791/53927
, , , , , , , , ,
1Department of Ophthalmology,University of Bonn, 2Department of Ophthalmology,National University of Singapore, 3Geuder AG, 4Department of Ophthalmology,University of Münster, 5Section on Epithelial and Retinal Physiology and Disease,National Eye Institute/National Institutes of Health, 6Surgical Retina Department,Singapore National Eye Centre

Summary

Пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) стратегии замещения и генной терапии на основе рассматриваются в течение нескольких ретинальных дегенеративных заболеваний. Для клинического перевода, большие модели глаз животных необходимы для исследования хирургические методы, применяемые у пациентов. Здесь мы представляем модель кролика для субретинальной хирургии, направленной в сторону РПЭ трансплантации, который является универсальным и экономически эффективным.

Abstract

Возраст макулярной дегенерации (ВМД), пигментный ретинит, и другие заболевания, связанные с ПЭС являются наиболее распространенными причинами для необратимой потери зрения у взрослых в промышленно развитых странах. Трансплантация РПЭ, как представляется, является многообещающим терапия, так как она может заменить дисфункциональных ПЭС, восстановить свою функцию, и тем самым видение.

Здесь мы опишем метод пересадки культивируемой RPE монослой на помосте в субретинальной пространстве (SRS) кроликов. После витрэктомии xenotransplants были доставлены в SRS с помощью стрелок на заказ, состоящий из 20-го калибра металлического сопла с политетрафторэтилена (PTFE) поршня с покрытием. В настоящее время технология развивалась в более 150 хирургических операций кролика в течение 6 лет. Послеоперационное наблюдение может быть получена с использованием неинвазивных и повторяющихся в естественных изображений , таких , как в спектральной области оптической когерентной томографии (SD-OCT) с последующим перфузионного фиксированной гистологии.

ThМетод е имеет четко определенные шаги для легкого обучения и высокой вероятностью успеха. Кролики считаются большой глаз модели животных полезны в доклинических исследованиях для клинического перевода. В этом контексте кролики являются экономически эффективными и, возможно, удобная альтернатива других крупных моделей глаз животных.

Introduction

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является наиболее частой причиной нарушения зрения у взрослых в возрасте от 50 лет и старше в промышленно развитых странах, поскольку это приводит к потере центрального зрения. Около 15% этих пациентов страдают от "мокрого" формы заболевания, в котором неоваскуляризация берет свое начало от сосудистой оболочки и нарушает функцию сетчатки глаза 1. Этот вариант можно лечить с помощью высокоэффективной терапии с повторными внутри витреальной инъекций антиангиогенных препаратов 2. Тем не менее, подавляющее большинство пациентов (~ 85%) страдают от сухой формы, которая характеризуется внеклеточными отложениями (например, друзы) под пигментный эпителий сетчатки (ПЭС). Эти отложения вызывают RPE дисфункции приводит к атрофии сетчатки в макуле. Принимая во внимание отсутствие каких-либо лечебных терапевтических возможностей, компания AMD превратилась в интенсивно развивающейся области исследований, где много различных лечебных терапевтических подходов проходят испытания. Хирургическая замена РПЭ являетсяодна привлекательная возможность в будущем , чтобы победить эту изнурительной болезни 3.

Аутологичная субретинальная трансплантация РПЭ заменяет дисфункциональных или потерял ПЭС в макулы, и имеет потенциал , чтобы восстановить свою физиологическую функцию 4-9. Этот хирургический метод был прорыв с развитием протоколов РПЭ дифференцировки из эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPSC), давая ученому неограниченный источник клеток ПЭС для трансплантации 10. Трансплантация ПЭС в настоящее время признан как привлекательный первый в человеческой применения стволовых клеток, полученных терапевтических средств. Глаз предлагает отличный хирургический доступ и сложные в естественных условиях мониторинга инструментов 11-13.

Пересаживать ПЭС, один путь с минимально инвазивной доставки с помощью клеточной суспензии, в качестве альтернативы, чтобы лучше сохранить ПЭС характеристики и функции трансплантата, Арти фи SUBSTR CIAL носительАтеш (Строительные леса) для замены РПЭ рассматриваются 4,14,15. Большие животные модели требуются для доклинической проверки, еще подробной технической информации об обработке животных и хирургической техники не хватает на сегодняшний день 16-23.

Мы и другие 11,24 , несмотря на некоторые доказательства обратного 25, предполагают использование жесткой еще упругой подложки , поскольку она обеспечивает более безопасное обращение, сохраняет целостность и функциональность монослоя. Со временем мы проверили несколько специально разработанных инструментов и вспомогательных методов для имплантации клеток-носителей, поддерживаемых трансплантатов РПЭ в субретинальной пространстве (SRS). Мы использовали интраоперационные видеозаписи, в ​​естественных условиях лазерного сканирования в сочетании с офтальмоскопии спектральной области оптической когерентной томографии (SLO / SD-OCT) и гистологии оценить успех имплантации 14,26,27. Здесь мы предлагаем нашу текущую рекомендацию для субретинальной имплантатов РПЭ у кроликов,которые были испытаны в 5 различных штаммов кроликов, 7 материалов-носителей клеток и источников 4 РПЭ клеток в более чем 150 процедур.

Protocol

Этика обработки животных в офтальмологических исследований: Мы получили одобрение от комитета по этике медицинского факультета Боннского университета, и придерживаться принципов, изложенных Ассоциацией исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO). Кроме того, все процедуры были одобрены государственными регулирующими органами Северный Рейн-Вестфалия. Животные были проведены в закрытом помещении в специализированном учреждении в кондиционируемом помещении с температурой от 18 – 20 ° C, воздействие регулярного дневного света, в стандартизированных отдельных клетках со свободным доступом к пище и воде. Примечание: Для того, чтобы обеспечить животным оперативное сродство, животное оценка здоровья листа следует, который включает в себя следующие критерии исключения окончательного животных: 20% потери веса по сравнению с весом при поступлении; очевидно, цианоз животного; животное вздрагивает, имеет колику или не может двигаться в координации; . атаксии / парестезии, например, параличи; апатия; экстремальный авто членовредительство (кожные раны, отрезанные конечности). </ Р> 1. Инструмент Стерилизация Поместите многоразовые инструменты в ультразвуковой ванне. Добавить 500 мл дистиллированной воды и 2 мл дезинфицирующего прибора. Чистые инструменты с использованием функции развертки в течение 15 мин. Удалить инструменты с ультразвуковой ванне и тщательно промыть с использованием дистиллированной воды в течение 5 мин. Вставьте инструменты в автоклаве и использовать стандартную программу (стерилизации инструментов при 121 ° С в течение 20 мин). 2. Подготовка инструмента Установить и поддерживать стерильную поле, работая в закрытом помещении, ношение хирургических скрабы, маски и волосяного покрова. Лечить руки перед тем, носить стерильные хирургические перчатки. Для детального подхода см 28. Поместите простерилизованные инструменты на стерильной драпировки. Поместите 1 мл шприц, заполненный 40 мг триамцинолона, прикрепленного к 27 G иглы для инъекций, 10 мл шприц с остатком раствора соли (ПБС) и 5 ​​мл шприц Oе смазка на салфетке. Поместите 3-0 шелк, 7-0 викрил, глазные палочки (чтобы остановить конъюнктивы / склеры кровотечение), твистер марлевые тампоны, ушивание раны полосы (для фиксации наконечника трубки витрэктомии), и люстра endoillumination волокна проволоки на салфетке. Берем 25 г люстра endoilluminator и подключить к легкой машине с использованием стерильных методов (см шаг 2.1). Подключение витрэктомии набор, включая высокоскоростной vitrector и Venturi кассеты к витрэктомии машине с использованием стерильных методов (см шаг 2.1). Открыть 500 мл ПБС бутылки и соединить решение Venturi кассеты согласно инструкциям производителя. 3. Подготовка наркотизации и позиционирование животных Взвешивание животных, чтобы обеспечить точную дозировку лекарства. Готовят внутримышечного (IM) анестезии с использованием 1 шприц с иглой 27 G, содержащий 0,35 мг / кг кетамина и 0,25 мг / кг медетомидин для начала. Переверните шприц для смешивания. Подготовьте 2 шприцы с 1/3 тон дозы для поддержания анестезии во время операции. Приготовьте шприц, содержащий 20 мл 5% раствора глюкозы и 18 г иглы для подкожных инъекций как внутривенное вливание альтернативы. Дайте 3 х 1 капля мидриатического глазных капель до витрэктомии для зрачка дилатации. Обложка кролик с одеялом, чтобы успокоить перед анестезией инъекции, инъекции в заднюю конечность (ягодичной мышцы) и массаж вокруг места инъекции в течение 30 сек. Примечание: Первый выстрел из IM анестезии длится около 1 – 2 ч. в зависимости от размера кролика, терпимости наркотиков, жировой слой, напряжения и температуры тела. Первым признаком анестезии угасает является нистагм (должен контролироваться хирургом), последующие инъекции последние примерно 30 – 45 мин. Подтверждение надлежащего анестезии, проверяя гипнозом, гипорефлексия, обезболивание и расслабление мышц животного. Дайте подкожной инъекции (Pt. 3.3) в складки кожи шеи, после того, как кролик находится в бессознательном состоянии. Добавить methylcellulose смазка каждые 5 – 10 мин в оперированного глаза, добавить смазочный материал и ленты крышки в неоперированной глаза. Поместите покрытую кролика на хирургическом столе завернуто с крышкой, такие как хлопок одеяло в оптимальной позиции (нос слегка приподнятой через форму офсетного полотна, так что на одном уровне с поверхностью глазного яблока) под операционным микроскопом. Совместите глаз перпендикулярно объектив микроскопа. Обеспечить надлежащую температуру тела при помощи ректального термометра (нормотермии 39 ± 1 ° С ) 29. Вырезать ресницы с помощью ножниц (мазь на лопатку), чтобы уменьшить послеоперационные инфекции. Лечить глаза, используя 2 – 3 капли 0,1 г / мл повидон-йодом местно в течение 1 мин и промыть стерильной ПБС. Покройте глаз стерильной драпировки с предварительно вырезанное отверстие в середине для глаз, а затем покрывают (липкий) хирургический разрез драпировка 12 х 17 см. 4. Витрэктомия Proptose и безопасный для глаз с 3-0 шелк используя инвerted суппорт и выполнить конъюнктивы peritomy. Надрезать конъюнктиву с Vannas режут ножницами близко к лимбу, но достаточно далеко от кровеносных сосудов (~ 1 мм расстояние). Рассеките конъюнктиву, создавая "Т-разрез". Во-первых увеличить peritomy с ножницеобразный параллельно лимбу, а затем надрезать конъюнктиву вертикально в форме "Т" в течение приблизительно 6 – 7 мм. Аккуратно отделить конъюнктиву прямо. Выполните склеротомия с помощью 23 G microvitreoretinal (MVR) лезвие в 8 часов на правый глаз / OD (4 часа на левый глаз / OS), аккуратно вставив острый кончик ножа в направлении к зрительному нерву. Медленно отвести лезвие в том же самом направлении и избежать увеличения склеротомия. Вставьте и шовный материал изготовленный под заказ со стороны порта инфузионная канюля 27 с помощью 7-0 шелковой нити и установить внутриглазного давления (ВГД) на 24 мм ртутного столба. Выполните склеротомия с 25 G с плоской головкой троакар в 2 часа на OD (10 о '; Часы на ОС) аналогичен этапу 4.2. Вставка 25 G люстра свет в плоской головкой троакар, зацикливается с липкой лентой и включите источник света при температуре около 30%. При необходимости удалите отечной эпителий роговицы с помощью # 20 скальпель для лучшей внутриглазного визуализации. Выполните склеротомия, подобный шаг 4.2 в 10 часов на OD (2 часа в ОС), (предварительно) место U-образных 7-0 швами вокруг склеротомия без привязки узла, и вставьте витректомия резак наконечника. Начало витрэктомию 30 вокруг порта ввода, а затем продолжить через диск зрительного нерва и medullares fibrae с использованием высокоскоростного vitrector путем разрезания стекловидное тело на мелкие кусочки при макс. 2000 – 3000 сокращений / мин, аспирационных при макс. 200 мм ртутного столба с использованием заявленной установки параметров на витрэктомии машины (таблица 1) Выполните задний стекловидного отряд (PVD) путем отделения стекловидного тела от сетчатки, удерживая высокую скорость vitrector над задним полюсомй (если это возможно мягко) превосходит диска 31, аспирируя только при макс. 200 мм рт.ст. без резки. Вводят примерно 50 мкл (20 мг) триамцинолон или разбавленный флуоресцеина (приблизительно 0,1 мг / мл) интравитрально для визуализации и облегчения (субтотальный) удаление плавающего стекловидного тела через задний полюс и средней периферии во время витрэктомии. Избегайте перехода через под объективом. Отступ брить периферическое стекловидного с помощью (специалисту) ассистента рекомендуется, если газ Тампонада желательно. Добавьте 20 ед / мл гепарина и 0,5 мг адреналина в конечной концентрации 0,001 мг / мл в раствор для инфузии ПБС параллельно или после шага 4.10. Примечание: В качестве гепарин / адреналина не вводили внутриглазное их эффекты задерживаются в зависимости от скорости потока инфузии. 5. Загрузка Shooter Примечание: Работа, описанная в настоящем документе, не подпадает под действие положений Декларации Хельсинки; он не привлекал больных людей. Здесь, STAКлетки ndard ПЭС были выделены из эмбриональных человеческих глаз, культивируемых и дифференцированные на немелованной 10 мкм толщиной полиэстера (ПЭТ) вставляет в соответствии с нашим ранее опубликованным протоколом 14. Разрешение на работу с фетального материала человека была получена из комитета по этике Университета Бонна. В качестве альтернативы, HES-РПЭ были отправлены из Skottman лаборатории (рукопись в стадии подготовки.), Где они культивировали в соответствии с методикой , описанной Vaajasaari 32 и др.; для этих клеток разрешение было получено от Koch института Р., Берлин, Германия. Полоскание клеточную культуру до получения имплантата в 3 раза с офтальмологической класса ПБС. Заполните стандартную ячейку культуры блюдо (100 х 20 мм) с 10 мл офтальмологического класса ПБС. Добавить вставку для культивирования клеток в ПБС и центрировать блюдо под световым микроскопом. Выбивать 2,4 х 1,1 мм имплантат с тупым, овальной формы, выполненного на заказ иглы, чтобы получить плоскую бобовидные подложкус двумя длинными краями и двумя круглыми краями. Осторожно залить иглу через второй порт с ПБС , чтобы избавиться от имплантата в БСС заполненный выполненный на заказ погрузочной станции (рисунок 1). По желанию вырезать один круглый конец имплантата (<0,5 мм), как раз, чтобы получить третий край. Убедитесь, что имплантат находится в правильной ориентации, гарантируя, что монослой перевернута на носителе клеток. Для того, чтобы изменить позиционирование тщательно использовать два скальпели. Вставьте имплантат аккуратно и полностью в шутере инструмента с использованием иглодержатель, пока все имплантата не закреплен внутри наконечника. Поршень должен оставаться втянут. Держите "заряженный" кончик экшен в погрузочной станции под ПБС до момента имплантации. 6. Имплантация Подход нейронные сетчатку с удлинению 41 G субретинальном инъекционной иглой, соединенной с газонепроницаемой шприца (убедитесь, что все пузырьки воздуха были эвакуированыиз трубки!). Вводят BSS (с кальцием и магнием / CM) subretinally и тем самым создать отряд пузырьке сетчатки (BRD) около 2 – 3 диаметра диска (DD). Два BRD за один глаз может быть поднята безопасно. Увеличить ретинотомии до 1,5 мм с вертикальными 23 G VR-ножницы. Субретинальной пространство теперь доступна для имплантации или дальнейшего маневрирования. Продлить склеротомия (точно) с 1,4 мм надрез ножом до 20 G подхода. Попытка прохождения через склеротомия с использованием 20 G шутер манекена, увеличить по мере необходимости для обеспечения плавного, еще аккуратную переход загруженного шутера. Пройдите с загруженным стрелком 27 через склеротомия в идеале на 24 мм ртутного столба. Подход ретинотомии края и извлечь имплантат subretinally из эпиретинальной положения. Отрегулируйте имплантат с полузакрытыми 23 G ножницы, пинцет или 41 G иглы, чтобы убедиться, что она расположена хорошо под retina- достаточно далеко от ретинотомии. 7.Завершение операции Удалить 25 G люстрой и инфузионной канюли. Шовный все sclerotomies. Вводят 25 мкл (10 мг) триамцинолон по 8 часов склеротомия (до прошивания последней склеротомия). Проверьте / отрегулируйте ВГД при пальпации и впрыснуть BSS через 30 G иглы / шприца, если это необходимо. Шов конъюнктивы с 7-0 Викрил. Удалить proptosing 3-0 шелк строп медленно (Избегайте глубоких орбитальную венозные сплетения!). Добавить / дексаметазон мазь с антибиотиком под крышкой. Положение в течение 1 часа покрыт одеялом с оперированного глаза вверх (без газа), или вниз (с воздухом / газом). Не оставляйте животное без присмотра, пока он не приходит в сознание достаточного для поддержания грудины отдохновение. Не перевозить кролика перед наркозом исчезает полностью, это может быть ускорен путем введения медетомидин реверсирования агента, равное сумме медетомидина данной. 8. Послеоперационный Уход за животными Держатькроликов при соответствующих условиях (температура, свет, продукты питания, вода, пространство и др.) и тщательный мониторинг в специализированном лечебном учреждении. Убедитесь в том, что животное хорошо отдохнувшим, то есть., В настоящее время не длительные периоды пищи или воды лишения. Ищите любые раны или травмы, особенно на местах инъекций. Держите раны сухим, чтобы предотвратить инфекции. Дайте антибиотики при подозрении на инфекцию: дексаметазон 1 мг / г, неомицина сульфат 3500 МЕ / г, полимиксин В сульфат 6000 МЕ / г мазь применяется два раза в день в течение 1 недели после операции или на поверхности глазного яблока. Добавить / дексаметазон мазь с антибиотиком для следующих 7 дней после операции или два раза в день для лучшей регенерации поверхности глазного яблока и уменьшение послеоперационной боли. Дайте системные анальгетики (Carprofene 4 мг / кг два раза в день) в течение первоначального 48 часов. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины отдохновение. Не возвращать животное,подвергся хирургии в компании других животных, пока полностью не выздоровел. Не подвергать животных к ненужным дистресса. 9. SLO / SD-октябрю Руководство Подготовить и ввести внутримышечно (IM) анестезии с использованием 1 шприц с 27 G иглой, содержащей 0,175 мг / кг кетамина и 0,125 мг / кг медетомидин для начала. Переверните шприц для смешивания. Добавьте смазочный материал, по крайней мере через каждые 5 мин, чтобы увлажнить глаза и поддерживать четкое SD-OCT изображений, при необходимости может быть использован пользовательский контактных линз. Прикрепите стальную платформу к подголовнику, чтобы стабилизировать животное в требуемом положении. Поместите кролика на стальной платформе, помещая ее глаз перпендикулярно к зонду. Держите голову кролика из нижней скулы () нижней челюсти, избегая трахею. наклон головы животного примерно на 45º к SD-ОКТ зондом для оптимизации угла обзора на имплантат. Используйте 30-градусный объектив и следующие параметры для неавтоматическогоIMAL Октябре изображений [HS]: 30 градусов настройки для одной линии сканирования с режимом ART установлен в 100 (в среднем) и 20 х 20 градусов для настройки громкости сканирования с режимом АРТ равным 15; режим высокого разрешения не требуется. Использование SLO инфракрасного отражения изображений , чтобы найти фокальной плоскости имплантата (рис 2А.); Оптимальная фокусировка достигается , когда (все) имплантированные края заострены 14. Добавить дексаметазона 1 мг / г, неомицина сульфат 3500 МЕ / г, полимиксин В сульфат 6000 МЕ / г мазь под крышкой, когда закончите.

Representative Results

Результаты описанного способа для субретинальном имплантации приведены в таблице 2. приживления под сетчатку имели успех скорость ок 61% , когда сердечник витрэктомии выполняли и выросли до 76%, когда задняя стекловидного отряд наведенной. Эти цифры включают приблизительно до 21% животных, умерших либо интраоперационно или в течение первых 3 дней после операции. Этот метод может быть использован для имплантации двух строительных лесов на различных участках сетчатки глаза одновременно в одном глазу. Кролики прошли послеоперационные в естественных условиях наблюдения с помощью SD-OCT и гистологическую обработку , как описано Stanzel и др. 27 (рисунок 2). Рис. 2A показывает сканирующего лазерного офтальмоскопа инфракрасного отражения изображение имплантированного культивируемых ПЭС на полиэфирной мембране (ПЭТ) после неосложненного трансплантации.гало вокруг имплантата соответствует фоторецептор атрофию. Рис. 2B показывает соответствующую SD-Октябре, уведомление сетчатки глаза, в основном наружный ядерный слой (ONL) истончение, гипер светоотражающая полоска на SD-OCT над имплантатом, в то время как нейронная сетчатка рядом с имплантатом показывает практически нормальных полос отражения. Эти результаты свидетельствуют о атравматической поставки. Рис. 2C показывает гематоксилин / эозином (Н / Е) пятно имплантата , который показывает субретинальной рубцевание и ONl атрофии вокруг ретинотомии сайта, в результате переноса ятрогенной манипуляций, смежный еще нерегулярный пигментированный слой над ПЭТ. мембраны Бруха под имплантат также оказались смежными, и choriocapillaris содержит некоторые рассеянные эритроцитами. Эти результаты морфологического сопоставимы с SD-OCT и усилить тезис атравматической доставки. инжир Юр 1: Загрузка Шутер с человека иПСК-РПЭ культивируют на ПЭТ – Cell Carrier. A) Показывает пробивка имплантат с использованием выполненный на заказ иглы. B) фасолевидных имплантата , вырезанные из клеточной культуры. C) Позиционирование имплантата перед загрузкой. D) Загрузка шутера с имплантатом. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры , Рисунок 2: культивированных человеческих ЭСК-РПЭ на ПЭТ Cell Carrier 4 недель у кролика субретинальном пространства. A) Показывает SLO инфракрасное изображение отражения, зеленая линия разграничивает поперечное сечение , показанное на рис. 2B. B) Соответствующая SD-октябрь. C) H / E пятно см текст или 26,27 для деталей.ove.com/files/ftp_upload/53927/53927fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. параметр Используемые настройки Витрэктомия 6000 сокращений / мин вакуум 200 мм рт.ст. Время нарастания 1 сек Воздух 24 мм рт.ст. орошение 24 КМЗ 2 O Diathermy 30% Таблица 1: Параметры настройки из Витрэктомия машины. Витрэктомия имплантат Кролики работает Успешный имплантат Ошибка имплантата Смерть Шанс успеха% ядро витректомия ПЭТ 30 19 4 7 63.33 ПЭТ + РПЭ 70 42 12 16 60 PVD, ± плазмин ж / PPV ПЭТ 28 21 2 5 75 ПЭТ + RPЕ 22 17 2 3 77.27 Таблица 2: Сводка последних 150 операций , включая метод и Implant типа.

Discussion

Использование модели кролика, безопасный и воспроизводимый метод представлен для transvitreal доставки культивированных ПЭС на носителях клеток в субретинальной пространство с оригинальным дизайном шутер инструмента. Описанный метод предлагает короткий / оптимизированный для хирургической техники для легкого обучения, так как она включает в себя стандартные методы в витрэктомии с субретинальной маневрах. Результат в значительной степени способствует чистой витреоретинальной интерфейса и внутриглазной инфузии, что позволяет избежать турбулентности жидкости на участке имплантации, вызывая отслоение пузырьке (BRD) при низком ВГД, предотвращая повреждение сетчатки и склеры через сухости, а также соответствующее позиционирование кролика.

Мы предостерегают однако, как несколько интраоперационных осложнений может произойти в любое время, препятствуя успех имплантации, например внутриглазного кровотечения, обезболивание выцветанию от во время жизненно важных шагов, таких как имплантации, разрушающиеся РЗК из-за манипуляций инструмента или внутриглазной гипотонии, рabbit смерть из-за чрезмерной дозы анестезии, низкое кровяное давление во время длительной эксплуатации, вызывая гипоксию повреждение мозга, или гипертермии. Тем не менее, эти осложнения со временем уменьшаются, поскольку они быстро решаются и решаются за счет увеличения опыта хирургической бригады.

Некоторые осложнения могут быть сокращены, выполнив несколько простых, но важных шагов. Смазочный материал должен быть добавлен каждые 5 – 10 минут, чтобы предотвратить роговицы, склеры и конъюнктивы повреждения во время операции, а также для поддержания четкой интраокулярных средств массовой информации, а сушат / почерневшие склеры может быть причиной раневой зияние, что в свою очередь приводит к глазным гипотонии и / или интраоперационной утечка из sclerotomies. Гепарин следует добавить , чтобы предотвратить образование фибрина пленки , что делает особенно субретинальная имплантации сложной и одновременно добавляя эпинефрин , чтобы уменьшить кровотечение при гепарин 16. раз Слишком долго гепарин / экспозиции эпинефрин (> 1 час) следует избегать, чтобы предотвратить Эде роговицыма эндотелиальной декомпенсации 33, гипертонического криза или интраоперационной летальностью. Тщательное стекловидное удаление должно быть выполнено в порту прибора (вход), чтобы избежать ретиналь и / или хориоидальной отрядами. Внутриглазные инструменты следует отметить к заднему полюсу, чтобы избежать прикосновения объектива (вызывает образование ятрогенный катаракты) или (сайт запись) повреждение сетчатки глаза. Внутриглазное боковой порт инфузионная канюля следует использовать, так как она ослабляет струю вокруг зоны имплантации, тем самым предотвращая неконтролируемое разрывание ретинотомии и крах BRD. BRD индукция в средней линии (по вертикальной оси от зрительного нерва) или близко к оптических волокон продолговатого мозга следует избегать, чтобы предотвратить обширные ятрогенных отслойки сетчатки. И, наконец, последнее , но не в последнюю очередь BRD должен быть вызван при низком ВГД, чтобы избежать субретинальной BSS инъекции с использованием чрезмерных скоростей потока , которые могут привести к повреждению сетчатки глаза (например., Растяжением).

Многие исследования переменных, таких как клетки Carrieварианты г, плода, взрослого или стволовых клеток , полученных источники клеток ПЭС, выбор для иммунодепрессантов и др., могут быть изучены 14,26,27,34. Дальнейшее совершенствование методов , таких как РПЭ культуры без сыворотки, характеристики xenoRPE в субретинальной пространстве, удаление хозяина РПЭ слоя 14 или стратегий для имплантата якорной являются в настоящее время работа продолжается.

На сегодняшний день описанные методы были использованы на 5 различных штаммов кроликов, в том числе шиншиллы ублюдок, ублюдок Шиншилла / KBL гибридов, Новая Зеландия Белый / Красного Креста, Новой Зеландии белый (альбинос) и голландский поясом. И мужские и женские кролики были прооперированы, с кроликами по меньшей мере, 1,5 кг или 2-месячного возраста (в зависимости от вида). Большинство операций были на пигментированные кроликов (шиншилла незаконнорожденных или шиншилла ублюдок гибриды) с весом от 2,5 – 3 кг.

Все штаммы кролика мы имели возможность работать с, кажется, есть некоторые особенности. Учитывая исключение подразумеваемыхАйв наличие пигментных кроликов штамма шиншиллы незаконнорожденного в Германии в 2009-13, мы собрали самый большой опыт с этими животными. К сожалению, он больше не доступен, так как разведение было прекращено, но сравнивает очень хорошо Новой Зеландии Белый / Красный Крест для более выгодном толще склеры и больших объемов глаз в последнем, за исключением. Шиншилла ублюдок гибриды имеют образование значительного интраоперационной фибрина и требуют использования гепарин / эпинефрин, как указано выше, для обеспечения успешных субретинальном маневров. Этот протокол также был выполнен в непигментированных кроликов-альбиносов (Новая Зеландия White), однако особенно BRD создание и субретинальная имплантации является более сложным, учитывая снижается контраст оценка. Показана возможность индукции задней стекловидного отряд не казался напряжение кролика зависимым в наших руках.

Transvitreal субретинальная поставки, скорее всего, будущее хирургической тактикой дали это самый Прдч на маршруте в настоящее время в клинике для доступа к сетчатке. В результате многие другие группы представили такие методы для культивируемых ПЭС на носитель поддерживает в рабочем животных 11,15,23,35. Aramant и др. 36 есть инструмент, который ставит , а не выталкивает их гидрогель инкапсулированные мягкий имплантат с его субретинальном целевой сайт. Конструкция Туманн и др. Используют полую лопаточку, который выпускает на носителе трансплантат плавучими его через инъекции жидкости 19. Обе стратегии требуют бывшие субретинальной вставки прибора, на наш взгляд, более склонны к осложнениям, когда по сравнению с epiretinally appositioned инструмента. Монтесума и др. 22 описал субретинальной INSERTER инструмент для доставки субретинальной имплантатов чип у свиней , но никакая дальнейшая работа не была опубликована , так как в меру наших знаний. Нам удалось расширить описанную технику с некоторой модификацией свиньи.

jove_content "> Наши предпочтительными носителями клеточные 10 микрон толщиной полиэстер (РЕТ) мембраны. С хирургической точки зрения, этот материал имеет благоприятные жесткость и эластичность параметров, в дополнение к своей широкой универсальности в ходе экспериментов на клеточных культурах. Мы обнаружили, аналогичные опыты с расширенной тетрафторэтилена (пПТФЭ) 37 или нановолокна мембраны electrospun из ПЭТ, поли-молочная / capronolactic кислота (PLCL) или поли -. молочной и гликолевой кислоты (PLGA), а также композитные нановолокна (PLGA или ПЭТ) и ПЭТ ультратонкий 26 Когда ПЭТ – мембраны используются с нашим металлическим шутера инструмента, они имеют случайную тенденцию проявлять электростатический заряд, который бросает вызов их выбросу из стрелок 27. ультратонкие полиимидные мембраны могли в наших руках не имплантироваться в субретинальной пространстве с протоколом , описанной выше ( рукопись в процессе подготовки).

Marmor и др. систематически изучали спонтанную Resorption субретинальной жидкости в ятрогенных локализованными отслоения сетчатки 38-41. Даже следующие манипуляции в субретинальной пространстве были обнаружены эти быть поглощаемые день после операции 4 в беспрецедентен операций. Лазерная ретинопексия не выполняется для закрепления краев ретинотомии. Несмотря на то, противоречит здравому смыслу, по сравнению с человеческой хирургии, воздух / газ Тампонада не требуется. Если дотошный удаление периферической части стекловидного тела не может быть достигнуто, в частности, в верхнем квадранте, это на самом деле может привести к очень большими разрывами сетчатки глаза, происходящих с сайта ретинотомии. Только рекомендуется осуществлять воздухообмен жидкости с последующим 20% SF6 газа тампонады спасти интраоперационные ятрогенные отслойки сетчатки или в случае конкретной позиции имплантата должен быть закреплен.

Несмотря на то, механически абляции нервной сетчатки может привести к ПЭС и фоторецепторов повреждения у кроликов 42,43, ее масштабы сильно (даже с регулярными ПБС) де изменяетсяв ожидании от таких факторов, как тип ВГД, шприц, используемый объем впрыска с таким наведенного ретиналя растяжения и т.д.. Мы также тестировали часто рекомендуется Ca / Mg свободных ПБС облегчило отряд 42-44, но обнаружил , что она вызывает интраоперационной объектив помутнение (особенно с повышенной температурой), а также значительно задерживает или даже ухудшает сетчатке повторное вложение 27. Медленное субретинальная инъекция 20 – объем 30 мкл регулярного ПБС с 100 мкл шприца поэтому рекомендуется; движения инъекционная игла должна быть минимальной, так в ретинотомии уплотнения вокруг него и предотвращения повреждения мембраны Бруха. Некоторые из ятрогенных повреждений могут быть решены путем РПЭ заживления ран, и наблюдаемое относительное сохранение ONl толщины после реплантации, позволяет предположить , что ПЭС / фоторецепторов комплекс может терпеть такого нарушения, а также описаны другими 45.

Клеточные терапевтических средств или протезирование сетчатки глаза требуют доклинические анимал испытания до нормативного утверждения и начала исследования безопасности человека. Первые варьируются от страны к стране. Модель кролика, описанный здесь может служить экономически эффективным и менее сложной платформой для создания или даже выполнение всех требований регулирующими органами. Кроме того, он может впоследствии служить для подготовки хирургов в возможных многоцентровых клинических испытаний или дальнейшего совершенствования методики по пути.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

При поддержке грантов Рюдигер Фонда в 2008 и 2010 (BVS), BONFOR / Gerok стипендиальной O-137,0015 (БВС), BONFOR / Gerok стипендиальной O-137,0019 (FT), Немецкое исследовательское общество / DFG (BVS) STA 1135 / 2-1, китайский Стипендия Совета № 2008627116 (ZL) и неограниченный грант от Geuder AG, Heidelberg (рис. 2). Члены лаборатории Х. Skottman, в университете Тампере Финляндии с благодарностью за предоставление HES, полученных ПЭС, показанного на фиг.2.

Materials

s30 ultrasonic cleaning unit Elmasonic 100 4631 2.75L
DE-23  autoclave Systec C 2209 23L
Syringe  BD  300013
300995 
301285
300294
300330 		 1ml x3
2ml x3
5ml x1
10ml x1
20ml x1
Needle  BD 305196
305136		 18G x 1 
27G x5
Scalpel Feather 2975#20 blade#20 x3
Surgical drape HARTMANN
LOHMANN & RAUSCHER		 277 502
25 440		 60×40 cm x2
12×17 cm
Ocular sticks LOHMANN & RAUSCHER 16 516 66×5 mm
Twister gauze sponges HARTMANN 481 274 x2
Closure strips HARTMANN 540 686 x4
Opmi Visu CS Microscope Zeiss N/a incl. fundus imaging system BIOM II
Chandelier endoillumination Geuder G-S03503 +
G-S03504		 25G incl. trocar
Light machine Geuder G-26033 Xenotron III
Vitrectomy machine Geuder G-60000 MegaTRON S4 S4/ HPS
Vitrector Geuder G-46301 MACH2 vitreous cutter 23G
Venturi cassette  Geuder G-60700
Sideport-infusion cannula Geuder custom  1x23G
3-0 silk suture ETHICON V546G x1
Caliper Geuder G-19135 x2
Vannas scissors Geuder G-19777 x1
Sclerotomie blade Ziemer 21-2301 1x23G
1x20G
7-0 silk suture ETHICON EH6162H x1
Needle holder Geuder G-32320 x2
Iris forceps Geuder G-18910 x1
Colibri forceps Geuder G-18950 x1
Extendible subretinal injection needle DORC 1270.EXT 41G
VR scissor Geuder G-36542 25G
Grieshaber forceps holder Alcon 712.00.41 23G
Curved scissor forceps tips Alcon 723.52 23G
Implant loading station Dow Corning 3097358-1004 SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit
blunt oval implant trephine  Geuder custom-made  2.4 x 1.1 mm 
Shooter dummy Geuder G-32227 x1
Shooter Geuder G-S03443 x1
Flute needle DORC 1281.SD 20G (Vacuum)
Manual microliter syringe Hamilton 24535 100µl
Tissue culture plates Greiner bio-one  664160 100 x 20 mm
Spectralis Multi-Modality
Imaging System		 Heidelberg
Engineering		 N/a Spectralis HRA
 + OCT
Drugs and solutions
Name Company Active agent Comments
Mucadont-IS Merz Hygiene virucidal instrument disinfectant  2L
Mucocit T Merz Hygiene Aldehyde-free instrument disinfectant 2L
Ketamin 10% WDT Ketamine  10ml (100mg/ml)
Domitor Orion Pharma Medetomidine hydrochloride 10ml (1mg/ml)
Antisedan Orion Pharma Atipamezole hydrochloride 10ml (5mg/ml)
Neosynephrin POS 10% URSAPHARM Phenylephrine HCl 10ml
Mydriacyl Alcon Tropicamid 10ml (5mg/ml)
Methocel 2% Omni Vision hydroxypropyl methylcellulose 10g
PURI CLEAR ZEISS Balance salt solution (BSS)  500ml
Glucose 5%   B.Braun Glucose 5%  solution 100ml
Heparin-Natrium-25 000 Ratiopharm Heparin 5ml (2500 unit/ml)
Suprarenin SANOFI Epinephrine 1ml (1mg/ml)
Triamcinolone University of Bonn pharmacy preservative-free Triamcinolone  1ml (40mg/ml) 
Isoptomax eye ointment Alcon dexamethasone 1 mg/g
neomycin sulfate 3,500 IU/g
polymyxin B sulfate 6,000 IU/g		 10ml
Betaisodona Mundipharma Povidon-Iod 30ml (1g/10ml)
Optive ALLERGAN sodium carboxymethylcellulose glycerol 10ml
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fine, A. M., et al. Earliest symptoms caused by neovascular membranes in the macula. Arch Ophthalmol. 104, 513-514 (1986).
  2. Lim, L. S., Mitchell, P., Seddon, J. M., Holz, F. G., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. Lancet. 379, 1728-1738 (2012).
  3. Holz, F. G., Strauss, E. C., Schmitz-Valckenberg, S., van Lookeren Campagne, M. Geographic Atrophy: Clinical Features and Potential Therapeutic Approaches. Ophthalmology. 121, 1079-1091 (2014).
  4. Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Transplantation of the RPE in AMD. Prog Retin Eye Res. Prog Retin Eye Res. 26, 516-554 (2007).
  5. da Cruz, L., Chen, F. K., Ahmado, A., Greenwood, J., Coffey, P. RPE transplantation and its role in retinal disease. Prog Retin Eye Res. 26, 598-635 (2007).
  6. Del Priore, L. V., Tezel, T. H., Kaplan, H. J. Maculoplasty for age-related macular degeneration: reengineering Bruch’s membrane and the human macula. Prog Retin Eye Res. 25, 539-562 (2006).
  7. Gouras, P., Marmor, M. F., Wolfensberger, T. J. . The retinal pigment epithelium. , 492-507 (1998).
  8. Lund, R. D., et al. Cell transplantation as a treatment for retinal disease. Prog Retin Eye Res. 20, 415-449 (2001).
  9. Blenkinsop, T. A., Corneo, B., Temple, S., Stern, J. H. Ophthalmologic stem cell transplantation therapies. Regen Med. 7, 32-39 (2012).
  10. Hirami, Y., et al. Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells. Neurosci Lett. 458, 126-131 (2009).
  11. Carr, A. J., et al. Development of human embryonic stem cell therapies for age-related macular degeneration. Trends in neurosciences. 36, 385-395 (2013).
  12. Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt’s macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385, 509-516 (2015).
  13. Jha, B. S., Bharti, K. Regenerating Retinal Pigment Epithelial Cells to Cure Blindness: A Road Towards Personalized Artificial Tissue. Curr Stem Cell Rep. , 1-13 (2015).
  14. Stanzel, B. V., et al. Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space. Stem Cell Reports. 2, 64-77 (2014).
  15. Hynes, S. R., Lavik, E. B. A tissue-engineered approach towards retinal repair: scaffolds for cell transplantation to the subretinal space. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248, 763-778 (2010).
  16. Szurman, P., et al. Experimental implantation and long-term testing of an intraocular vision aid in rabbits. Arch Ophthalmol. 123, 964-969 (2005).
  17. Bhatt, N. S., et al. Experimental transplantation of human retinal pigment epithelial cells on collagen substrates. Am J Ophthalmol. 117, 214-221 (1994).
  18. Nicolini, J., et al. The anterior lens capsule used as support material in RPE cell-transplantation. Acta Ophthalmol Scand. 78, 527-531 (2000).
  19. Thumann, G., et al. The in vitro and in vivo behaviour of retinal pigment epithelial cells cultured on ultrathin collagen membranes. Biomaterials. 30, 287-294 (2009).
  20. Del Priore, L. V., Tezel, T. H., Kaplan, H. J. Survival of allogeneic porcine retinal pigment epithelial sheets after subretinal transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45, 985-992 (2004).
  21. Pritchard, C. D., Arner, K. M., Langer, R. S., Ghosh, F. K. Retinal transplantation using surface modified poly(glycerol-co-sebacic acid) membranes. Biomaterials. 31, 7978-7984 (2010).
  22. Montezuma, S. R., Loewenstein, J., Scholz, C., Rizzo, J. F. Biocompatibility of Materials Implanted into the Subretinal Space of Yucatan Pigs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).
  23. Brantfernandes, R. A., et al. Safety study in Mini Pigs of transplanted Human Embryonic Stem Cell Derived Retinal Pigment Epithelium (hESC-RPE). Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 312 (2012).
  24. Lu, B., Zhu, D., Hinton, D., Humayun, M. S., Tai, Y. C. Mesh-supported submicron parylene-C membranes for culturing retinal pigment epithelial cells. Biomed Microdevices. 14, 659-667 (2012).
  25. Boochoon, K. S., Manarang, J. C., Davis, J. T., McDermott, A. M., Foster, W. J. The influence of substrate elastic modulus on retinal pigment epithelial cell phagocytosis. Journal of biomechanics. 47, 3237-3240 (2014).
  26. Liu, Z., Yu, N., Holz, F. G., Yang, F., Stanzel, B. V. Enhancement of retinal pigment epithelial culture characteristics and subretinal space tolerance of scaffolds with 200 nm fiber topography. Biomaterials. 35, 2837-2850 (2014).
  27. Stanzel, B. V., et al. Subretinal delivery of ultrathin rigid-elastic cell carriers using a metallic shooter instrument and biodegradable hydrogel encapsulation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 490-500 (2012).
  28. AORN Recommended Practices Committee. Recommended practices for maintaining a sterile field. AORN J. 83 (2), 402 (2006).
  29. Hong, S. B., et al. Physiologic characteristics of cold perfluorocarbon-induced hypothermia during partial liquid ventilation in normal rabbits. Anesth Analg. 94, 157-162 (2002).
  30. Machemer, R. The development of pars plana vitrectomy: a personal account. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 233, 453-468 (1995).
  31. Los, L. I., van Luyn, M. J., Nieuwenhuis, P. Organization of the rabbit vitreous body: lamellae, Cloquet’s channel and a novel structure, the ‘alae canalis Cloqueti’. Exp Eye Res. 69, 343-350 (1999).
  32. Vaajasaari, H., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
  33. Iverson, D. A., Katsura, H., Hartzer, M. K., Blumenkranz, M. S. Inhibition of intraocular fibrin formation following infusion of low-molecular-weight heparin during vitrectomy. Arch Ophthalmol. 109, 405-409 (1991).
  34. Thieltges, F., et al. Subretinal implantation of human embryonic stem cell derived RPE on ultrathin polyester carriers in rabbits. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56, 1824 (2015).
  35. Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2, 205-218 (2014).
  36. Seiler, M. J., Aramant, R. B. Intact sheets of fetal retina transplanted to restore damaged rat retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39, 2121-2131 (1998).
  37. Stanzel, B. V., et al. SD-OCT Complements Histology in Evaluation of Potential Bruch’s Membrane Prosthetics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 5241 (2010).
  38. Marmor, M. F., Abdul-Rahim, A. S., Cohen, D. S. The effect of metabolic inhibitors on retinal adhesion and subretinal fluid resorption. Invest Ophthalmol Vis Sci. 19, 893-903 (1980).
  39. Frambach, D. A., Marmor, M. F. The rate and route of fluid resorption from the subretinal space of the rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 22, 292-302 (1982).
  40. Kita, M., Negi, A., Marmor, M. F. Lowering the calcium concentration in the subretinal space in vivo loosens retinal adhesion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33, 23-29 (1992).
  41. Marmor, M. F. Control of subretinal fluid: experimental and clinical studies. Eye. 4 (Pt 2), 340-344 (1990).
  42. Faude, F., et al. Facilitation of artificial retinal detachment for macular translocation surgery tested in rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42, 1328-1337 (2001).
  43. Szurman, P., et al. Ultrastructural Changes after Artificial Retinal Detachment with Modified Retinal Adhesion. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 4983-4989 (2006).
  44. Fang, X. Y., et al. Effect of Ca(2+)-free and Mg(2+)-free BSS Plus solution on the retinal pigment epithelium and retina in rabbits. Am.J.Ophthalmol. 131, 481-488 (2001).
  45. Ivert, L., Kjeldbye, H., Gouras, P. Long-term effects of short-term retinal bleb detachments in rabbits. Graefes Arch.Clin.Exp.Ophthalmol. 240, 232-237 (2002).

Tags

Subretinal SurgeryRabbit ModelRPE ReplacementAge-related Macular DegenerationCell-based TherapyVitrectomyIntraocular SurgeryAnesthesiaDisinfectionProptosisConjunctival PeritomyMicrovitreoretinal BladeScleral Incision

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Al-Nawaiseh, S., Thieltges, F., Liu, Z., Strack, C., Brinken, R., Braun, N., Wolschendorf, M., Maminishkis, A., Eter, N., Stanzel, B. V. A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits. J. Vis. Exp. (115), e53927, doi:10.3791/53927 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image