El aislamiento y la diferenciación de células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo de la especie porcina tejidos adiposos

Nota: Este método se ha establecido y utilizado en la investigación se informó anteriormente 14-17 de este laboratorio; con el tiempo se modificó la metodología. El procedimiento actual se realizó con un promedio de 60 g de los tejidos adiposo subcutáneo de la especie porcina de un cochinillo (de 7 a 9 días de edad) con siembra en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos. Todos los procedimientos se realizaron a RT menos que se designe de otra manera. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Universidad Nacional de Taiwán. 1. Preparar la digestión Medio Obtener tejidos adiposo subcutáneo del cuello y la espalda; 40 a 80 g por lechón (7 a 9 días de edad), en función del tamaño de los cerdos. Aquí, usar 60 g de los tejidos adiposo subcutáneo obtenidos a partir de un cerdo. Para preparar el medio de digestión: se pesan polvo de colagenasa II con un total de 54.000 unidades y se disuelven en 90 ml de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM,60 g de grasa) en una botella de 100 ml serológica (900 unidades de colagenasa / 1,5 ml de DMEM / g de grasa). Agitar suavemente el medio de digestión en una mesa de agitación (100 rpm) durante al menos 15 min para disolver y luego pasar el medio de digestión a través de un filtro de 0,22 micras para la esterilización. Almacenar a 4 ° C antes de su uso. 2. Dissect adiposo subcutáneo tejidos de cerdos Esterilizar todos los instrumentos, vidrio y artículos de plástico y caliente todos los medios a 37 ° C antes de su uso. Sacrificar los lechones con desangramiento eléctrica impresionante y o mediante el uso de un método de acuerdo con las regulaciones locales IACUC. Realizar la disección cuidadosamente e inmediatamente después se sacrifican los lechones. Coloque el lechón en una mesa quirúrgica limpia (de nuevo hacia arriba y boca abajo). Afeitarse el pelo de la espalda de los lechones eliminar todo el vello desde el cuello hasta la cola y en ambos lados hacia abajo a la línea media. Frote la piel dorsal del cerdo con el 7,5% povidonayodo tres veces (con tres nuevos friega-independientes) y luego permitir que el yodo se siente en la superficie de la piel durante aproximadamente 10 minutos. Retire la povidona yodada con múltiples chorros de etanol al 70%. Use almohadillas de gasa o papel de seda que contienen 70% de etanol para limpiar la piel en una dirección, repitiendo hasta que no se observa el color evidente de povidona-yodo. Utilice un bisturí para separar la capa de grasa dorsal porcino de los tejidos adiposo subcutáneo junto con la capa de piel adjunta de los músculos mientras que soporta la grasa y la piel usando fórceps. Inmediatamente sumerja la capa de grasa de los tejidos adiposo subcutáneo de la piel con adjunto en un vaso de precipitados esterilizado (200 ml) que contiene DMEM libre de suero. Pulverizar el exterior del vaso de precipitados que contiene la capa de grasa con 70% de etanol y el lugar en una campana de cultivo de célula de flujo laminar. Colocar una grande (40 cm x 30 cm) esterilizado lámina de cubierta de triple capa en la campana. [A triple capa se utiliza para asegurar la integridad continua.] Colocar eltejido con la piel hacia abajo sobre la lámina de cubierta. Recorte el tejido muscular que queda fuera del tejido adiposo utilizando pinzas y tijeras para evitar la contaminación con el tejido muscular. Cortar la grasa en trozos cuadrados (~ 7 cm x 7 cm) con un bisturí o tijeras. Ponga estas piezas de la capa de grasa en un nuevo vaso de precipitados esterilizado (200 ml) que contiene DMEM libre de suero. Establecer un soporte personalizado rebanada sobre la lámina de tapa montada con una cuchilla de la máquina de cortar acero al carbono (Figura 1). Tome un pedazo de grasa del vaso de precipitados y colocarlo en la máquina de cortar (capa de piel en la parte superior y la capa de grasa debajo). Cortar la capa de grasa de los tejidos adiposos subcutáneos en aproximadamente 1 mm de espesor piezas. Cortar la capa de grasa de la piel lo más cerca posible, pero evitar cortar la piel. De carne picada en rodajas tejidos adiposos con unas tijeras finas como sea posible. Se añade medio de la digestión filtrada que contiene colagenasa a un matraz Erlenmeyer de 250 ml o una botella serológica con picadatejidos adiposos (54.000 unidades de colagenasa / 90 ml de DMEM / 60 g de grasa). Incubar y agitar el matraz Erlenmeyer a 45 rpm en un agitador orbital durante 90 minutos a 37 ° C para permitir la colagenasa para digerir los tejidos. Nota: Compruebe cada 15 a 30 minutos para evitar el exceso de digestión. El proceso de digestión se completa si el medio de la digestión es una pasta sin grumos de tejido importantes. Añadir un volumen igual (igual al medio de digestión) de medio de cultivo que contiene DMEM / F12 con suero bovino fetal al 10% (FBS) para detener la digestión con colagenasa. Figura 1. Una máquina de cortar a medida utilizada para el aislamiento de pADSC. Disecado tejidos adiposos de dorsales porcina tejidos adiposo subcutáneo se componen de la capa de grasa de la piel con capas unidas. Se requiere una máquina de cortar para cortar la capa de grasa de aproximadamente 1 mm de espesor con la evitación de excesorebanar en las capas de la piel. De izquierda a derecha: titular de la rebanada, la almohadilla de la máquina de cortar, hoja de acero máquina de cortar de carbono, y los tornillos. Se inserta la cuchilla máquina de cortar entre el titular de la rebanada y la almohadilla de la máquina de cortar cuando está montado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 3. Recogida de pADSC de la fracción del estroma vascular Pasar el medio de digestión que contiene los tejidos adiposos digeridos a través de una sola capa de gasa esterilizada en un Erlenmeyer de 250 ml matraz limpio o una botella de 250 ml serológico. Utilice unas pinzas para deprimir el medio de la gasa de guiar y ayudar al paso de la digestión. Escurrir y torcer la gasa con un fórceps para completar el paso. Distribuir el medio de digestión en cuatro tubos de centrífuga de 50 ml cónicos (~ 40 ml por medio tubo). Centrifugar a 700 xg durante 10 min para recoger el sedimento de células del estroma-vascular. <li> Decantar el sobrenadante sin perturbar los gránulos para eliminar la mayor parte de la capa de grasa superior que contiene adipocitos maduros. Lavar el sedimento por adición de 10 ml de DMEM en cada tubo para resuspender el pellet con pipeteo y agitación suave del tubo. Centrifugar a 700 xg durante 6 minutos. Se decanta el sobrenadante. Añadir 10 ml de tampón de lisis ACK y luego volver a suspender el sedimento con la pipeta. Se deja reposar durante 7 min (5 a 10 min) a temperatura ambiente para lisar las células rojas de la sangre en la fracción estromal-vascular. Añadir cantidades iguales de DMEM (10 ml) para detener la reacción con agitación suave del tubo y centrifugar a 700 xg durante 10 min. Se decanta el sobrenadante, añadir 10 ml de DMEM en cada tubo, resuspender el precipitado con pipeteo repetido, y se centrifuga a 700 g durante 6 min. Repetir dos veces. Recoger y pasar el DMEM (total de 40 ml de DMEM a partir de 4 tubos que representan 60 g de grasa) con células suspendidas a través de un filtro de 100 micras en un nuevo tubo cónico de 50 ml. Suavemente medi pipetaum varias veces para mezclar bien y alícuota de 20 l de medio que contiene células se mezcla con 180 l de 0,4% de solución de azul de tripano (dilución 1:10) en un nuevo 1,5 ml tubo Eppendorf. Contar las células con un pADSC semilla hemocitómetro y luego a una densidad de 60.000 células / cm 2 en un tamaño deseado de placa de cultivo o placa con medio de cultivo que contiene DMEM / F12, 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de antibióticos de penicilina -streptomycin solución B-anfotericina (P / S / A). En general, las semillas de la pADSC en las placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos para los adipocitos o la diferenciación osteocitos. Sembrar el pADSC en placas de 10 cm para la tinción de marcadores de superficie de las células madre o diferenciación de los condrocitos. Incubar las placas o platos en el incubador a 37ºC en aire con 5% de CO 2 para permitir la unión celular a las placas. 4. Identificación de células madre de la superficie de marcadores pADSC por Citometría de Flujo Después de 24 horas, eliminar completamente el medio, lavar THe 10-cm plato dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y las células de la cosecha con 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA durante 5 minutos a 37 ° C. Neutralizar la tripsina-EDTA con cantidades iguales de medio de cultivo (1 ml), recoger las células en un nuevo tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 400 xg durante 7 min. Se decanta el sobrenadante. Lavar el sedimento dos veces en 3 ml de tampón de FCS-lavado enfriado con hielo (PBS que contiene 10% de FBS) con re-suspensión mediante pipeteo junto con centrifugación a 400 xg durante 7 min. Volver a suspender, cuenta, y ajustar pADSC a 10 6 células / ml en tampón FCS-lavado enfriado con hielo. células de lugar (100 l / cada tubo) en múltiples tubos cónicos nuevos 15 ml e incubar los tubos que contienen pADSC a 4 ° C durante 30 min con anticuerpos contra cualquiera CD4a conjugado con ficoeritrina (CD4a-PE), CD29-PE, CD31-PE , CD44-PE, CD45-PE, CD90-PE, MHC I-PE o MHC II-PE para la tinción directa. Detener la reacción por lavado de las células dos veces en 10 ml de tampón de lavado-FCS junto con 400 × g centrifugation durante 7 minutos. Fijar y resuspender las células en tampón de fijación (PBS con 0,01% de FBS y 1% de formaldehído) para citometría de flujo de acuerdo con las instrucciones del fabricante y nuestra publicación anterior 18. 5. Diferenciación de pADSC en adipocitos, condrocitos y osteocitos La diferenciación de pADSC en adipocitos Preparar medio de inducción de los adipocitos y de un medio de mantenimiento de adipocitos Por medio de inducción de los adipocitos, preparar 1 l de DMEM / F12 libre de suero (con antibióticos de 1% P / S / A) que contiene lo siguiente: 1 ml madre de insulina (10 mg / ml de tampón HEPES, pH 8), concentración final = 10 mg / ml; 1 l de stock T3 (3,3 ', 5-triyodo-L-tironina, 1 mM en DMSO), concentración final = 1 nM; 200 l de transferrina de valores (50 mg / ml de H 2 O doblemente destilada), Concentración Final = 10 mg / ml; 100 l dexametasona madre (10 mM en etanol), Concentración Final = 1 M; 100 l rosiglitazona madre (10 mM en DMSO), conc= 1 mM. Preparar medio de mantenimiento de adipocitos con las mismas adiciones como el medio de inducción, pero con omisión de la dexametasona. La diferenciación de los adipocitos proceso Nota: Después de sembrar pADSC en placas de 6 pocillos, pADSC será confluentes en 72 h. Después de 3 días, se elimina el medio completo y luego añadir 3 ml de medio de inducción de adipocitos en cada pocillo. Volver las placas a la incubadora. Este es el día cero de la diferenciación. Después de 3 días, se elimina el medio de inducción de adipocitos por completo y reemplazarlo con 3 ml de medio de mantenimiento de adipocitos cada tres días. adipocitos maduros serán diferenciadas terminalmente por unos 9 días. Más del 90% de los adipocitos están bien diferenciadas usando este protocolo. Estos adipocitos están listos para Oil Red O tinción. La diferenciación de pADSC en osteocitos Preparar medio de inducción osteocitos: mediu de cultivo completom (DMEM / F12 con 10% de FBS y 1% P / S / A) que contiene 1 mM de dexametasona, 10 mM β-glicerofosfato y 50 mg / ml ascorbato-2-fosfato. proceso de diferenciación de los osteocitos Nota: Después de sembrar pADSC en placas de 6 pocillos, pADSC será confluentes en 72 h. Después de 3 días, retire completamente el medio y añadir 3 ml de medio de inducción osteocitos en cada pocillo. Volver las placas a la incubadora a 37ºC. Este es el día cero de la diferenciación. Sustituir por medio de inducción osteocitos cada tres días. osteocitos maduros se forman por 14 días de diferenciación. Estos osteocitos están listos para el rojo de alizarina S tinción. La diferenciación de pADSC en condrocitos Preparar medio de inducción de condrocitos: aMEM que contiene 1% de FBS, 6,25 mg / ml de insulina, 50 mg / ml ascorbato-2-fosfato, y 10 ng / ml factor de crecimiento transformante-β1. proceso de diferenciación de los condrocitos <ol> Después de sembrar pADSC en placas de cultivo de 10 cm por 24 h, eliminar el medio de cultivo por completo y lavar los platos dos veces con PBS. Trypsinize pADSC con 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA durante 5 min, y después neutralizar con medio de cultivo 1 ml. Recopilar, contar y ajustar pADSC en tubos de 15 ml cónicos con una densidad de 2,5 × 10 5 células por tubo. Use un hemocitómetro para contar las células. Después de centrifugación a 400 xg durante 7 min, descartar el sobrenadante sin perturbar el sedimento y se añade 1 ml de medio de inducción de condrocitos en un tubo de 15 ml. El tubo se devuelve a la incubadora a 37ºC. Este es el día cero de la diferenciación. Sustituir el medio de inducción de condrocitos cada tres días sin la eliminación de las células en la parte inferior. condrocitos maduros se forman en aproximadamente 14 días. Estos condrocitos están listos para el azul de toluidina O tinción. 6. La tinción de adipocitos diferenciados, Osteocytes y condrocitos Oil Red O tinción de adipocitos diferenciados Al día 9, eliminar medio de mantenimiento de adipocitos en placas de cultivo de 6 pocillos con adipocitos diferenciados y a continuación se lava la placa dos veces con PBS. [En los pasos siguientes, añada suficientes reactivos designados para cubrir cada pocillo de la placa de 6 pocillos.] Fijar los adipocitos con formalina al 10% durante al menos 10 min. Eliminar la solución de formalina al 10% y se lava la placa dos veces con agua bidestilada. Después de dos lavados, se añaden 100% de glicol de propileno a la placa de cultivo y se deja reposar durante 1 minuto. Retire el propilenglicol 100% y luego añadir la solución Oil Red O (0,5% en propilenglicol) a la placa de cultivo. Dejar reposar durante al menos 10 minutos en un agitador oscilante con agitación suave (100 rpm). Eliminar la solución de rojo aceite O y luego vuelva a colocar con un 60% de propilenglicol. Dejar reposar durante 1 minuto. Retire el propilenglicol al 60% y luego se lava la placa dos veces con dOBLE agua-destilada. Reemplazar con formalina al 10%. Las gotas de lípidos teñidas dentro de los adipocitos están listas para su observación al microscopio óptico. La cuantificación de intracelular Oil Red O (pasos opcionales siguientes): después de la observación microscópica, eliminar 10% de solución de formalina y se lava la placa dos veces con agua bidestilada. Escurrir la placa por completo y añadir 500 l de isopropanol a la placa de 6 pocillos. Deje reposar isopropanol en la placa de 6 pocillos en un agitador oscilante suave (100 rpm) durante al menos 10 minutos para disolver el colorante de Aceite Rojo O. Aspirar el isopropanol que contiene Oil Red O y distribuir en una placa de 96 pocillos. Cuantificar el extraída Oil Red O usando una lectura espectrofotométrica a 510 nm. Rojo de alizarina S tinción para osteocitos diferenciado En el día 14, retire el medio de inducción osteocitos a partir de placas de 6 pocillos con osteocitos diferenciadas y se lavan las placas dos veces con PBS. [En las following pasos, añadir suficientes reactivos designados para cubrir cada pocillo de la placa de 6 pocillos.] Fijar osteocitos en solución de formalina al 10% durante al menos 10 min. Eliminar la solución de formalina al 10% de cada pocillo y se lava la placa dos veces con agua bidestilada. Después de dos lavados, añadir 2% de solución de rojo de alizarina S (pH = 4,1-4,3) a la placa de 6 pocillos y dejar reposar durante al menos 15 minutos en un agitador oscilante suave (100 rpm). Eliminar la solución de rojo de alizarina S y luego lavar la placa dos veces con agua bidestilada. Reemplazar con formalina al 10%. Osteocitos están listas para su observación al microscopio óptico. Azul de toluidina O tinción de condrocitos diferenciados Al día 14, el medio aspirado de condrocitos inducción del tubo cónico de 15 ml sin la eliminación de los sedimentos de condrocitos diferenciados en el fondo del tubo y se lava el tubo dos veces con PBS. [En los pasos siguientes, añada suficientes reactivos designados en calar condrocitos en la parte inferior del tubo o de la sección de diapositivas.] Fijar condrocitos en solución de formalina al 10% durante al menos 10 min. Eliminar la solución de formalina al 10% de cada tubo y se lava el tubo dos veces con agua bidestilada. Después de dos lavados, incrustar pellets en octubre Compuesto y la sección con un criostato con un espesor de 5 micras. Tinción de la corredera de las secciones de criostato con una solución de azul de toluidina O (0,1% con pH 4,1). Eliminar la solución de azul de toluidina O y luego lavar la sección dos veces con agua bidestilada. Nota: Los condrocitos en las diapositivas están listas para su observación al microscopio óptico.