Isolamento e differenziazione delle cellule staminali derivate da tessuto adiposo sottocutaneo da Suini tessuti adiposi

Nota: Questo metodo è stato stabilito e utilizzato nella ricerca riportata in precedenza 14-17 da questo laboratorio; nel corso del tempo è stata modificata la metodologia. L'attuale procedura è stata eseguita utilizzando una media di 60 g di tessuto adiposo sottocutaneo suina da un suinetto (7 a 9 giorni) con semina il 6-pozzetti di coltura tissutale. Tutte le procedure sono state eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) al National Taiwan University. 1. Preparare digestione Media Ottenere tessuto adiposo sottocutaneo del collo e della schiena; 40 a 80 g per suinetto (7 a 9 giorni di età), a seconda delle dimensioni dei suini. Qui, utilizzare 60 g di tessuto adiposo sottocutaneo ottenuti da un suino. Preparare medio digestione: pesare collagenasi II in polvere con un totale di 54.000 unità e scioglierlo in 90 ml di Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM,per 60 g di grasso) in un flacone da 100 ml sierologico (900 unità di collagenasi / 1,5 ml DMEM / g di grasso). Agitare delicatamente il mezzo di digestione su un tavolo shaker (100 rpm) per almeno 15 minuti per sciogliere e quindi passare il mezzo di digestione attraverso un filtro di 0,22 micron per la sterilizzazione. Conservare a 4 ° C prima dell'uso. 2. Dissect sottocutaneo adiposo tessuti dai suini Sterilizzare tutti gli strumenti, vetro e oggetti in plastica e caldo tutti i media a 37 ° C prima dell'uso. Sacrificare il maialino con elettrica dissanguamento mozzafiato e oppure utilizzando un metodo in conformità con le normative locali IACUC. Eseguire con attenzione e subito dopo la dissezione maialini vengono sacrificati. Posare il maialino su un tavolo operatorio pulito (posteriore rivolto verso l'alto e verso il basso ventre). Radersi i capelli dal porcellino indietro rimuovendo tutti i capelli dal collo alla coda e su entrambi i lati fino alla linea mediana. Scrub pelle dorsale del maiale con il 7,5% povidoneiodio tre volte (con tre nuovi indipendenti-scrub) e quindi consentire lo iodio per sedersi sulla superficie della pelle per circa 10 min. Rimuovere il iodopovidone con più spruzzi di etanolo al 70%. Utilizzare garze o veline che contengono il 70% di etanolo per pulire la pelle in una direzione, ripetendo fino a quando non si osservano colore evidente di iodopovidone. Utilizzare un bisturi per separare lo strato di grasso dorsale suino da tessuti adiposi sottocutanei insieme con lo strato di pelle attaccata dai muscoli mentre si tiene il grasso e la pelle con pinze. immergere immediatamente lo strato di grasso da tessuti adiposi sottocutanei con pelle attaccato in un becher sterilizzato (200 ml) contenente DMEM senza siero. Spruzzare la parte esterna del bicchiere contenente lo strato di grasso con il 70% di etanolo e posto in una cappa di coltura cellulare a flusso laminare. Mettere un grande (40 cm x 30 cm) sterilizzato triplo strato di foglio di copertura nella cappa. [Un triplo strato è usato per assicurare l'integrità continua.] Posiziona ilil tessuto con la pelle rivolta verso il basso sul foglio di copertina. Tagliare il tessuto muscolare residua fuori del tessuto adiposo con pinze e forbici per evitare la contaminazione con il tessuto muscolare. Tagliare il grasso in pezzi quadrati (~ 7 cm x 7 cm) con un bisturi o forbici. Mettere questi pezzi di strato di grasso in un nuovo bicchiere sterilizzato (200 ml) contenente DMEM senza siero. Impostare un supporto fetta personalizzato sulla pellicola coperchio montato con una lama affettatrice in acciaio al carbonio (Figura 1). Prendere un pezzo di grasso fuori del bicchiere e posizionarlo sul affettatrice (strato di pelle sulla parte superiore e grassi strato sottostante). Tagliare lo strato di grasso da tessuti adiposi sottocutanei in circa 1 millimetro di spessore pezzi. Tagliare lo strato di grasso dalla pelle più vicino possibile, ma evitare affettare la pelle. Mince affettato tessuti adiposi con le forbici più fine possibile. Aggiungere mezzo digestione filtrato contenente collagenasi a una beuta da 250 ml o una bottiglia sierologico con tritatotessuti adiposi (54.000 unità di collagenasi / 90 ml DMEM / 60 g di grasso). Incubare e agitare beuta a 45 rpm in un agitatore orbitale per 90 min a 37 ° C per permettere la collagenasi di digerire i tessuti. Nota: Controllare ogni 15 a 30 minuti per evitare un eccesso di digestione. Il processo di digestione si completa se il mezzo di digestione è un impasto senza grumi di tessuto significativi. Aggiungere un volume uguale (uguale al mezzo digestione) di terreno di coltura contenente DMEM / F12 con il 10% di siero fetale bovino (FBS) per arrestare la digestione collagenasi. Figura 1. Una affettatrice personalizzato utilizzato per l'isolamento di pADSC. Dissected tessuti adiposi da suino dorsali tessuti adiposi sottocutanei sono composti dello strato di grasso con strati di pelle attaccati. Una affettatrice è necessaria per tagliare lo strato di grasso di circa 1 millimetro di spessore con evitamento di sovra-affettare negli strati della pelle. Da sinistra a destra: titolare fetta, pad affettatrice, lama in acciaio al carbonio affettatrice, e le viti. Lama affettatrice è inserito tra il titolare fetta e pad affettatrice quando assemblato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 3. Raccolta di pADSC dalla frazione stromale-vascolare Passare il mezzo di digestione contenente tessuti adiposi digeriti attraverso un singolo strato di chiffon in un matraccio da 250 ml Erlenmeyer pulito sterilizzato o una bottiglia sierologico 250 ml. Utilizzare una pinza a deprimere la metà del chiffon per guidare e assistere il passaggio del digest. Scolare e torcere la chiffon con una pinza per completare il passaggio. Distribuire il mezzo di digestione in quattro provette da 50 ml per centrifuga coniche (~ media 40 ml per provetta). Centrifugare a 700 xg per 10 minuti per raccogliere il pellet di cellule stromali-vascolare. <li> Decantare il surnatante senza disturbare il pellet per rimuovere la maggior parte dello strato di grasso superiore contenente adipociti maturi. Lavare il pellet aggiungendo 10 ml DMEM in ciascuna provetta per risospendere il pellet con pipettaggio e leggero scuotimento del tubo. Centrifugare a 700 g per 6 min. Decantare il surnatante. Aggiungere 10 ml di tampone di lisi ACK e poi risospendere il pellet pipettando. Lasciare riposare per 7 minuti (da 5 a 10 min) a temperatura ambiente per lisare i globuli rossi nella frazione stromale-vascolare. Aggiungere stessa quantità di DMEM (10 ml) per arrestare la reazione agitando delicatamente del tubo e centrifugare a 700 xg per 10 min. Decantare il surnatante, aggiungere 10 ml di DMEM in ogni provetta, risospendere il pellet con ripetuti pipettaggio, e centrifugare a 700 g per 6 min. Ripetere due volte. Raccogliere e passare il DMEM (totale di 40 ml DMEM da 4 tubi in rappresentanza di 60 g di grasso) con le cellule in sospensione attraverso un colino 100 micron in un nuovo tubo da 50 ml. Delicatamente pipetta medium più volte per mescolare bene e un'aliquota di 20 ml di mezzo di cellule contenenti mescolato con 180 ml di soluzione di blu trypan 0,4% (diluizione 1:10) in un nuovo 1,5 ml provetta Eppendorf. Contare le cellule con un emocitometro e poi seme pADSC ad una densità di 60.000 cellule / cm 2 su un formato desiderata del piatto cultura o piastra con terreno di coltura contenente DMEM / F12, 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di antibiotici di penicillina soluzione B -streptomycin-amfotericina (P / S / A). In generale, seminare il pADSC sui 6 pozzetti piastre di coltura dei tessuti per adipociti o differenziazione osteociti. Seed il pADSC su piatti di 10 cm per marcatore di superficie colorazione delle cellule staminali o di differenziazione dei condrociti. Incubare le piastre o piatti nel 37 ° C incubatore in aria con 5% di CO 2 per consentire l'adesione delle cellule alle piastre. 4. Identificazione di superficie sulle cellule staminali Marcatori di pADSC mediante citometria di flusso Dopo 24 ore, rimuovere completamente il medium, lavare °e 10-cm pietanza due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), e le cellule raccolto con 1 ml di 0,25% tripsina-EDTA per 5 min a 37 ° C. Neutralizzare tripsina-EDTA con pari quantità di terreno di coltura (1 ml), raccogliere le cellule in una nuova provetta conica da 15 ml e centrifugare a 400 g per 7 min. Decantare il surnatante. Lavare il pellet due volte in 3 ml di tampone FCS-wash ghiacciata (PBS contenente 10% FBS) utilizza risospensione pipettando accoppiata con centrifugazione a 400 xg per 7 minuti. Risospendere, contare, e regolare pADSC a 10 6 cellule / ml in tampone FCS-lavaggio ghiacciata. Cellule posto (100 microlitri / ogni provetta) in più nuove provette coniche da 15 ml e incubare provette contenenti pADSC a 4 ° C per 30 min con anticorpi contro sia CD4a ficoeritrina coniugata (CD4a-PE), CD29-PE, CD31-PE , CD44-PE, CD45-PE, CD90-PE, MHC I-PE o MHC II-PE per la colorazione diretta. Arrestare la reazione lavando le cellule due volte in 10 ml di tampone FCS-lavaggio accoppiato con 400 × g centrifugationico per 7 min. Fissare e risospendere le cellule in tampone di fissaggio (PBS con 0,01% FBS e 1% di formaldeide) per citometria a flusso in base alle istruzioni del produttore e la nostra precedente pubblicazione 18. 5. La differenziazione di pADSC in adipociti, Osteociti e condrociti Differenziazione delle pADSC in adipociti Preparare induzione a media degli adipociti e terreno di mantenimento degli adipociti Per induzione a media degli adipociti, preparare 1 L di DMEM / F12 senza siero (con antibiotici di 1% P / S / A) contenente le seguenti: 1 ml di insulina magazzino (10 mg / ml di tampone HEPES, pH 8), conc finale = 10 mg / ml; 1 ml T3 magazzino (3,3 ', 5-triiodo-L-thyronine, 1 mM in DMSO), conc def = 1 nM; 200 ml transferrina magazzino (50 mg / ml di H 2 O distillata), def conc = 10 mg / ml; 100 ml desametasone magazzino (10 mm di etanolo), conc def = 1 micron; 100 ml rosiglitazone magazzino (10 mM in DMSO), conc finale= 1 pM. Preparare adipociti terreno di mantenimento con le stesse aggiunte come mezzo di induzione, ma con omissione di desametasone. processo di differenziazione per adipociti Nota: dopo la semina pADSC su 6 pozzetti, pADSC sarà confluenti entro 72 ore. Dopo 3 giorni, rimuovere il supporto completamente e poi aggiungere 3 ml di terreno adipociti induzione in tutti i pozzetti. Riportare le piastre per l'incubatore. Questo è il giorno zero della differenziazione. Dopo 3 giorni, rimuovere il supporto di adipociti di induzione completamente e sostituirlo con 3 ml di terreno adipociti manutenzione ogni tre giorni. adipociti maturi saranno differenziate da circa 9 giorni. Oltre il 90% degli adipociti sono ben differenziati utilizzando questo protocollo. Questi adipociti sono pronti per Oil Red O colorazione. Differenziazione delle pADSC in osteociti Preparare medio osteociti induzione: completa mediu culturam (DMEM / F12 con 10% FBS e 1% P / S / A) contenente 1 mM dexametasone, 10 mM β-glicerofosfato e 50 ug / ml ascorbato-2-fosfato. processo di differenziazione per osteociti Nota: dopo la semina pADSC su 6 pozzetti, pADSC sarà confluenti entro 72 ore. Dopo 3 giorni, rimuovere il supporto completamente e aggiungere 3 ml di terreno osteociti induzione in tutti i pozzetti. Riportare le piastre per la 37 ° C incubatore. Questo è il giorno zero della differenziazione. Sostituire con media osteociti induzione ogni tre giorni. osteociti maturi formeranno da 14 giorni di differenziazione. Questi osteociti sono pronti per Alizarina Rossa S colorazione. La differenziazione di pADSC in condrociti Preparare medio di induzione di condrociti: αMEM contenente 1% FBS, 6,25 mg / ml di insulina, 50 mg / ml ascorbato-2-fosfato, e 10 ng / ml fattore di crescita trasformante-β1. processo di differenziazione per i condrociti <ol> Dopo la semina pADSC su piastre di coltura di 10 cm per 24 ore, togliere terreno di coltura completamente e lavare i piatti due volte con PBS. Trypsinize pADSC di 1 ml di 0,25% tripsina-EDTA per 5 min e quindi neutralizzare con terreno di coltura 1 ml. Raccogliere, contare e registrare pADSC in 15 ml provette coniche con una densità di 2,5 x 10 5 cellule per provetta. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule. Dopo centrifugazione a 400 g per 7 minuti, scartare il surnatante senza disturbare il pellet e aggiungere 1 ml di terreno condrociti induzione in un tubo da 15 ml. Il tubo viene restituito al incubatore a 37 °. Questo è il giorno zero della differenziazione. Sostituire il mezzo condrociti induzione ogni tre giorni senza rimuovere cellule sul fondo. condrociti maturi formeranno in circa 14 giorni. Questi condrociti sono pronti per blu di toluidina O colorazione. 6. colorazione di differenziata adipociti OsteocyTES e condrociti Oil Red O colorazione per adipociti differenziati Al giorno 9, rimuovere adipociti terreno di mantenimento in piastre di coltura 6 pozzetti con adipociti differenziati e poi lavare la piastra due volte con PBS. [Nei seguenti passaggi, aggiungere abbastanza reattivi designati per coprire ciascun pozzetto della piastra da 6 pozzetti.] Fissare adipociti con formalina al 10% per almeno 10 min. Rimuovere la soluzione di formalina al 10% e lavare la piastra due volte con acqua bidistillata. Dopo due lavaggi, aggiungere 100% glicole propilenico alla piastra di coltura e lasciare riposare per 1 min. Rimuovere il glicole propilenico 100% e quindi aggiungere la soluzione Oil Red O (0,5% in glicole propilenico) alla piastra di coltura. Lasciare riposare per almeno 10 minuti su un agitatore rocker con agitazione (100 rpm). Rimuovere la soluzione Oil Red O e quindi sostituire con il 60% di glicole propilenico. Lasciate riposare per 1 min. Rimuovere il glicole propilenico 60% e poi lavare la piastra due volte con dacqua ouble-distillata. Sostituire con formalina al 10%. Le goccioline lipidiche macchiate all'interno degli adipociti sono pronti per l'osservazione al microscopio ottico. Quantificazione dei intracellulare Oil Red O (passaggi facoltativi sotto): dopo l'osservazione microscopica, rimuovere il 10% soluzione di formalina e lavare la piastra due volte con acqua bidistillata. Scolate la piastra completamente e aggiungere 500 ml di isopropanolo al 6 pozzetti. Lasciare riposare isopropanolo nella piastra da 6 pozzetti in un agitatore rocker leggera (100 rpm) per almeno 10 minuti per sciogliere il colorante di Oil Red O. Aspirare il isopropanolo contenente Oil Red O e distribuire su una piastra a 96 pozzetti. Quantificare l'estratto Oil Red O utilizzando una lettura spettrofotometrica a 510 nm. Alizarina Rossa S colorazione per osteociti differenziata Al giorno 14, rimuovere medio osteociti induzione da 6 pozzetti con osteociti differenziati e lavare due volte le piastre con PBS. [Negli following passi, aggiungere abbastanza reattivi designati per coprire ciascun pozzetto della piastra da 6 pozzetti.] Fissare osteociti in formalina al 10% per almeno 10 min. Rimuovere la soluzione di formalina al 10% da ogni pozzetto e lavare la piastra due volte con acqua bidistillata. Dopo due lavaggi, aggiungere 2% Soluzione di rosso alizarina S (pH = 4,1-4,3) al 6 pozzetti e lasciate riposare per almeno 15 minuti su un agitatore rocker dolce (100 rpm). Rimuovere la soluzione Alizarina Rossa S e poi lavare la piastra due volte con acqua bidistillata. Sostituire con formalina al 10%. Osteociti sono pronti per l'osservazione al microscopio ottico. Blu di toluidina O colorazione per condrociti differenziate Al giorno 14, medie aspirare condrociti induzione dal tubo da 15 ml senza rimuovere sedimenti di condrociti differenziate nel fondo della provetta e lavare il tubo due volte con PBS. [Nei seguenti passaggi, aggiungere abbastanza reattivi designati Cover condrociti nella parte inferiore del tubo o sul vetrino sezione.] Fissare condrociti in formalina al 10% per almeno 10 min. Rimuovere la soluzione di formalina al 10% da ciascuna provetta e lavare il tubo due volte con acqua bidistillata. Dopo due lavaggi, incorporare pellets in OCT Compound e sezione con un criostato ad uno spessore di 5 micron. Macchia scorrimento delle sezioni al criostato con soluzione blu di toluidina O (0,1% a pH 4.1). Rimuovere la soluzione blu di toluidina O e poi lavare la sezione due volte con acqua bidistillata. Nota: I condrociti su diapositive sono pronti per l'osservazione al microscopio ottico.