العزلة وتمايز الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة من الخنزير تحت الجلد الدهنية الأنسجة
Summary
This protocol describes the isolation of pig adipose-derived stem cells (pADSC) from subcutaneous adipose tissues with examination of multipotency. The multipotent pADSC are used to delineate processes of adipocyte differentiation and study transdifferentiation into multiple cell lineages of mesodermal mesenchyme or further lineages of ectoderm and endoderm for regenerative studies.
Abstract
Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. Although numerous immortalized adipogenic cell lines have been established, adipose-derived stem cells from the stromal vascular fraction of subcutaneous white adipose tissues provide a reliable cellular system ex vivo much closer to adipose development in vivo. Pig adipose-derived stem cells (pADSC) are isolated from 7- to 9-day old piglets. The dorsal white fat depot of porcine subcutaneous adipose tissues is sliced, minced and collagenase digested. These pADSC exhibit strong potential to differentiate into adipocytes. Moreover, the pADSC also possess multipotency, assessed by selective stem cell markers, to differentiate into various mesenchymal cell types including adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. These pADSC can be used for clarification of molecular switches in regulating classical adipocyte differentiation or in direction to other mesenchymal cell types of mesodermal origin. Furthermore, extended lineages into cells of ectodermal and endodermal origin have recently been achieved. Therefore, pADSC derived in this protocol provide an abundant and assessable source of adult mesenchymal stem cells with full multipotency for studying adipose development and application to tissue engineering of regenerative medicine.
Introduction
السمنة، موجودة في حوالي 30٪ من السكان في الولايات المتحدة الأمريكية، مع مؤشر كتلة الجسم أكثر من 30، وقد برز بوصفه ظاهرة عالمية منتشرة 1. السمنة تميل إلى أن يؤدي إلى مضاعفات ذات الصلة بما في ذلك أمراض القلب والشرايين والسكري من النوع 2، والسرطان 2-4. لذلك، والتعامل مع السمنة هو أولوية هامة. ويتجلى البدانة والتوسع الهائل في الأنسجة الدهنية، والتي تعزى إلى استهلاك المفرط للطعام ونمط الحياة المستقرة في المجتمع الحديث. وبالتالي، فك رموز تنظيم النسخي من تكون الشحم وتكون الدهون يمكن أن تبشر لعلاج داء السكري أو السمنة 5.
وقد تم تطبيق 3T3-L1، 3T3-F442A وغيرها من الماوس مكون الشحم خطوط الخلايا لدراسة تكون الشحم أو تكون الدهون خلال تطوير الأنسجة الدهنية. ومع ذلك، هناك بعض التناقضات في الآليات التنظيمية بين خطوط الخلايا في المختبر، والحيوانات في الجسم الحي (6). الأساسي الدهنية-درعيالخلايا الجذعية فيد (ADSC) في الخلية جزء-انسجة الأوعية الدموية ويمكن أن تكون معزولة مباشرة من الأنسجة الدهنية البيضاء والتي يسببها للتمييز. تمايز ADSC في الخلايا الشحمية الأكثر احتمالا يلخص عملية تكون الشحم وتكون الدهون في تنمية الأنسجة الدهنية في الجسم الحي 7.
الخنازير هي نماذج حيوانية مناسبة لدراسة تكون الشحم وتكون الدهون في تنمية الأنسجة الدهنية. لدينا دراسات الخنازير السابقة 8-10 تثبت أن التعبير عن ستيرول تنظيمي ملزم عنصر عامل النسخ 1C (SREBP1c)، وهو عامل النسخ المهم المعروف أن تعدل النسخ من شحمي المنشأ سينسيز الأحماض الدهنية، وتحول دون الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة (بوفا) في الكبد الخنازير والأنسجة الدهنية. التعبير عن SREBP1c الخنازير بنسبة بوفا في المجراة في المختبر يشبه الأنواع الأخرى مثل البشر والفئران 11-13. هذه الدراسات الخنازير في المختبر هي في المقام الأول في مهرجان دبي السينمائي الدوليالخلايا الشحمية erentiated المستمدة من ADSC الخنازير (pADSC). لذلك، هذه الثقافة الخلية الأولية من pADSC يمكن استخدامها لتكون بمثابة نظام الهاتف الخلوي يمكن الاعتماد عليها لدراسة تطوير الأنسجة الدهنية أو غيرها من تطبيقات الخلايا الجذعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقدم نظام الهاتف الخلوي يمكن الاعتماد عليها لدراسة تطوير الأنسجة الدهنية في الثقافة الخلية الأولية من pADSC. بالمقارنة مع خطوط الخلايا الأخرى خلد، وهذه الطريقة توفر وسيلة مريحة لعزل كميات كبيرة من جودة عالية خلايا اللحمة المتوسطة الكبار الجذعية التي يمكن تطبيقها على دراسة عمليات تمايز الخلايا الشحمية أو غيرها من الأنساب الوسيطة ذات الصلة بالتنمية الحيوانية في الجسم الحي. الخطوة تعديل حاسمة في هذا البروتوكول هو أن نستمدها pADSC باستخدام خنزير صغير القديم 7- إلى 9 أيام لأنه من السهل التعامل معها خنزير صغير صغير بالمقارنة مع الخنازير القديمة وعلى غرار الأنواع الأخرى 19،20، والعائد وmultipotency من pADSC يتناقص ال 21 خنزير الأعمار.
وتشمل مصادر الخلايا الجذعية المحتملة الخلايا الجذعية الجنينية (ESC)، الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (IPSC)، والخلايا الجذعية البالغة بعد الولادة. القيد من ADSC، تصنف على أنها خلايا جذعية متعددة القدرات الكبار، هو أن multipotency من خلايا جذعية للبالغينفي التفريق بين السلالات المختلفة محدود نسبيا بالمقارنة مع ESC أو التوجيهية. ومع ذلك، والقضايا الأخلاقية المتعلقة اشتقاق ESC وأنكجنيك خصائص IPSC كبح تطبيق ESC وIPSC 22،23. لذلك، ركزت العديد من المحققين على الخلايا الجذعية للبالغين مع الجهود الرامية إلى تعزيز تعدد القدرات. المصدر الأكثر شيوعا من خلايا البالغين الجذعية الوسيطة (MSC)، التي طالما درس، والعظام المستمدة من نخاع الخلايا الجذعية الوسيطة 24. ومع ذلك، يعتبر حصد نخاع العظام إجراء مؤلم نسبيا. قلق آخر هو أن العائد من الخلايا الجذعية من نخاع العظم هو محدود. aspirates نخاع العظم العائد بمعدل 6 × 10 6 خلايا الأنوية لكل مل، وMSC تمثل سوى 0،001-0،01٪ من جميع الخلايا الأنوية. بعد النظر في هذه السلبيات، ويقترح ADSC كمصدر أقل فظاظة للحصول على خلايا جذعية متعددة القدرات 25،26.
القيود المفروضة على استخدام ADSC في regeneraTIVE الطب تعتمد إلى حد كبير على محصول الخلية والجودة. ولذلك، فإن أهمية توظيف الخنازير لعزل ADSC في هذا البروتوكول هو لانتاج كمية كبيرة من الخلايا الجذعية البالغة جودة عالية. الخنزير هو نموذج حيواني مفيد تمثل البشر بسبب حجم الجهاز مقارنة والعديد من أوجه التشابه الفسيولوجية والبيوكيميائية بين الأنواع 27-30. الحصول على hADSC من الشركات التجارية غير مكلفة وفي كثير من الحالات قد تم التلاعب بها الخلايا، passaged أو cryopreserved. الحصول على العينات السريرية البشرية من الصعب نسبيا بسبب قضايا أخلاقية وإنتاج ADSC محدودة. نحن نستمد حوالي 6 × 10 5 hADSC في غرام من الدهون بعد الهضم كولاجيناز. مع 100 غرام من الإناث الأنسجة الدهنية الثدي (متوسط أخذ العينات)، أي ما مجموعه 6 × 10 7 خلايا يمكن حصاده. باستخدام الماوس الفردية، والعائد محدودة أكثر. ما مجموعه 1 × 10 6 خلايا يمكن أن تحصد من 0.4 غرام من ط الماوس تحت الجلدالأنسجة الدهنية nguinal من مباراتي الذهاب والماوس FVB الكبار (6-8 أسابيع من العمر). ولكن في خنزير فرد واحد (7-9 أيام من العمر)، أي ما مجموعه 2 × 10 8 خلايا يمكن أن تحصد بسهولة من 60 غرام من الأنسجة الدهنية تحت الجلد تم الحصول عليها من ظهري مستودع الدهون. وpADSC المستمدة في هذا البروتوكول يكون الكامل الوسيطة من نوع multipotency وعلامات المناسبة الخلايا الجذعية الوسيطة. لذلك، pADSC هي مصدر مواتية للحصول على كميات كبيرة من الخلايا الجذعية للبالغين دون المساومة على جودة الخلايا الجذعية.
لا يقتصر تطبيق pADSC في فك رموز خلية شحمية التمايز بما في ذلك تكون الشحم وتكون الدهون. في الآونة الأخيرة، أصبحت ADSC مصدر شعبية للخلايا الجذعية في مجال 22،31،32 الطب التجديدي. بالمقارنة مع مصادر الخلايا الجذعية الأخرى، ADSC الاحتفاظ بميزة فريدة من التي يمكن الوصول إليها بسهولة وفيرة، وقد أثبتت multipotency من قوة ليكون مصدرا واعدا لعلاج الخلايا الجذعية والبريد الأنسجةngineering 22،33،34. لسهولة الوصول إليها من الأنسجة الدهنية يجعل ADSC واحدة من الطرق الأقل تدخلا للحصول على الأسلاف متعددة القدرات. في الآونة الأخيرة، ونحن متباينة pADSC في مجموعات إفراز الأنسولين الجلوكوز استجابة، مشيرا إلى أن pADSC لا تقتصر على الوسيطة التمايز (بيانات غير منشورة). كما تم تظاهر آخرون أن ADSC يمكن أن تكون متباينة في العديد من أنواع الخلايا المشتقة من طبقات جرثومية أخرى مثل خلايا الكبد الأديم الباطن (من hADSC 35 أو pADSC 36) أو الخلايا العصبية الأدمة (من hADSC 37 أو pADSC 38). وهكذا، pADSC يمكن استخدامها لمكافحة المخدرات والإنتاجية العالية أو فحص مادة بيولوجية عن طريق توجيه الخلايا لعمليات التمايز المتباينة لانتاج السلالات المرغوبة. لذلك، pADSC المستمدة في هذا البروتوكول لديهم إمكانية تطبيقها في العلاج بالخلايا الجذعية وزراعة الأنسجة لبحوث الطب التجديدي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أعرب عن امتناني لجميع أعضاء مختبر لمناقشة مستفيضة ويدعم تقنية في هذا البروتوكول. وأيد الأبحاث التي أجريت في المختبر من المنح المقدمة من وزارة العلوم والتكنولوجيا (MOST 103-2314-B-002-126 والأكثر 102-2313-B-002-026-MY3) ومن المنح المقدمة من هدف لخطة جامعة الأعلى (104R350144) من الجامعة الوطنية، تايوان.
Materials
| Reagents | |||
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-040 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-001-1 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B (P/S/A) solution | Biological Industries | 03-033-1 | For antibiotics and antimycotic usage |
| αMEM, no nucleosides | Life Technologies | 12561-049 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Life Technologies | 25200072 | |
| CD4a-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700063 | |
| CD29-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700398 | |
| CD31-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700467 | |
| CD44-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700183 | |
| CD45-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700483 | |
| CD90-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700686 | |
| HLA Class I-PE (MHC I) | Sigma-Aldrich | SAB4700640 | |
| HLA-DR-PE (MHC II) | Sigma-Aldrich | SAB4700662 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Rosiglitazone | Cayman | 71740 | |
| β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 49752 | |
| TGFB1 Recombinant Human Protein | R&D Systems | 240-B-002 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | 198161 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Carbon Steel Blades | Thomas Scientific | 6727C18 | |
| Falcon 100 µm cell strainer | Corning | 352360 | |
| Falcon 6-well plate | Corning | 353046 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 |
References
- Farese, R. V., Zechner, R., Newgard, C. B., Walther, T. C. The Problem of Establishing Relationships between Hepatic Steatosis and Hepatic Insulin Resistance. Cell Metab. 15, 570-573 (2012).
- Taubes, G. Cancer research. Unraveling the obesity-cancer connection. Science. 335 (28), 30-32 (2012).
- Apovian, C. M., Gokce, N. Obesity and cardiovascular disease. Circulation. 125, 1178-1182 (2012).
- Glass, C. K., Olefsky, J. M. Inflammation and lipid signaling in the etiology of insulin resistance. Cell Metab. 15, 635-645 (2012).
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis. Nature. 444, 847-853 (2006).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4, 263-273 (2006).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. J Vis Exp. , (2013).
- Hsu, J. M., Ding, S. T. Effect of polyunsaturated fatty acids on the expression of transcription factor adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1 and of lipogenic and fatty acid oxidation enzymes in porcine differentiating adipocytes. Brit J Nutr. 90, 507-513 (2003).
- Hsu, J. M., Wang, P. H., Liu, B. H., Ding, S. T. The effect of dietary docosahexaenoic acid on the expression of porcine lipid metabolism-related genes. J Anim Sci. 82, 683-689 (2004).
- Liu, B. H., Kuo, C. F., Wang, Y. C., Ding, S. T. Effect of docosahexaenoic acid and arachidonic acid on the expression of adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1 in differentiating porcine adipocytes. J Anim Sci. 83, 1516-1525 (2005).
- Ou, J. F., et al. Unsaturated fatty acids inhibit transcription of the sterol regulatory element-binding protein-1c (SREBP-1c) gene by antagonizing ligand-dependent activation of the LXR. P Natl Acad Sci USA. 98, 6027-6032 (2001).
- Sekiya, M., et al. Polyunsaturated fatty acids ameliorate hepatic steatosis in obese mice by SREBP-1 suppression. Hepatology. 38, 1529-1539 (2003).
- Xu, J., Nakamura, M. T., Cho, H. P., Clarke, S. D. Sterol regulatory element binding protein-1 expression is suppressed by dietary polyunsaturated fatty acids – A mechanism for the coordinate suppression of lipogenic genes by polyunsaturated fats. J Biol Chem. 274, 23577-23583 (1999).
- Ding, S. T., McNeel, R. L., Mersmann, H. J. Conjugated linoleic acid increases the differentiation of porcine adipocytes in vitro. Nutr Res. 20, 1569-1580 (2000).
- Ding, S., Mersmann, H. J. Fatty acids modulate porcine adipocyte differentiation and transcripts for transcription factors and adipocyte-characteristic proteins. J Nutr Biochem. 12, 101-108 (2001).
- Liu, L. R., et al. Serum amyloid A induces lipolysis by downregulating perilipin through ERK1/2 and PKA signaling pathways. Obesity (Silver Spring. 19, 2301-2309 (2011).
- Chen, Y. J., et al. Docosahexaenoic acid suppresses the expression of FoxO and its target genes. J Nutr Biochem. 23, 1609-1616 (2012).
- Lin, Y. Y., et al. Modulation of glucose and lipid metabolism by porcine adiponectin receptor 1-transgenic mesenchymal stromal cells in diet-induced obese mice. Cytotherapy. 15, 971-978 (2013).
- Schipper, B. M., Marra, K. G., Zhang, W., Donnenberg, A. D., Rubin, J. P. Regional anatomic and age effects on cell function of human adipose-derived stem cells. Ann Plast Surg. 60, 538-544 (2008).
- Efimenko, A., et al. Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells From Aged Patients With Coronary Artery Disease Keep Mesenchymal Stromal Cell Properties but Exhibit Characteristics of Aging and Have Impaired Angiogenic Potential. Stem Cell Transl Med. 3, 32-41 (2014).
- Akanbi, K. A., Brodie, A. E., Suryawan, A., Hu, C. Y. Effect of age on the differentiation of porcine adipose stromal-vascular cells in culture. J Anim Sci. 72, 2828-2835 (1994).
- Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise Review: Adipose-Derived Stem Cells as a Novel Tool for Future Regenerative Medicine. Stem Cells. 30, 804-810 (2012).
- Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Cir Res. 100, 1249-1260 (2007).
- Tobita, M., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived Stem Cells: Current Findings and Future Perspectives. Discov Med. 57, 160-170 (2011).
- Baer, P. C. Adipose-Derived Stem Cells and Their Potential to Differentiate into the Epithelial Lineage. Stem Cell Dev. 20, 1805-1816 (2011).
- Kakudo, N., et al. Adipose-derived regenerative cell (ADRC)enriched fat grafting: optimal cell concentration and effects on grafted fat characteristics. J Transl Med. 11, (2013).
- Lunney, J. K. Advances in swine biomedical model genomics. Int J Biol Sci. 3, 179-184 (2007).
- Prather, R. S., Lorson, M., Ross, J. W., Whyte, J. J., Walters, E. Genetically Engineered Pig Models for Human Diseases. Annu Rev Anim Biosci. 1, 203-219 (2013).
- Vodicka, P., et al. The miniature pig as an animal model in biomedical research. Ann Ny Acad Sci. 1049, 161-171 (2005).
- Wolf, E., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Transgenic Res. 20, 1150-1150 (2011).
- Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The Potential of Adipose Stem Cells in Regenerative Medicine. Stem Cell Rev Rep. 7, 269-291 (2011).
- Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100, 1249-1260 (2007).
- Cignarelli, A., et al. Human adipose tissue stem cells: relevance in the pathophysiology of obesity and metabolic diseases and therapeutic applications. Expert Rev Mol Med. 14, (2012).
- Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells: the great WAT hope. Trends Endocrinol Metab. 23, 270-277 (2012).
- Banas, A., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes. Hepatology. 46, 219-228 (2007).
- Bruckner, S., et al. A fat option for the pig: hepatocytic differentiated mesenchymal stem cells for translational research. Exp Cell Res. 321, 267-275 (2014).
- Anghileri, E., et al. Neuronal Differentiation Potential of Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Dev. 17, 909-916 (2008).
- Huang, T. T., He, D. S., Kleiner, G., Kuluz, J. Neuron-like differentiation of adipose-derived stem cells from infant piglets in vitro. J Spinal Cord Med. 30, S35-S40 (2007).
