בידוד ובידול של תאי גזע נגזר שומן מרקמות שומן תת עורי בשר חזירים

הערה: שיטה זו כבר נקבעה השתמשו במחקר שדווח בעבר 14-17 ממעבדה זו; לאורך זמן המתודולוגיה שונה. ההליך הנוכחי בוצע באמצעות ממוצע של 60 גרם של רקמות שומן התת עורית חזיריות מ חזרזיר אחד (7 עד 9 ימים) עם זריעה על צלחות תרבית רקמת 6 באר. כל הנהלים בוצעו ב RT אלא אם כן צוין אחרת. כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית השתמש (IACUC) בנשיונל טייוואן האוניברסיטה. 1. הכינו עיכול בינוני השג רקמות השומן התת עורית מן הצוואר והגב; 40 עד 80 גר 'לכל חזרזיר (7 עד 9 ימים), תלוי בגודל של החזירים. הנה, להשתמש 60 גרם של רקמות השומן התת עורית המתקבל חזיר אחד. הכן בינוני העיכול: לשקול אבקת collagenase השנייה עם סך של 54,000 יחידות לפזר אותו 90 מ"ל בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM,במשך 60 גרם שומן) בבקבוק סרולוגיות 100 מ"ל (900 יחידות של collagenase / 1.5 מ"ל שומן DMEM / g). בעדינות להתסיס את מדיום העיכול על שולחן שייקר (100 סל"ד) במשך 15 דקות לפחות לפזר ולאחר מכן לעבור את מדיום העיכול דרך פילטר 0.22 מיקרומטר עיקור. חנות ב 4 ° C לפני השימוש. 2. תת עורי לנתח ברקמות שומן מן החזירים לעקר את כל הכלים, הזכוכית כלי פלסטיק וחמה כל מדיה ל -37 מעלות לפני השימוש. להקריב את החזרזיר עם exsanguination ומהממת חשמל או באמצעות שיטה בהתאם לתקנות IACUC המקומיות. בצע לנתיחה בזהירות ומיד לאחר חזירונים מוקרבים. הנח את החזרזיר על שולחן כירורגית נקי (חזרה כלפי מעלה ובטן למטה). לגלח את השיער מן החזרזיר בחזרה הסרה כל השיער מהצוואר עד הזנב ומשני הצדדים עד קו האמצע. שפשף את עור הגב של החזיר עם 7.5% povidone-יוד שלוש פעמים (עם שלושה עלובי עצמאיים חדשים) ולאחר מכן לאפשר יוד לשבת על פני השטח של העור למשך כ -10 דקות. הסר את povidone- יוד עם תרסיסים מרובים של אתנול 70%. השתמש פדי גזה או ניירות רקמה המכילה אתנול 70% כדי לנגב את העור בכיוון אחד, לחזור עד אין צבע ברור של יוד povidone הוא ציין. השתמש אזמל להפריד את שכבת השומן הגבי חזירי של רקמות השומן התת עורית יחד עם שכבת העור המצורפת מהשרירים כשהוא אוחז את השומן והעור באמצעות מלקחיים. מייד לטבול את שכבת השומן של רקמות שומן התת עורית עם עור מצורף בכוס מעוקרת (200 מיליליטר) המכילה סרום ללא DMEM. תרסיס החיצוני של הכוס המכילה את שכבת השומן עם 70% אתנול ו מקום במנדף תרבית תאי זרימה למינרית. מניחים גדול (40 ס"מ x 30 ס"מ) מעוקרות רדיד כיסוי משולשת שכבה בתוך הכובע. [א שכבה משולשת משמשת כדי להבטיח שלמות מתמדת.] מניחים אתרקמה עם העור כלפי מטה על נייר הכסף לכסות. חתוך את רקמת השריר הנותרים הנחה של רקמת השומן באמצעות מלקחיים ומספריים כדי למנוע זיהום עם רקמת שריר. חותכים את השומן לחתיכות מרובעות (~ 7 ס"מ X 7 ס"מ) עם אזמל או מספריים. שים חתיכות אלה של שכבת השומן לתוך מבחנה מעוקרת חדשה (200 מיליליטר) המכילה סרום ללא DMEM. גדר בעל פרוסה אישית על נייר כסף הכיסוי התאסף עם להב מבצעה פלדת פחמן (איור 1). קח חתיכה אחת של שומן מן המבחנה ולמקם אותו על (שכבת עור על שכבה עליונה ושומן להלן) מבצעה. פורסים את שכבת השומן של רקמות השומן התת עורית לתוך כ חתיכות עבות 1 מ"מ. פורסים את שכבת השומן מהעור קרוב ככל האפשר, אך להימנע חיתוך העור. בשר טחון פרוס ברקמות שומן במספריים כמו קנס ככל האפשר. הוסף בינוני העיכול מסונן המכיל collagenase בבקבוק Erlenmeyer 250 מ"ל או בקבוק סרולוגית עם טחוןברקמות השומן (54,000 יחידות של collagenase / 90 מ"ל DMEM / 60 גרם שומן). דגירה ו מערבולת הבקבוק Erlenmeyer ב 45 סל"ד ב שייקר מסלולית במשך 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר collagenase לעכל את הרקמות. הערה: בדוק כל 15 עד 30 דקות כדי למנוע יתר מערכת העיכול. תהליך העיכול יושלם אם מדיום העיכול הוא תרחיף ללא גושי רקמות משמעותיים. הוסף נפח שווה (שווה מדיום העיכול) של מדיום התרבות המכיל DMEM / F12 עם בסרום שור עוברי 10% (FBS) כדי לעצור את עיכול collagenase. איור 1. מבצעה אישי המשמש לבידוד של pADSC. גזור רקמות שומן מרקמות שומן התת עורית הגבה חזיר מורכבות שכבת השומן עם שכבות עור מצורפות. מבצעה נדרש פורסים את שכבת השומן כ 1 מ"מ עובי עם הימנעות יתרחיתוך לתוך שכבות העור. משמאל לימין: בעל פרוסה, כרית מבצעה, להב מבצעה פחמן פלדה וברגים. להב מבצעה מוכנס בין בעל פרוסת כרית מבצעה כאשר התאספו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. אוסף 3. pADSC מן שבר סטרומה-וסקולרית לעבור את המדיום העיכול המכיל את רקמות השומן מתעכל דרך שכבה יחידה של שיפון לתוך בקבוק 250 מ"ל Erlenmeyer מעוקר נקי או בקבוק סרולוגיות 250 מ"ל. השתמש במלקחיים כדי לדכא באמצע השיפון כדי להדריך ולסייע חלוף לעכל. מסננים ולסובב שיפון עם מלקחיים כדי להשלים את המעבר. פזר מדיום העיכול לתוך צינורות צנטריפוגות חרוטים ארבעה 50 מיליליטר (~ 40 מיליליטר בינוני לכל צינור). צנטריפוגה ב XG 700 במשך 10 דקות כדי לאסוף את הגלולה של תאי דם סטרומה. <li> למזוג supernatant מבלי להפריע את הכדורים להסיר ביותר של שכבת השומן העליונה המכילה adipocytes הבוגר. שטפו את הכדור על ידי הוספת DMEM 10 מ"ל לתוך צינור אחד כדי resuspend גלולה עם pipetting ו רעד עדין של הצינור. צנטריפוגה ב XG 700 במשך 6 דקות. למזוג supernatant. הוסף 10 מ"ל חיץ ACK תמוגה ולאחר מכן resuspend גלולה ידי pipetting. תן לזה לעמוד 7 דקות (5 עד 10 דקות) ב RT כדי lyse כדוריות דם אדומות בשבריר וסקולרית-סטרומה. להוסיף כמויות שווות של DMEM (10 מיליליטר) כדי לעצור את התגובה עם רעד עדין של הצינור ואז צנטריפוגות ב XG 700 במשך 10 דקות. למזוג supernatant, להוסיף 10 מ"ל DMEM לתוך צינור אחד, resuspend גלולה עם pipetting חזר, ו צנטריפוגות ב XG 700 במשך 6 דקות. חזור פעמיים. אסוף ולהעביר את DMEM (הכולל של DMEM 40 מ"ל מ 4 צינורות המייצגים 60 גרם שומן) עם תאים מושעה דרך מסננת 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל חדש. Medi פיפטה בעדינותאממ כמה פעמים כדי לערבב היטב aliquot 20 μl של המדיום הסלולרי המכיל מעורבב עם 180 μl של פתרון כחול 0.4% trypan (01:10 דילול) בצינור 1.5 מ"ל Eppendorf חדש. ספירת התאים עם hemocytometer ואז זרע pADSC בצפיפות של 60,000 תאים / 2 סנטימטר על גודל רצוי של מנת תרבות או צלחת עם מדיום תרבות המכיל DMEM / F12, 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו אנטיביוטיקת 1% של פניצילין פתרון B -streptomycin-amphotericin (P / S / A). באופן כללי, זרע pADSC על צלחות תרבית הרקמה 6-גם עבור adipocyte או בידול osteocyte. זרעים pADSC על מנות של 10 ס"מ עבור מכתים סמן פני השטח של תאי גזע או הבידול הכונדרוציטים. דגירה צלחות או מנות בחממה 37 מעלות צלזיוס באוויר עם 5% CO 2 כדי לאפשר מצורף התא הצלחות. 4. זיהוי Surface בתאי גזע סמנים של pADSC ידי cytometry זרימה לאחר 24 שעות, להסיר את המדיום לחלוטין, לשטוף הדואר 10 ס"מ צלחת פעמיים עם בופר פוספט (PBS), ותאי הקציר עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין- EDTA במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לנטרל עם טריפסין-EDTA כמויות שוות של מדיום תרבות (1 מ"ל), לאסוף תאים צינור חרוטי 15 מ"ל חדש, ולאחר מכן צנטריפוגות ב g 400 × 7 דקות. למזוג supernatant. קר כקרח FCS-חיץ לשטוף שטפו את הכדור פעמיים ב 3 מ"ל (PBS המכיל 10% FBS) מחדש ההשעיה באמצעות ידי pipetting יחד עם צנטריפוגה ב 400 XG במשך 7 דקות. גלולה, לספור, ולהתאים pADSC עד 10 מ"ל 6 תאים / חיץ קר כקרח FCS-ווש. מקום תאים (100 μl / צינור אחד) לתוך צינורות חרוטי חדשים מרובים של 15 מ"ל ו דגירה צינורות המכילים pADSC ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עם נוגדנים נגד CD4a או Phycoerythrin מצומדות (CD4a-PE), CD29-PE, CD31-PE ,-PE CD44, CD45-PE, CD90-PE, MHC I-PE או MHC II-PE עבור מכתים ישיר. עצור את התגובה על ידי שטיפת התאים פעמיים ב 10 מ"ל חיץ FCS-לשטוף יחד עם 400 × גרם centrifugatיון 7 דקות. תקן ו resuspend התאים חיץ קיבעון (PBS עם FBS 0.01% לבין 1% פורמלדהיד) עבור cytometry הזרימה על פי הוראות היצרן ואת בפרסום הקודם שלנו 18. בידול 5. pADSC לתוך adipocytes, Osteocytes ו chondrocytes דיפרנציאציה של pADSC לתוך adipocytes כן בינוני אינדוקצית adipocyte ובינוני תחזוקת adipocyte לקבלת בינוני אינדוקציה adipocyte, להכין 1 ליטר של F12 סרום ללא DMEM / (עם אנטיביוטיקה של 1% P / S / A) המכיל את הפעולות הבאות: 1 מ"ל המניות אינסולין (10 מ"ג / מ"ל ​​חיץ HEPES, pH 8), קונצרט כלשהו הסופי = 10 מיקרוגרם / מ"ל; 1 μl מלאה T3 (3,3 ', 5 Triiodo-L-thyronine, 1 מ"מ DMSO), קונצרט כלשהו סופי = 1 ננומטר; 200 μl המניות transferrin (50 מ"ג / O מזוקקים H 2 כפול מ"ל), סופי קונצרט כלשהו = 10 מיקרוגרם / מ"ל; 100 המניות dexamethasone μl (10 מ"מ אתנול), סופי קונצרט כלשהו = 1 מיקרומטר; 100 מניות rosiglitazone μl (10 מ"מ DMSO), קונצרט כלשהו סופי= 1 מיקרומטר. כן בינוני תחזוקת adipocyte עם אותו התוספות כמדיום האינדוקציה, אבל עם חסרון של dexamethasone. תהליך בידול עבור adipocytes הערה: לאחר זריעת pADSC על 6 צלחות היטב, pADSC יהיה ומחוברות בתוך 72 שעות. לאחר 3 ימים, להסיר את המדיום לגמרי ואז להוסיף 3 מ"ל של מדיום אינדוקציה adipocyte לבאר כל אחד. החזר את הצלחות אל האינקובטור. זהו יום אפס של בידול. לאחר 3 ימים, להסיר את המדיום אינדוקציה adipocyte לחלוטין ולהחליף עם 3 מ"ל של מדיום תחזוקה adipocyte כל שלושה ימים. adipocytes הבוגר יהיה בדיל סופנים בכ 9 ימים. למעלה מ -90% של adipocytes הם מובחנים היטב באמצעות פרוטוקול זה. adipocytes אלה מוכנים מכתים O האדום השמן. דיפרנציאציה של pADSC לתוך osteocytes כן בינוני אינדוקצית osteocyte: mediu התרבות השלםמ '(DMEM / F12 עם 10% FBS ו -1% P / S / A) המכיל 1 מיקרומטר dexamethasone, 10 מ"מ β-glycerophosphate ו -50 מיקרוגרם / מ"ל ​​ascorbate-2-פוספט. תהליך בידול עבור osteocytes הערה: לאחר זריעת pADSC על 6 צלחות היטב, pADSC יהיה ומחוברות בתוך 72 שעות. לאחר 3 ימים, להסיר את המדיום לחלוטין ולהוסיף 3 מ"ל של מדיום אינדוקציה osteocyte לבאר כל אחד. החזר את הצלחות אל האינקובטור 37 מעלות צלזיוס. זהו יום אפס של בידול. החלף בינוני אינדוקציה osteocyte כל שלושה ימים. osteocytes למבוגרים יהווה ידי 14 ימים של בידול. osteocytes אלה מוכנים מכתים S האדום Alizarin. דיפרנציאציה של pADSC לתוך chondrocytes הכן בינוני אינדוקציה הכונדרוציטים: αMEM המכילים FBS 1%, 6.25 מיקרוגרם / מ"ל ​​אינסולין, 50 מיקרוגרם / 2-פוספט ascorbate מ"ל, ו -10 ng / ml הפיכת צמיחה-β1 גורם. תהליך בידול עבור chondrocytes <ol> לאחר זריעת pADSC על תרבות מנות של 10 ס"מ על 24 שעות, להסיר בינוני תרבות לחלוטין לשטוף כלים פעמיים עם PBS. Trypsinize pADSC עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין- EDTA במשך 5 דקות, ולאחר מכן לנטרל עם המדיום תרבות 1 מ"ל. אסוף, לספור ולהתאים pADSC ב 15 מיליליטר צינורות חרוטים עם צפיפות של 2.5 × 10 5 תאים לכל צינור. השתמש hemocytometer כדי לספור את התאים. לאחר צנטריפוגה ב g 400 × 7 דקות, לבטל את supernatant מבלי להפריע גלולה ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום אינדוקציה הכונדרוציטים בתוך שפופרת 15 מ"ל. הצינור הוא חזר 37 ° C החממה. זהו יום אפס של בידול. החלף את מדיום האינדוקציה הכונדרוציטים כל שלושה ימים מבלי להסיר תאים על הקרקעית. chondrocytes למבוגרים יהווה כ 14 ימים. chondrocytes אלה מוכנים מכתים O toluidine הכחול. 6. הכתמה של הבדיל adipocytes, Osteocytes ו chondrocytes שמן אדום O מכתים עבור adipocytes הבדיל ביום 9, להסיר בינוני תחזוקת adipocyte צלחות תרבות 6 היטב עם adipocytes בדיל ולאחר מכן לשטוף את הצלחת פעמים עם PBS. [בשלבים הבאים, להוסיף מספיק ריאגנטים המיועדת לכיסוי היטב בכל צלחת 6-היטב.] תקן adipocytes עם פתרון פורמלין 10% עבור 10 דקות לפחות. הסר את הפתרון פורמלין 10% ולשטוף את הצלחת פעמיים עם מים מזוקקים פעמיים. לאחר שתי שטיפות, להוסיף פרופילן גליקול 100% לצלחת התרבות ולתת לעמוד במשך דקות 1. הסר את גליקול 100% פרופילן ולאחר מכן להוסיף פתרון O האדום השמן (0.5% ב פרופילן גליקול) לצלחת התרבות. תנו להחזיק מעמד לפחות 10 דקות על שייקר נדנדה עם תסיסה עדינה (100 סל"ד). הסר את פתרון O האדום השמן ולאחר מכן להחליף עם פרופילן גליקול 60%. בואו לעמוד 1 דקות. הסר את גליקול 60% פרופילן ולאחר מכן לשטוף את הצלחת פעמיים עם דouble-מים מזוקקים. חלף עם פתרון פורמלין 10%. טיפות השומנים המוכתמות הפנימיות של adipocytes מוכנות לצורך השגחה על ידי מיקרוסקופ אור. כימות של שמן תאיים האדום O (שלבים אופציונליים להלן): לאחר תצפית מיקרוסקופית, להסיר 10% פתרון בפורמלין לשטוף את הצלחת פעמיים עם מים מזוקקים פעמיים. מסננים את הצלחת לחלוטין ולהוסיף 500 μl של isopropanol לצלחת 6 באר. בואו isopropanol לעמוד צלחת 6-היטב על שייקר נדנדה עדינה (100 סל"ד) למשך 10 דקות לפחות כדי לפזר את צבען של O. האדום השמן לשאוב את isopropanol המכיל שמן האדום O ולהפיץ בצלחת 96-היטב. לכמת את O האדום שמן חילוץ באמצעות קריאה spectrophotometric ב 510 ננומטר. Alizarin האדום S מכתים עבור osteocytes הבדיל ביום 14, להסיר בינוני osteocyte אינדוקציה מ 6 צלחות היטב עם osteocytes מבודל לשטוף את הצלחות פעמיים עם PBS. [ב following שלבים, להוסיף מספיק ריאגנטים המיועדת לכיסוי היטב בכל צלחת 6-היטב.] תקן osteocytes בתמיסת פורמלין 10% עבור 10 דקות לפחות. הסר את הפתרון פורמלין 10% מכל טוב לשטוף את הצלחת פעמיים עם מים מזוקקים פעמיים. לאחר שתי שטיפות, ולהוסיף פתרון האדום S 2% Alizarin (pH = 4.1-4.3) לצלחת 6-היטב ולתת לעמוד במשך 15 דקות לפחות על שייקר נדנדה עדין (100 סל"ד). הסר את הפתרון האדום S Alizarin ולאחר מכן לשטוף את הצלחת פעמיים עם מים מזוקקים פעמיים. חלף עם פתרון פורמלין 10%. Osteocytes מוכן לצורך השגחה על ידי מיקרוסקופ אור. Toluidine מכתים כחול O עבור chondrocytes הבדיל באותו יום 14, בינוני אינדוקציה הכונדרוציטים לשאוב מהצינור חרוטי 15 מ"ל מבלי להסיר משקעים של כונדרוציטים הבדיל בתחתית הצינור ולשטוף את הצינור פעמיים עם PBS. [בשלבים הבאים, להוסיף מספיק ריאגנטים מיועדים Cover chondrocytes בתחתית הצינור או בשקופית סעיף.] תקן chondrocytes בתמיסת פורמלין 10% עבור 10 דקות לפחות. הסר את הפתרון פורמלין 10% מהצינור כל ולשטוף את הצינור פעמיים עם מים מזוקקים פעמיים. לאחר שתי שטיפות, להטביע כדורים במתחם אוקטובר וסעיף עם cryostat בעובי של 5 מיקרומטר. הכתם את השקופית של סעיפי cryostat עם פתרון הכחול O toluidine (0.1% עם pH 4.1). הסר פתרון כחול O toluidine ולאחר מכן לשטוף את סעיף פעמיים עם מים מזוקקים פעמיים. הערה: chondrocytes בשקופיות מוכנה לצורך השגחה על ידי מיקרוסקופ אור.