Isolatie en differentiatie van vetcellen afgeleide stamcellen uit Porcine Onderhuids vetweefsel

Opmerking: deze methode is vastgesteld en gebruikt in het onderzoek meldde eerder 14-17 van dit laboratorium; na verloop van tijd de methodologie werd aangepast. De huidige procedure werd uitgevoerd met een gemiddelde van 60 g varkens onderhuidse vetweefsels van een biggetje (7-9 dagen oud) met zaaien op 6-putjes weefselkweekplaten. Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders aangegeven. Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) bij National Taiwan University. 1. Bereid Spijsvertering Medium Verkrijgen onderhuidse vetweefsel van de nek en rug; 40 tot 80 g per big (7-9 dagen oud), afhankelijk van de grootte van de varkens. Hier, gebruik maken van 60 g van het onderhuidse vetweefsel verkregen uit één varken. Bereid spijsvertering medium: weeg collagenase II poeder met een totaal van 54.000 eenheden en oplossen in 90 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM,60 g vet) in een 100 ml fles serologische (900 eenheden collagenase / 1,5 ml DMEM / g vet). Schud het digestiemedium op een schudtafel (100 opm) gedurende ten minste 15 min op te lossen en vervolgens de vertering medium door een 0,22 urn filter voor sterilisatie. Bewaar bij 4 ° C voor gebruik. 2. Dissect Onderhuids vetweefsel van varkens Steriliseer alle instrumenten, glas en plastic ware en warm alle media tot 37 ° C voor gebruik. Offeren biggetje met elektrische verdoving en leegbloeden of met een werkwijze volgens de plaatselijke IACUC voorschriften. Voer dissectie zorgvuldig en direct na biggen worden opgeofferd. Leg de biggen op een schone chirurgische tabel (terug naar boven en de buik naar beneden). Afscheren het haar van de big terug verwijderen van al het haar van de nek tot de staart en aan beide zijden tot aan de middellijn. Schrob het varken dorsale huid met 7,5% povidone-jood driemaal (met drie nieuwe onafhankelijke scrubs), waarna het jodium op de oppervlakte van de huid zitten voor ongeveer 10 minuten. Verwijder de povidonjood met meerdere sprays van 70% ethanol. Gebruik gaasjes of toiletpapier met 70% ethanol om de huid te reinigen van een richting, herhalen totdat geen duidelijke kleur van povidonjood waargenomen. Gebruik een scalpel varkens dorsale vetlaag van onderhuidse vetweefsels scheiden samen met de aangehechte huidlaag van de spieren terwijl het vet en huid behulp van een tang. Onmiddellijk dompel de vetlaag van het onderhuidse vetweefsel met aangehechte huid in een gesteriliseerde bekerglas (200 ml) met serumvrij DMEM. Spuit de buitenzijde van de beker die de vetlaag met 70% ethanol en in een laminaire stroming kap celkweek. Zet een grote (40 cm x 30 cm) gesteriliseerd drielaagse afdekfolie in de kap. [Een driedubbele laag wordt gebruikt om continue integriteit.] Plaats deweefsel met de huid naar beneden op de afdekfolie. Snijd de resterende spierweefsel af van het vetweefsel met behulp van pincet en een schaar om besmetting met spierweefsel te voorkomen. Snijd het vet in vierkante stukjes (~ 7 cm x 7 cm) met een scalpel of schaar. Deze verdelen van de vetlaag in een nieuwe gesteriliseerde bekerglas (200 ml) met serumvrij DMEM. Stel een aangepaste slice houder op de afdekfolie geassembleerd met een koolstofstalen snijmachine mes (figuur 1). Neem een ​​stuk van vet uit de beker en plaats het op de snijmachine (huidlaag bovenop en vetlaag onder). Snijd de vetlaag van het onderhuidse vetweefsel in ongeveer 1 mm dikke stukken. Snijd de vetlaag van de huid zo dicht mogelijk, maar voorkomen doorsnijden van de huid. Gehakt gesneden vetweefsel met schaar zo fijn mogelijk. Voeg gefilterd spijsvertering medium dat collagenase een erlenmeyer van 250 ml of een serologische fles met gehaktvetweefsel (54.000 eenheden van collagenase / 90 ml DMEM / 60 g vet). Incubeer en schud de kolf bij 45 rpm in een orbitale schudder gedurende 90 min bij 37 ° C om de collagenase om de weefsels te verteren. Opmerking: Controleer elke 15 tot 30 minuten om te voorkomen dat over-vergisting. Het verteringsproces is afgerond als de spijsvertering medium is een suspensie zonder noemenswaardige weefsel klonten. Voeg een gelijk volume (gelijk aan de digestiemedium) of kweekmedium dat DMEM / F12 met 10% foetaal runderserum (FBS) aan de collagenase digestie stoppen. Figuur 1. Een aangepast snijmachine gebruikt voor isolatie van pADSC. Ontlede vetweefsel van varkens dorsale subcutane vetweefsel bestaan ​​uit de vetlaag met aangrenzende huidlagen. Een snijmachine is vereist om de vetlaag ongeveer 1 mm dik met vermijden van over- snijdensnijden in de huidlagen. Van links naar rechts: De plak van de houder, snijmachine pad, koolstofstaal snijmachine mes en schroeven. Snijmachine blad wordt tussen slice houder en snijmachine pad als het wordt gemonteerd geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 3. Inning van pADSC uit de stromale-vasculaire Fraction Voorbij de vertering medium dat het gedigereerde vetweefsel door een enkele laag van chiffon in een schone gesteriliseerde 250 ml Erlenmeyer of 250 ml serologische fles. Gebruik een tang om het midden van de chiffon te begeleiden en de passage van de digest te helpen drukken. Giet ze af en draai de chiffon met een tang om doorgang te voltooien. Verdeel de vertering medium in vier 50 ml conische centrifugebuizen (~ 40 ml medium per buis). Centrifugeer bij 700 xg gedurende 10 min naar het pellet van stromale-vasculaire cellen te verzamelen. <li> Verwijder de bovendrijvende vloeistof zonder de pellets te verstoren meeste van de bovenste vetlaag die mature adipocyten te verwijderen. Was de pellet door toevoeging van 10 ml DMEM aan elke buis om de pellet door pipetteren en zachtjes schudden van de buis te resuspenderen. Centrifugeer bij 700 xg gedurende 6 min. Schenk de bovenstaande vloeistof. Voeg 10 ml ACK lysis buffer en resuspendeer de pellet door pipetteren. Laten staan ​​7 minuten (5-10 min) bij kamertemperatuur om rode bloedcellen te lyseren in de stromale-vasculaire fractie. Voeg gelijke hoeveelheden DMEM (10 ml) aan het reactiemengsel onder zachtjes schudden van de buis te stoppen en centrifugeer bij 700 xg gedurende 10 min. Decanteer het supernatant, voeg 10 ml DMEM aan elke buis, resuspendeer de pellet met herhaalde pipetteren en centrifugeer bij 700 xg gedurende 6 min. Herhaal dit twee keer. Verzamelen en passeren de DMEM (totaal 40 ml DMEM vanaf 4 buizen die 60 g vet) met gesuspendeerde cellen door een 100 urn zeef in een nieuwe 50 ml conische buis. Voorzichtig pipet medium meerdere malen goed en aliquot meng 20 pl celbevattende medium gemengd met 180 ul 0,4% trypan blauwe oplossing (1:10 verdunning) in een nieuwe 1,5 ml Eppendorf buis. Tel de cellen met een hemocytometer en zaad pADSC bij een dichtheid van 60.000 cellen / cm2 op een gewenste grootte van kweekschaal of platen met kweekmedium dat DMEM / F12, 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% antibiotica penicilline -streptomycin-amfotericine B oplossing (P / S / A). In het algemeen, het zaad van de pADSC op de 6-well weefselkweek platen voor adipocyten of osteocyt differentiatie. Het zaad van de pADSC op 10-cm schalen voor oppervlakte marker kleuring van stamcellen of chondrocyten differentiatie. Incubeer de platen of schotels in de 37 ° C incubator in lucht met 5% CO2 tot celhechting aan de platen mogelijk. 4. Identificatie Stem-celoppervlaktemerkers van pADSC door flowcytometrie Na 24 uur, volledig verwijderen van het medium, th wassene 10-cm schaaltje tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), en oogsten cellen met 1 ml 0,25% trypsine-EDTA gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Neutraliseren trypsine-EDTA met gelijke hoeveelheden kweekmedium (1 ml), laat cellen in een nieuwe 15-ml conische buis en centrifugeer bij 400 xg gedurende 7 minuten. Schenk de bovenstaande vloeistof. Was de pellet twee keer in 3 ml ijskoude FCS-wasbuffer (PBS dat 10% FBS) middels resuspensie door pipetteren gekoppeld aan centrifugatie bij 400 xg gedurende 7 min. Resuspendeer, tellen, en pas pADSC tot 10 6 cellen / ml in ijskoud FCS-wasbuffer. Plaats cellen (100 pl / per buisje) in meerdere nieuwe 15-ml conische buis en incubeer buisjes die pADSC bij 4 ° C gedurende 30 min met antilichamen tegen ofwel phycoerythrine-geconjugeerd CD4a (CD4a-PE), CD29-PE, CD31-PE , CD44-PE, CD45-PE, CD90-PE, MHC I-PE of MHC II-PE voor directe kleuring. Stop de reactie door het wassen van de cellen tweemaal in 10 ml FCS-wasbuffer in combinatie met 400 × g centrifugation gedurende 7 min. Fix en resuspendeer cellen fixatie buffer (PBS met 0,01% FBS en 1% formaldehyde) voor flowcytometrie volgens de instructies van de fabrikant en onze eerdere publicatie 18. 5. Differentiatie van pADSC tot adipocyten, Osteocyten en chondrocyten Differentiatie van pADSC tot adipocyten Bereid adipocyten inductie medium en adipocyten onderhoud medium Voor adipocyten inductiemedium bereiden 1 L serumvrij DMEM / F12 (met antibiotica van 1% P / S / A) het volgende bevat: 1 ml insuline voorraad (10 mg / ml HEPES buffer, pH 8), eindconc = 10 ug / ml; 1 pl T3 voorraad (3,3 ', 5-trijood-L-thyronine, 1 mM in DMSO), eindconcentratie = 1 nm; 200 pl stock transferrine (50 mg / ml dubbel gedestilleerd H2 O), eindconcentratie = 10 ug / ml; 100 ul dexamethason voorraad (10 mmol in ethanol), eindconcentratie = 1 micrometer; 100 ul rosiglitazon voorraad (10 mM in DMSO), final conc= 1 uM. Bereid adipocyten onderhoudsmedium met dezelfde toevoegingen als inductiemedium, maar met weglaten van dexamethason. Differentiatie proces voor adipocyten Let op: Na het zaaien pADSC op 6-well platen, zal pADSC worden confluent binnen 72 uur. Na 3 dagen Verwijder het medium volledig en voeg 3 ml adipocyten inductie medium in elk putje. Zet de platen in de incubator. Dit is dag nul van differentiatie. Na 3 dagen, verwijder de adipocyten inductie medium volledig en te vervangen door 3 ml van adipocyten onderhoud medium om de drie dagen. Volwassen adipocyten zullen terminaal gedifferentieerd worden met ongeveer 9 dagen. Meer dan 90% van de adipocyten zijn goed gedifferentieerd gebruik van dit protocol. Deze adipocyten zijn klaar voor Oil Red O kleuring. Differentiatie van pADSC in osteocyten Bereid osteocyt inductie medium: compleet cultuur medium (DMEM / F12 met 10% FBS en 1% P / S / A) met 1 uM dexamethason, 10 mM β-glycerofosfaat en 50 pg / ml ascorbaat-2-fosfaat. Differentiatie proces voor osteocyten Let op: Na het zaaien pADSC op 6-well platen, zal pADSC worden confluent binnen 72 uur. Na 3 dagen, verwijder het medium volledig en voeg 3 ml osteocyt inductie medium in elk putje. Zet de platen om de 37 ° C incubator. Dit is de dag nul van differentiatie. Vervang osteocyt inductie medium om de drie dagen. Volwassen osteocyten zal vormen met 14 dagen van differentiatie. Deze osteocyten zijn klaar voor alizarinerood S kleuring. Differentiatie van pADSC tot chondrocyten Bereid chondrocyten inductie medium: aMEM bevattende 1% FBS, 6,25 ug / ml insuline, 50 ug / ml ascorbaat-2-fosfaat en 10 ng / ml transformerende groeifactor-β1. Differentiatie proces voor chondrocyten <ol> Na zaaien pADSC op 10-cm kweekschalen gedurende 24 uur, verwijder kweekmedium volledig en afwassen tweemaal met PBS. Trypsinize pADSC met 1 ml 0,25% trypsine-EDTA gedurende 5 min, en vervolgens neutraliseren met 1 ml kweekmedium. Verzamelen, tellen pas pADSC in 15 ml conische buizen met een dichtheid van 2,5 x 10 5 cellen per buis. Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen. Na centrifugatie bij 400 xg gedurende 7 minuten, verwijder de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren en voeg 1 ml van chondrocyten inductie medium in een 15 ml buis. De buis wordt teruggegeven aan de 37 ° C incubator. Dit is de dag nul van differentiatie. Vervang de chondrocyten inductiemedium drie dagen zonder het verwijderen van cellen op de bodem. Rijpe chondrocyten zal vormen ongeveer 14 dagen. Deze chondrocyten zijn klaar voor Toluidine Blue O kleuring. 6. kleuring van gedifferentieerde adipocyten Osteocytes en chondrocyten Oil Red O kleuring voor gedifferentieerde adipocyten Op dag 9, verwijderen vetcellen onderhoud medium in 6-putjes met gedifferentieerde adipocyten en was daarna de plaat tweemaal met PBS. [In de volgende stappen, voeg genoeg aangewezen reagentia aan elk putje van de 6-well plaat bedekken.] Fix adipocyten met 10% formaline oplossing gedurende tenminste 10 minuten. Verwijder de 10% formaline oplossing en was de plaat tweemaal met tweemaal gedestilleerd water. Na twee wasbeurten, voeg 100% propyleenglycol in de petrischaal en laat gedurende 1 minuut. Verwijder de 100% propyleenglycol en voeg Oil Red O-oplossing (0,5% in propyleenglycol) in de petrischaal. Laat staan ​​gedurende ten minste 10 minuten op een shaker rocker zacht schudden (100 rpm). Verwijder de Oil Red O-oplossing en vervolgens te vervangen door 60% propyleenglycol. Laat staan ​​voor 1 min. Verwijder de 60% propyleenglycol en was daarna de plaat tweemaal met double gedestilleerd water. Vervang met 10% formaline-oplossing. De gebrandschilderde vetdruppels binnenkant van adipocyten zijn klaar voor observatie door lichtmicroscopie. Kwantificering van intracellulaire Oil Red O (hieronder optionele stappen): na microscopische observatie, verwijderen 10% formaline-oplossing en was de plaat tweemaal met tweemaal gedestilleerd water. volledig Tap de plaat en voeg 500 ul van isopropanol aan de 6-wells plaat. Isopropanol laat staan ​​in de 6-well plaat op een zachte rocker schudapparaat (100 rpm) gedurende ten minste 10 min aan de kleurstof met Oil Red O. oplossen Zuig het isopropanol dat Oil Red O en verspreiden op een 96-wells plaat. Kwantificeren van de gewonnen olie rode O met behulp van een spectrofotometrische aflezing bij 510 nm. Alizarinerood S kleuring voor gedifferentieerde osteocyten Op dag 14, verwijder osteocyten inductiemedium van 6-well platen met gedifferentieerde osteocyten en was de platen tweemaal met PBS. [In de following stap, voeg genoeg aangewezen reagentia aan elk putje van de 6-well plaat bedekken.] Fix osteocyten in 10% formaline oplossing gedurende tenminste 10 minuten. Verwijder de 10% formaline-oplossing uit elk putje en was de plaat tweemaal met tweemaal gedestilleerd water. Na twee wasbeurten, voeg 2% Alizarin Red S oplossing (pH = 4,1-4,3) bij de 6-well plaat en laat gedurende tenminste 15 minuten op een zachte rocker schudapparaat (100 rpm). Verwijder de alizarinerood S oplossing en was daarna de plaat tweemaal met tweemaal gedestilleerd water. Vervang met 10% formaline-oplossing. Osteocyten zijn klaar voor observatie door lichtmicroscopie. Toluïdine blauw O kleuring gedifferentieerde chondrocyten Op dag 14, zuig chondrocyten inductiemedium van de 15 ml conische buis zonder het verwijderen van sedimenten van gedifferentieerde chondrocyten in de bodem van de buis en was het buisje tweemaal met PBS. [In de volgende stappen, voeg genoeg aangewezen reagentia cover chondrocyten in de bodem van de buis of het gedeelte dia.] Fix chondrocyten in 10% formaline oplossing gedurende tenminste 10 minuten. Verwijder de 10% formaline-oplossing uit elke buis en was het buisje tweemaal met tweemaal gedestilleerd water. Na twee wasbeurten, pellets insluiten in OCT verbinding en gedeelte met een cryostaat met een dikte van 5 urn. Vlekken op de schuif van de cryostaat secties met Toluidine Blue O-oplossing (0,1% bij pH 4,1). Verwijder toluïdineblauw O-oplossing en was daarna de sectie tweemaal met tweemaal gedestilleerd water. Opmerking: Chondrocyten op dia's zijn klaar voor observatie door lichtmicroscopie.