Isolierung und Differenzierung von Fettgewebe gewonnenen Stammzellen aus Porcine Subkutan Fettgewebes

Hinweis: Diese Methode hergestellt wurde und verwendet in der Forschung bereits berichtet 14-17 aus diesem Labor; im Laufe der Zeit wurde die Methodik geändert. Das derzeitige Verfahren wurde von einem Ferkel (7 bis 9 Tage alt) mit seeding auf 6-Well-Gewebekulturplatten mit einem Durchschnitt von 60 g Schweine subkutane Fettgewebe erfolgen. Alle Verfahren wurden bei RT durchgeführt, wenn nicht anders bezeichnet. Alle Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der National Taiwan University zugelassen. 1. Bereiten Sie Digestionsmedium Erhalten subkutane Fettgewebe aus dem Nacken und Rücken; 40 bis 80 g pro Ferkel (7 bis 9 Tage alt), abhängig von der Größe der Schweine. Hier verwenden 60 g subkutanen Fettgewebe von einem Schwein erhalten. Bereiten Sie Digestionsmedium: wiegen Kollagenase II Pulver mit insgesamt 54.000 Einheiten und löst ihn in 90 ml Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM,60 g Fett) in einer 100 ml Flasche serologische (900 Einheiten Collagenase / 1,5 ml DMEM / g Fett). Vorsichtig geschwenkt, für die Sterilisation mindestens 15 Minuten zu lösen und dann die Digestionsmedium durch ein 0,22-um-Filter passieren die Digestionsmedium auf einem Rütteltisch (100 rpm). Lagerung bei 4 ° C vor dem Gebrauch. 2. Dissect Subkutan Fettgewebes von Schweinen Sterilisieren alle Instrumente, Glas und Plastikwaren und warm alle Medien bis 37 ° C vor dem Gebrauch. Sacrifice das Ferkel mit elektrischer Betäubung und Ausbluten oder durch ein Verfahren, in Übereinstimmung mit den örtlichen Vorschriften IACUC verwenden. Führen Präparation sorgfältig und unmittelbar nach dem Ferkel geopfert werden. Lay (nach hinten raus und Bauch nach unten), um die Ferkel auf eine saubere OP-Tisch. Abrasieren das Haar von der Ferkel wieder zu entfernen alle Haare vom Hals bis zum Schwanz und an beiden Seiten nach unten auf der Mittellinie. Scrub die Rückenhaut des Schweins mit 7,5% PolyvidonJod dreimal (mit drei neuen unabhängigen scheuert) und lassen dann das Jod für etwa 10 min auf der Oberfläche der Haut zu sitzen. Entfernen Sie die Povidon-Iod mit mehreren Sprays von 70% Ethanol. Verwenden Gazekompressen oder Tissuepapiere 70% Ethanol enthält, um die Haut in einer Richtung zu wischen, zu wiederholen, bis keine offensichtliche Farbe der Povidon-Iod beobachtet wird. Verwenden Sie ein Skalpell die Schweinerückenfettschicht von subkutanem Fettgewebe zu trennen zusammen mit der beigefügten Hautschicht aus den Muskeln, während das Fett hält und die Haut mit einer Pinzette. Unmittelbar tauchen mit angebrachtem Haut die Fettschicht von subkutanem Fettgewebe in einem sterilisierten Becher (200 ml) serumfreies DMEM enthält. Sprühen Sie die Außenseite des Bechers die Fettschicht mit 70% Ethanol und in einer Laminar-Flow-Zellkultur Haube enthält. Legen Sie eine große (40 cm x 30 cm) sterilisierte dreischichtigen Deckfolie in der Motorhaube. [Eine dreifache Schicht wird verwendet, kontinuierliche Integrität zu gewährleisten.] Setze dasGewebe mit der Haut auf der Deckfolie nach unten zeigt. Schneiden Sie die verbleibenden Muskelgewebe aus des Fettgewebes mit einer Pinzette und Schere Kontamination mit Muskelgewebe zu vermeiden. Schneiden Sie das Fett in quadratische Stücke (~ 7 cm x 7 cm) mit einem Skalpell oder einer Schere. Setzen Sie diese Stücke der Fettschicht in einen neuen sterilisierten Becher (200 ml), das Serum-freiem DMEM. Stellen Sie eine maßgeschneiderte Scheibe Halter auf der Deckfolie mit einem Kohlenstoffstahl Schneidklinge montiert (Abbildung 1). Nehmen Sie ein Stück Fett aus dem Becher und legen Sie es auf der Schneidemaschine (Hautschicht auf der Oberseite und Fettschicht unten). Schneiden Sie die Fettschicht von subkutanem Fettgewebe in etwa 1 mm dicke Stücke. Schneiden Sie die Fettschicht von der Haut so nah wie möglich, aber vermeiden Sie die Haut schneiden. Mince in Scheiben geschnitten Fettgewebe mit einer Schere so fein wie möglich. In gefiltert Digestionsmedium Kollagenase in einen 250 ml Erlenmeyerkolben oder einer serologischen Flasche enthält, mit gehacktemFettgewebe (54.000 Einheiten Kollagenase / 90 ml DMEM / 60 g Fett). Inkubieren und den Erlenmeyerkolben bei 45 rpm in einem Schüttler für 90 min bei 37 ° C verwirbelt die Kollagenase zu verdauen das Gewebe zu ermöglichen. Hinweis: Überprüfen Sie alle 15 bis 30 Minuten über Verdauung zu vermeiden. Der Verdauungsvorgang abgeschlossen ist, wenn die Digestionsmedium ein Brei ohne signifikante Gewebeklumpen ist. Ein gleiches Volumen (gleich dem Digestionsmedium) von Kulturmedium, das DMEM / F12 mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) die Kollagenaseverdau zu stoppen. Abbildung 1. Eine angepasste Schneidemaschine für die Isolierung von pADSC verwendet. Dissected Fettgewebe aus Schweinerücken subkutanen Fettgewebe aus der Fettschicht zusammengesetzt mit angebautem Hautschichten. Eine Schneidemaschine erforderlich, um die Fettschicht etwa 1 mm dick mit Vermeidung von Über- zu schneidenSchneiden in die Hautschichten. Von links nach rechts: Scheibe Halter, Slicer-Pad, Kohlenstoffstahl Schneidklinge und Schrauben. Slicer Messer zwischen Scheibe Halter und Slicer – Pad eingeführt wird , wenn montiert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 3. Sammlung von pADSC aus dem Stroma-vaskuläre Fraktion Übergeben Sie das Digestionsmedium der verdauten Fettgewebe durch eine einzige Schicht aus Chiffon in eine saubere sterilisierte 250 ml Erlenmeyerkolben oder einem 250 ml serologische Flasche enthält. Verwenden Sie eine Zange in der Mitte des Chiffon zu drücken Passage des verdauen zu führen und zu unterstützen. Abtropfen lassen und den Chiffon mit einer Zange drehen, um Durchgang abzuschließen. Verteilen Sie das Digestionsmedium in vier 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen (~ 40 ml Medium pro Röhrchen). Zentrifuge bei 700 × g für 10 min das Pellet von stromal-Gefäßzellen zu sammeln. <li> Den Überstand dekantieren, ohne die Pellets zu stören die meisten der Top-Fettschicht reifen Adipozyten enthält, zu entfernen. Waschen Sie das Pellet durch Zugabe von 10 ml DMEM in jedes Röhrchen, das Pellet mit Pipettieren und vorsichtigem Schütteln des Röhrchens zu resuspendieren. Zentrifuge bei 700 × g für 6 min. Den Überstand umfüllen. 10 ml ACK-Lysepuffer und anschließend das Pellet durch Pipettieren. Lassen Sie es für 7 min (5 bis 10 min) bei RT stehen roten Blutkörperchen in dem Stroma-vaskulären Fraktion zu lysieren. Hinzufügen gleiche Mengen von DMEM (10 ml), die Reaktion unter leichtem Schütteln des Rohres zu stoppen und dann bei 700 xg für 10 min zentrifugiert. Den Überstand umfüllen, 10 ml DMEM in jedes Röhrchen, das Pellet mit wiederholten Pipettieren und Zentrifuge bei 700 × g für 6 min. Zweimal wiederholen. Sammeln und das DMEM (insgesamt 40 ml DMEM von 4 Röhrchen die 60 g Fett) mit suspendierten Zellen durch ein 100 & mgr; m Sieb in ein neues 50 ml konischen Röhrchen passieren. Gently Pipette medium mehrmals mit 180 ul von 0,4% Trypanblau-Lösung (1:10 Verdünnung) in ein neues 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen gut vermischt und aliquote 20 ul zellhaltigen Medium zu mischen. Zähle die Zellen mit einem Hämozytometer und dann Samen pADSC bei einer Dichte von 60.000 Zellen / cm 2 auf eine gewünschte Größe der Kulturschale oder eine Platte mit Kulturmedium , das DMEM / F12, das 10% fötales Rinderserum (FBS) und 1% Antibiotika Penicillin -streptomycin-Amphotericin B-Lösung (P / S / A). Im Allgemeinen Samen der pADSC auf den 6-Well-Gewebekulturplatten für Adipozyten oder osteocyte Differenzierung. Samen der pADSC auf 10-cm-Schalen für Oberflächenmarker Färbung von Stammzellen oder Chondrozyten-Differenzierung. Inkubieren der Platten oder Schalen in dem 37 ° C Inkubator in Luft mit 5% CO 2 Zellanheftung an den Platten zu ermöglichen. 4. Identifizierung Stem-Zelloberflächenmarker von pADSC durch Durchflusszytometrie Nach 24 Stunden das Medium vollständig zu entfernen, waschen the 10-cm-Schale zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und des Ernte Zellen mit 1 ml von 0,25% Trypsin-EDTA für 5 min bei 37 ° C. Neutralisieren Trypsin-EDTA mit gleichen Mengen Kulturmedium (1 ml), sammeln Zellen in einem neuen 15-ml konischen Röhrchen und dann Zentrifuge bei 400 × g für 7 min. Den Überstand umfüllen. Waschen Sie das Pellet zweimal in 3 ml eiskaltem FCS-Waschpuffer unter Verwendung von Resuspension (PBS enthaltend 10% FBS) mit Zentrifugation für 7 min bei 400 xg gekoppelt Pipettieren. Resuspendieren, zählen und stellen pADSC bis 10 6 Zellen / ml in eiskaltem FCS-Waschpuffer. Ortszellen (100 ul / jedes Rohr) in mehrere neue 15 ml konische Röhrchen und Inkubation Röhrchen mit pADSC bei 4 ° C für 30 min mit Antikörpern gegen entweder Phycoerythrin-konjugiertem CD4a (CD4a-PE), CD29-PE, CD31-PE , CD44-PE, CD45-PE, CD90-PE, MHC I-PE oder MHC-II-PE für die direkte Färbung. Die Reaktion durch Waschen der Zellen zweimal in 10 ml FCS-Waschpuffer mit 400 × g centrifugat gekoppeltIon für 7 min. Fix und resuspendieren Zellen in Fixierungspuffer (PBS mit 0,01% FBS und 1% Formaldehyd) für die Durchflusszytometrie entsprechend den Anweisungen des Herstellers und unserer früheren Veröffentlichung 18. 5. Differenzierung von pADSC in Adipozyten, Osteozyten und Chondrozyten Differenzierung von pADSC in Adipozyten Bereiten Sie Adipozyten Induktionsmedium und Adipozyten-Erhaltungsmedium Für Adipozyten Induktionsmedium vorbereiten 1 l Serum-freies DMEM / F12 (mit Antibiotika von 1% P / S / A) mit folgendem Inhalt: 1 ml Insulin Lager (10 mg / ml HEPES-Puffer, pH 8), Endkonzentration = 10 & mgr; g / ml; 1 & mgr; l T3 Lager (3,3 ', 5-Triiod-L-thyronine, 1 mM in DMSO), Endkonzentration = 1 nM; 200 & mgr; l Transferrin Lager (50 mg / ml doppelt destilliertem H 2 O), Endkonzentration = 10 & mgr; g / ml; 100 & mgr; l Dexamethason Lager (10 mM in Ethanol), Endkonzentration = 1 & mgr; M; 100 ul Rosiglitazon Lager (10 mM in DMSO), Endkonzentration= 1 uM. Bereiten Sie Adipozyten Erhaltungsmedium mit den gleichen Zusätzen wie das Induktionsmedium, aber unter Weglassung von Dexamethason. Differenzierungsprozess für Adipozyten Hinweis: Nach der Aussaat pADSC auf 6-Well-Platten, werden pADSC innerhalb von 72 h konfluent werden. Nach 3 Tagen, entfernen Sie das Medium vollständig und fügen Sie dann 3 ml Adipozyten Induktionsmedium in jede Vertiefung. Bringen Sie die Platten in den Inkubator. Dies ist Tag Null der Differenzierung. Nach 3 Tagen entfernen mit 3 ml Adipozyten Erhaltungsmedium alle drei Tage die Adipozyten-Induktionsmedium vollständig und zu ersetzen. Ältere Adipozyten terminal um etwa 9 Tage differenziert werden. Über 90% der Adipozyten sind gut differenziert dieses Protokoll verwenden. Diese Adipozyten sind bereit für Oil Red O Färbung. Differenzierung von pADSC in Osteozyten Bereiten Sie osteocyte Induktionsmedium: alle Kultur medium (DMEM / F12 mit 10% FBS und 1% P / S / A), enthaltend 1 & mgr; M Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat und 50 & mgr; g / ml Ascorbat-2-phosphat. Differenzierungsprozess für osteocytes Hinweis: Nach der Aussaat pADSC auf 6-Well-Platten, werden pADSC innerhalb von 72 h konfluent werden. Nach 3 Tagen, entfernen Sie das Medium vollständig und 3 ml osteocyte Induktionsmedium in jede Vertiefung. Bringen Sie die Platten auf dem 37 ° C Inkubator. Dies ist Tag Null der Differenzierung. Ersetzen mit osteocyte Induktionsmedium alle drei Tage. Ältere osteocytes wird durch einen 14-tägigen Differenzierung bilden. Diese Osteozyten sind bereit für Alizarin Red S-Färbung. Differenzierung von pADSC in Chondrozyten Bereiten Chondrozyten Induktionsmedium: & agr; MEM, das 1% FBS, 6,25 & mgr; g / ml Insulin, 50 ug / ml Ascorbat-2-phosphat und 10 ng / ml transformierender Wachstumsfaktor-β1. Differenzierungsprozess für Chondrozyten <ol> Nach der Aussaat pADSC auf 10-cm-Kulturschalen für 24 h, Kulturmedium vollständig zu entfernen und Geschirr spülen zweimal mit PBS. Trypsinize pADSC mit 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA für 5 min und dann mit 1 ml Kulturmedium neutralisieren. Sammeln, zählen und justieren pADSC in 15 ml konischen Röhrchen mit einer Dichte von 2,5 × 10 5 Zellen pro Röhrchen. Verwenden Sie ein Hämozytometer die Zellen zu zählen. Nach Zentrifugation bei 400 × g für 7 min, den Überstand verwerfen, ohne das Pellet zu stören und 1 ml Chondrozyten-Induktionsmedium in einem 15-ml-Röhrchen hinzufügen. Das Rohr wird in den Inkubator 37 ° C zurückgeführt. Dies ist Tag Null der Differenzierung. Tauschen Sie die Chondrozyten-Induktionsmedium alle drei Tage ohne Zellen auf dem Boden zu entfernen. Ältere Chondrozyten werden in etwa 14 Tage bilden. Diese Chondrozyten sind bereit für Toluidinblau-O-Färbung. 6. Färbung von Differentiated Adipozyten, Osteocytes und Chondrozyten Oil Red O Färbung für differenzierte Adipozyten Am Tag 9, Adipozyten Erhaltungsmedium in 6-Well-Kulturplatten mit differenzierten Adipozyten entfernen und dann die Platte zweimal mit PBS waschen. [In den folgenden Schritten fügen genug bezeichneten Reagenzien jede Vertiefung der 6-Well-Platte zu bedecken.] Fix Adipozyten mit 10% Formalin-Lösung für mindestens 10 min. Entfernen Sie die 10% Formalin-Lösung und waschen Sie die Platte zweimal mit doppelt destilliertem Wasser. Nach zwei Wäschen 100% Propylenglykol zu der Kulturplatte hinzufügen und lassen Sie 1 min lang stehen. Entfernen Sie die 100% Propylenglykol und dann Oil Red O-Lösung (0,5% in Propylenglykol) mit der Kulturplatte hinzuzufügen. mindestens 10 min auf einer Wippe Schüttler stehen unter leichtem Schütteln (100 Umdrehungen pro Minute) Es sei. Entfernen Sie die Oil Red O-Lösung und dann mit 60% Propylenglykol ersetzen. Lassen Sie für 1 min stehen. Entfernen Sie die 60% Propylenglykol und dann waschen Sie die Platte zweimal mit double-destilliertes Wasser. Ersetzen Sie mit 10% Formalin-Lösung. Die gefärbten Lipidtröpfchen innerhalb von Adipozyten sind bereit für die Beobachtung durch Lichtmikroskopie. Die Quantifizierung der intrazellulären Oil Red O (optionale Schritte unten): Nach der mikroskopischen Beobachtung, entfernen Sie 10% Formalin-Lösung und waschen Sie die Platte zweimal mit doppelt destilliertem Wasser. Lassen Sie die Platte vollständig und fügen 500 ul Isopropanol zu der 6-Well-Platte. Lassen Isopropanol stehen in 6-Well-Platte auf einem sanften rocker Schüttler (100 rpm) für mindestens 10 min, den Farbstoff von Oil Red O. aufzulösen Saugen Sie das Isopropanol Oil Red O enthält, und verteilen auf einer 96-Well-Platte. Quantifizieren der extrahierten Oil Red O, um eine photometrische Messung bei 510 nm verwendet wird. Alizarin Red S-Färbung für eine differenzierte osteocytes Am Tag 14, osteocyte Induktionsmedium aus 6-Well-Platten mit differenzierten Osteozyten und waschen Sie die Platten zweimal mit PBS zu entfernen. [In den following Schritte, genug bezeichnet Reagenzien hinzufügen jede Vertiefung der 6-Well-Platte zu bedecken.] Fix Osteozyten in 10% Formalin-Lösung für mindestens 10 min. Entfernen Sie die 10% Formalin-Lösung aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Platte zweimal mit doppelt destilliertem Wasser. Nach zwei Wäschen, fügen Sie 2% Alizarin Red S-Lösung (pH = 4,1-4,3) mit dem 6-Well-Platte und lassen Sie sich für mindestens 15 Minuten lang auf einem sanften Rocker Schüttler (100 rpm) stehen. Entfernen Sie die Alizarin Red S-Lösung und dann waschen Sie die Platte zweimal mit doppelt destilliertem Wasser. Ersetzen Sie mit 10% Formalin-Lösung. Osteozyten sind für die Beobachtung durch Lichtmikroskopie bereit. Toluidinblau-O-Färbung für differenzierte Chondrozyten Am Tag 14, absaugen Chondrozyten Induktionsmedium aus dem 15 ml konischen Röhrchen ohne Sedimente von differenzierten Chondrozyten in dem Boden des Röhrchens und wasche das Röhrchen zweimal mit PBS entfernt. [In den folgenden Schritten fügen genug bezeichneten Reagenzien Buchtr Chondrozyten in dem Boden des Röhrchens oder auf dem Abschnitt Folie.] Fix Chondrozyten in 10% Formalin-Lösung für mindestens 10 min. Entfernen Sie die 10% Formalin-Lösung aus jedem Röhrchen und waschen Sie die Röhrchen zweimal mit doppelt destilliertem Wasser. Nach zwei Wäschen einzubetten Pellets in OCT-Verbindung und Abschnitt mit einem Kryostaten bei einer Dicke von 5 um. Beflecken der Schieber des Kryostatschnitten mit Toluidinblau O-Lösung (0,1% bei pH 4,1). Entfernen Sie Toluidinblau O-Lösung und dann waschen Sie den Abschnitt zweimal mit doppelt destilliertem Wasser. Hinweis: Chondrozyten auf Folien zur Beobachtung bereit sind, durch Lichtmikroskopie.