Выделение и дифференциация полученных из жировой ткани стволовые клетки из свиных подкожного жирового ТКАНЕЙ

Примечание: Этот метод был создан и используется в исследованиях сообщалось ранее 14-17 из этой лаборатории; с течением времени методология была изменена. Текущая процедура была выполнена с использованием в среднем 60 г свиных подкожной жировой ткани из одного поросенка (от 7 до 9 дней) с посевом на 6-луночных культуральных планшетах. Все процедуры были выполнены при комнатной температуре, если не указано иное. Все эксперименты на животных были одобрены Institutional Animal Care и использование комитета (IACUC) Национального университета Тайваня путем. 1. Подготовить Пищеварение Medium Получение подкожной жировой ткани от шеи и спины; От 40 до 80 г на поросенка (от 7 до 9 дней), в зависимости от размера свиней. Здесь используют 60 г подкожной жировой ткани, полученных от одной свиньи. Готовят пищеварение среды: вес порошка коллагеназы II в общей сложности 54000 единиц и растворить его в 90 мл модификации Дульбекко среде Игла (DMEM,60 г жира) в 100 мл серологической флакон (900 единиц коллагеназы / 1,5 мл DMEM / г жира). Аккуратно перемешивайте переваривания среды на качалке таблице (100 оборотов в минуту) в течение не менее 15 мин для растворения, а затем передать переваривания среды через фильтр 0,22 мкм для стерилизации. Хранить при температуре 4 ° С перед использованием. 2. Рассеките подкожная жировая ткань из Свиней Стерилизовать все инструменты, стекло и изделия из пластмасс и тепло все средства массовой информации до 37 ° C перед использованием. Жертвоприношение поросенка с электрическим потрясающем и обескровливания или с помощью метода, в соответствии с местными нормативами IACUC. Выполните рассечение тщательно и сразу же после того, как поросята в жертву. Положите поросенка на чистую операционном столе (обратно вверх и вниз живот). Сбрить волосы от поросенка обратно, удалив все волосы от шеи до хвоста и с обеих сторон вниз к средней линии. Скраб свиньи спинной кожи с 7,5% povidone-йода в три раза (с тремя новыми независимыми-скрабы), а затем позволить йод сидеть на поверхности кожи в течение приблизительно 10 мин. Удалите повидон-йода с несколькими брызгами 70% этанола. Используйте марлевые тампоны или тканевые бумаги, содержащие 70% этанола, чтобы протирать кожу в одном направлении, повторяя, пока не наблюдается никакого очевидного цвет повидон-йода. Используйте скальпель, чтобы отделить свиной спинной жировой слой подкожной жировой ткани вместе с прикрепленным слоем кожи от мышц, удерживая вверх жир и кожу с помощью щипцов. Немедленно погрузить толстый слой подкожного жировой ткани с прилегающей кожей в стерилизованную стакане (200 мл), содержащей бессывороточной DMEM. Брызги снаружи стакана, содержащего жировой слой с 70% этанола и место в ламинарного потока капот культуре клеток. Поместите большой (40 см х 30 см) стерилизуют трехслойную фольгу в капот. [Тройной слой используется для обеспечения непрерывной целостности.] Поместитеткани с кожей вниз на оберточную фольгу. Обрежьте оставшуюся мышечную ткань от жировой ткани с помощью пинцета и ножниц, чтобы избежать загрязнения с мышечной ткани. Обрежьте жир на квадратные куски (~ 7 см х 7 см) с помощью скальпеля или ножниц. Поместите эти кусочки жирового слоя в новый стерилизованного стакане (200 мл), содержащей бессывороточной DMEM. Установить настроенную держатель среза на оберточную фольгу в сборе с углеродистой стали слайсера лезвия (рисунок 1). Возьмите одну часть жира из стакана и поместите его на резателя (скин-слой на верхней и жировой слой ниже). Нарезать жировой слой подкожной жировой ткани в приблизительно 1 мм толщиной штук. Нарезать жировой слой с кожи как можно ближе, но избежать нарезка кожи. Фарш нарезанный жировой ткани с ножницами в виде мелких, насколько это возможно. Добавьте отфильтрованный пищеварение среды, содержащей коллагеназы в 250 мл колбу Эрленмейера или серологического бутылки с фаршажировой ткани (54000 единиц коллагеназы / 90 мл DMEM / 60 г жира). Инкубируют и взболтать коническую колбу при 45 оборотах в минуту в орбитальном шейкере в течение 90 мин при 37 ° С, чтобы позволить коллагеназы переваривать ткани. Примечание: Проверьте каждые 15 до 30 минут, чтобы избежать чрезмерного пищеварения. Процесс переваривания завершается, если переваривание среда представляет собой суспензию без существенных сгустки ткани. Добавить равный объем (равный пищеварительную среде) культуральной среде, содержащей DMEM / F12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), чтобы остановить коллагеназы. Рисунок 1. Настроенная слайсер используется для изоляции pADSC. Рассеченные ткани жировой ткани из свиных спинных подкожной жировой ткани состоят из жировой слой с вложенными слоями кожи. Слайсера требуется разрезать толстый слой толщиной приблизительно 1 мм с избегания перепредставленныхнарезка в слои кожи. Слева направо: держатель среза, слайсера прокладки, углеродистой стали слайсера лезвия и винтов. Slicer лезвие вставляется между держателем среза и слайсера площадку в собранном. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 3. Сбор pADSC из стромальных-сосудистой фракции Пропускают переваривание среду, содержащую переваренных жировой ткани через один слой шифона в чистую стерилизованную 250 мл колбу Эрленмейера, или 250 мл серологической бутылки. Используйте пинцет, чтобы нажать на середину шифона, направляющей и содействия прохождению дайджеста. Слить и скрутить шифон с пинцетом, чтобы завершить прохождение. Распределить переваривание среды в четыре 50 мл конические пробирки для центрифугирования (~ 40 мл среды на пробирку). Центрифуга при 700 х г в течение 10 мин, чтобы собрать осадок стромальных-сосудистых клеток. <li> Декантируют супернатант, не нарушая гранул, чтобы удалить большую часть верхнего слоя, содержащего жира зрелые адипоциты. Промывают осадок добавлением 10 мл DMEM в каждую пробирку, чтобы ресуспендируют осадок с пипеткой и осторожном встряхивании трубки. Центрифуга при 700 мкг в течение 6 мин. Декантируют супернатант. Добавляют 10 мл ACK лизирующего буфера, а затем ресуспендируют осадок пипетированием. Пусть стоять в течение 7 мин (от 5 до 10 мин) при комнатной температуре, чтобы лизировать красные кровяные клетки в стромальных-сосудистой фракции. Добавить равное количество DMEM (10 мл), чтобы остановить реакцию при осторожном встряхивании трубки, а затем центрифугировать при 700 х г в течение 10 мин. Слейте супернатант, добавьте 10 мл DMEM в каждую пробирку, ресуспендируют осадок с повторным пипетированием и центрифуге при 700 мкг в течение 6 мин. Повторите дважды. Собрать и передать DMEM (в общей сложности 40 мл DMEM из 4 трубок, представляющих 60 г жира) с подвесными клетками через сито 100 мкм в новый 50 мл коническую трубку. Аккуратно пипетку Mediгм несколько раз, чтобы хорошо перемешать и аликвоты по 20 мкл клеточной среде, содержащей в смеси с 180 мкл 0,4% -ным раствором трипанового синего (разведение 1:10) в новой 1,5 мл пробирку Эппендорфа. Граф клеток с помощью гемоцитометра , а затем семян pADSC при плотности 60000 клеток / см 2 на желаемом размера чашки для культивирования или пластины с питательной средой , содержащей DMEM / F12, 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% антибиотиков пенициллина -streptomycin-амфотерицин раствор В (P / S / A). Как правило, засеять pADSC на 6-луночные планшеты для тканевых культур для адипоцитов или остеоцитарного дифференциации. Семя pADSC на 10-см чашки для поверхностного окрашивания маркера стволовых клеток или хондроцитов дифференцировки. Инкубируйте пластины или блюда в 37 ° C инкубаторе в воздухе с 5% CO 2 , чтобы позволить прикрепление клеток к пластинам. 4. Идентификация стволовых клеток поверхностных маркеров pADSC методом проточной цитометрии Через 24 часа, полностью удалить среду, моют гое 10-см чашку дважды фосфатно-буферным солевым раствором (PBS) и урожай клеток с 1 мл 0,25% трипсин-ЭДТА в течение 5 мин при 37 ° С. Нейтрализовать трипсин-ЭДТА с равным количеством культуральной среды (1 мл), собирают клетки в новом 15-мл коническую трубку, а затем центрифуге при 400 × г в течение 7 мин. Декантируют супернатант. Промывают осадок дважды в 3 мл охлажденной льдом FCS-буфером для промывки (PBS, содержащей 10% FBS), используя ресуспензию пипеткой в ​​сочетании с центрифугированием при 400 х г в течение 7 мин. Ресуспендируют, граф, и корректировать pADSC до 10 6 клеток / мл в охлажденном льдом FCS-буфера для промывки. Место клетки (100 мкл / каждая трубка) на несколько новых 15-мл конические пробирки и инкубировать пробирки, содержащие pADSC при температуре 4 ° С в течение 30 мин с антителами против либо фикоэритрин-конъюгированного CD4a (CD4a-РЕ), CD29-PE, CD31-PE , CD44-PE, CD45-PE, CD90-PE, MHC I-PE или MHC II-PE для прямого окрашивания. Остановить реакцию путем промывки клетки дважды в 10 мл FCS-промывочного буфера в сочетании с 400 × г centrifugatионов в течение 7 минут. Фикс и ресуспендирования клеток в фиксации буфера (PBS с 0,01% FBS и 1% формальдегида) для проточной цитометрии в соответствии с инструкциями изготовителя и нашей предыдущей публикации 18. 5. Разграничение pADSC в адипоциты, остеоциты и хондроциты Дифференциация pADSC в адипоциты Приготовьте адипоцитов индукционную среду и адипоцитов поддерживающую среду Для адипоцитов индукционной среде, готовят 1 л сыворотки DMEM / F12 (с антибиотиками 1% P / S / A), содержащий следующие действия: 1 мл инсулина запас (10 мг / мл HEPES-буфера, рН 8), конечная концентрация = 10 мкг / мл; 1 мкл Т3 запас (3,3 ', 5-Трийод-L-тиронина, 1 мМ в ДМСО), конечная конц = 1 нМ; 200 мкл трансферрина запас (50 мг / мл бидистиллированной H 2 O), конечная конц = 10 мкг / мл; 100 мкл дексаметазон запас (10 мМ в этаноле), конечная конц = 1 мкМ; 100 мкл розиглитазон запас (10 мМ в ДМСО), конечная конц= 1 мкМ. Подготовка среды обслуживания адипоцитов с теми же добавками, как индукционной среде, но с пропуском дексаметазона. Процесс дифференциации адипоцитов для Примечание: После засева pADSC на 6-луночные планшеты, pADSC будут сливающийся в течение 72 часов. После 3-х дней, удалите среду полностью и затем добавляют 3 мл адипоцитов индукционной среды в каждую лунку. Возвращение пластины в инкубатор. Это нулевой день дифференцировки. После 3-х дней, удалите адипоцитов индукционную среду полностью и заменить с 3 мл поддерживающей среды адипоцитов каждые три дня. Зрелые адипоциты будет окончательно дифференцированные около 9 дней. Более 90% адипоцитов хорошо дифференцированы с использованием этого протокола. Эти адипоциты готовы к окрашиванию Oil Red O. Дифференциация pADSC в остеоциты Подготовка остеоцит индукции среды: полная культура mediuм (DMEM / F12 с добавлением 10% FBS и 1% P / S / A), содержащий 1 мкМ дексаметазон, 10 мМ b-глицерофосфата и 50 мкг / мл аскорбата-2-фосфат. Процесс Дифференциация для остеоцитах Примечание: После засева pADSC на 6-луночные планшеты, pADSC будут сливающийся в течение 72 часов. После 3-х дней, удалите среду полностью и добавляют 3 мл остеоцит индукционной среды в каждую лунку. Возвращение пластины к 37 ° С инкубатор. Это нулевой день дифференцировки. Заменить остеоцит индукционной среде один раз в три дня. Зрелые остеоцитами сформирует 14 суток дифференцировки. Эти остеоцитами готовы к ализарин красный S окрашивания. Дифференциация pADSC в хондроциты Готовят хондроцитов индукционной среде: αMEM, содержащий 1% FBS, 6,25 мкг / мл инсулина, 50 мкг / мл аскорбата-2-фосфат, и 10 нг / мл трансформирующего фактора роста & beta; 1. Процесс Дифференциация для хондроцитов <ol> После засева pADSC на 10-см чашки для культивирования в течение 24 ч, удалить культуральную среду полностью и мыть посуду в два раза с PBS. Trypsinize pADSC с 1 мл 0,25% трипсин-ЭДТА в течение 5 мин и затем нейтрализуют 1 мл культуральной среды. Сбор, рассчитывать и корректировать pADSC в 15 мл конические пробирки с плотностью 2,5 × 10 5 клеток на пробирку. Используйте гемоцитометра для подсчета клеток. После центрифугирования при 400 × г в течение 7 мин, отбросить супернатант, не нарушая гранул и прибавляют 1 мл хондроцитов в индукционной среде 15 мл трубки. Трубка возвращается в 37 ° С инкубатор. Это нулевой день дифференцировки. Заменить хондроцитов индукционной среде каждые три дня без удаления клеток на дне. Зрелые хондроциты формируют в приблизительно 14 дней. Эти хондроциты готовы к окрашиванию толуидиновым синим O. 6. Окрашивание Дифференцированные адипоциты, OsteocyTES и Chondrocytes Окрашивание масло Красный O для дифференцированных адипоцитов На 9-й день, удалить среду обслуживания адипоцитов в 6-луночные культуральные планшеты с дифференцированными адипоцитов, а затем промыть пластину дважды PBS. [В следующих шагах, добавьте достаточное количество обозначенными реагентами, чтобы покрыть каждую лунку 6-луночного планшета.] Закрепить адипоцитов с помощью 10% -ного раствора формалина в течение не менее 10 мин. Удалите 10% -ный раствор формалина и помыть плиту дважды с дважды дистиллированной водой. После двух промывок добавляют 100% пропиленгликоля к культуральной пластины и дайте постоять в течение 1 мин. Удалите 100% пропиленгликоля, а затем добавляют раствор масла Красный O (0,5% в пропиленгликоле) к культуральной пластины. Дайте постоять в течение по крайней мере 10 мин на рокера шейкере при осторожном перемешивании (100 оборотов в минуту). Удалить масляный раствор Красный O, а затем заменить 60% пропиленгликоля. Дайте постоять в течение 1 мин. Удалите 60% пропиленгликоля, а затем промойте пластину дважды double дистиллированной воды. Заменить 10% -ным раствором формалина. Окрашенные липидные капли внутри адипоцитов готовы к наблюдению с помощью световой микроскопии. Количественное внутриклеточная Oil Red O (дополнительные шаги ниже): после того, как под микроскопом, удалить 10% раствором формалина и промойте пластину дважды с дважды дистиллированной водой. Слить пластину полностью и добавить 500 мкл изопропанола в 6-луночный планшет. Пусть изопропиловый спирт стоять в 6-луночного планшета на пологом качающегося шейкере (100 оборотов в минуту) в течение не менее 10 мин для растворения красителя Oil Red O. Аспирируйте изопропилового спирта, содержащего масла Red O и распределяют по 96-луночного планшета. Количественно добытой нефти Red O с использованием спектрофотометрического считывания при 510 нм. Ализарин красный S окрашивание для дифференцированного остеоцитах На 14-й день, удалить остеоцит индукционной среде из 6-луночные планшеты с дифференцированными остеоцитов и мыть тарелки в два раза с PBS. [В followiнг шаги, добавьте достаточное количество назначенных реагентов, чтобы покрыть каждую лунку 6-луночного планшета.] Фикс остеоцитов в 10% растворе формалина в течение не менее 10 мин. Удалите 10% -ный раствор формалина из каждой лунки и промойте пластину дважды с дважды дистиллированной водой. После двух промывок добавляют 2% раствор Ализарин Красный S (рН = 4,1-4,3) к 6-луночного планшета и дайте постоять в течение по крайней мере 15 мин на пологом качающегося шейкере (100 оборотов в минуту). Удалить решение ализарин красный S, а затем промойте пластину дважды дважды дистиллированной водой. Заменить 10% -ным раствором формалина. Остеоциты готовы к наблюдению с помощью световой микроскопии. Толуидиновым синим O окрашивание дифференцированных хондроцитов На 14-й день, аспирация хондроцитов индукционной среде из 15 мл коническую трубку, не удаляя отложения дифференцированные хондроцитов в нижней части трубы и промыть трубку дважды PBS. [В следующих шагах, добавьте достаточное количество назначенных реагентов для бухтойR хондроцитов в нижней части трубы или на участке ползуна.] Фикс хондроциты в 10% растворе формалина в течение не менее 10 мин. Удалите 10% -ный раствор формалина из каждой пробирки и промойте трубку дважды с дважды дистиллированной водой. После двух промываний, встраивать гранулы в ОСТ соединение и секции с криостат при толщине 5 мкм. Пятно скольжении секций криостата с раствором толуидиновым синим O (0,1% с рН 4,1). Удалить решение толуидиновым синим O, а затем промыть участок дважды с дважды дистиллированной водой. Примечание: хондроцитов на слайдах готовы к наблюдению с помощью световой микроскопии.