定量的グライコミクスおよびプロテオミクス複合精製戦略

1.タンパク質および糖タンパク質変性およびアルキル化標準製剤、負荷30kDaの上に糖タンパク質（ 例えば 、フェチュインまたはRNアーゼB）の0.1μgの/μlの溶液を2.5μlあるいは10kDaの分子量（MW）カットオフフィルターのため。 生物学的血漿サンプルについては、標準的なブラッドフォード19またはビシンコニン酸20（BCA）タンパク質アッセイによってタンパク質濃度を確認してください。必要であれば、mg / mlでの全タンパク質10〜100の間を含むこと〜7のpHでH 2 O（PNGアーゼダイジェストバッファ）に100mMの炭酸水素アンモニウム（NH 4 HCO 3）で、血漿を希釈します。フィルタへの負荷2.5μlの血漿（25-250μgタンパク質）。 注意：このプロトコルは、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）の存在下で採取した血液サンプルからの血漿で試験されました。 フィルタ内の各サンプルに1 Mジチオトレイソリューション（DTT）の2μlを添加します。 20でサンプルを希釈します0μlのバッファをダイジェストのPNGase。 フィルタのサンプル管に蓋をし、軽くボルテックス、その座からフィルタを乱さないように注意しながら。タンパク質や糖タンパク質を変性させ、30分間56℃でサンプルをインキュベートします。 サンプルをアルキル化するために、50μlの1 Mヨードアセトアミドを加える〜200 mMの最終濃度を得るために、60分間37℃でインキュベートします。 注：プロテオミクス分析が望まれていない場合は、ステップ1.5を省略してもよいです。 40分間14,000×gでサンプルを遠心分離することにより、フィルター上に変性した糖タンパク質を濃縮します。フロースルー捨てます。 2. Nはグリカン酵素消化を-結合しましたバッファをダイジェストPNGアーゼ100μlのサンプルを洗ってください。 20分間、14,000×gでフィルタ上に糖タンパク質を濃縮し、通って流れる捨てます。 フィルタデッドボリューム（〜5マイクロリットル）での濃縮物を得、合計3回、二回洗浄し、濃縮ステップを繰り返します。すべて捨てますフロースルー。 洗浄が完了したら、収集バイアルを捨てます。新しいコレクションバイアル内のすべての将来の溶離液や洗浄液を収集します。 注：H 2 18 OバッファダイジェストPNGアーゼは、化学的に脱アミド化になる脱グリコシル化アスパラギン部位の安定同位体標識のためのPNGアーゼF消化工程中に使用されてもよいです。 新鮮なコレクションバイアルに移した後、フィルタリングするためにグリセロールフリーのPNGase F（75,000のx単位/ ml）の2μlを添加します。 100μlの総容量をもたらし、PNGアーゼ消化バッファー98μl加えて、穏やかにアップピペットダウンフィルタに混合します。酵素的ステップ2.2.1、2.2.2、または2.2.3での条件の下でグリカンを消化。 注記：タンパク質の脱グリコシル化のための3つの方法が使用されてもよいです。もっぱらグライコミクス解析（なしプロテオミクス）の場合は、ステップ2.2.1で長い潜伏をお勧めします。グライコミクスおよびプロテオミクス研究のために、2.2.2および2.2.3は、最小限の非SPで高品質のペプチドを生成する手順ecific脱アミド。 グライコミクスのみの消化プロトコル（18時間）：酵素的に、すべてのNの -glycansを切断するために18時間、37℃でサンプルをインキュベートします。 スパイクで消化プロトコル（SPI）：2時間50℃でサンプルをインキュベートします。すぐに作業を、グリセロールフリーのPNGase F（75,000のx単位/ ml）の追加2μlのサンプルやスパイクを削除します。軽く混合するために1-2秒間のサンプルをボルテックス。さらに2時間50℃でサンプルをインキュベートします。 マイクロ波消化プロトコル（MD）：マイクロチューブフローティングラックに置くサンプル。 1Lのビーカー中のフロート試料を脱イオン（DI）水1リットルを充填しました。回転板付き電子レンジ（950 W）の中央にビーカーを置きます。 5分間、60％の電力（570 W）での電子レンジ。冷却するために、試料を除去し、室温で2分間保持します。次いで、60％のパワーでさらに5分間、マイクロ波。 注：マイクロ波電力設定は、マイクロ波の最大出力電力に基づいて調整される必要があります。平均電力は、モデル間の一定に保持する必要があります。 3.溶出Nの-glycans 20℃で20分間、14,000×gでサンプルを遠心分離することによりグリカンを溶出します。 20℃で20分間、14,000×gでフィルタや遠心分離機にPNGアーゼ消化緩衝液100μlを追加します。収集し、任意の残りのNを含む洗浄は、溶離液として同じコレクションバイアルに、グリカン-結合しました。二回繰り返します。新しいコレクションバイアルにフィルターと場所を削除します。 凍結した（30〜60分）まで-80°Cの冷凍庫でのグリカンのサンプルをインキュベートします。真空濃縮器（4-6時間）で室温で、完了までドライ。 注：N -glycans前誘導体化までの6ヶ月間-20℃で保存することができます。 4.タンパク質FASP消化注：プロテオミクスまたは脱アミド化部位の解析が望まれていない場合は、プロトコルの第4章をスキップしてもよいです。 トンをすすぎます彼は8 M尿素緩衝液400μlのと、脱アミド化ペプチドを含む、フィルタ。収集バイアルに蓋をし、軽く混合する渦。 15分間、14,000×gでフィルターに集中しています。すべてのフロースルーを捨てます。 3尿素緩衝液洗浄の合計のための手順を繰り返し4.1さらに2回、。 2 M尿素、10mMのCaCl 2を400μlの緩衝液（トリプシンバッファーをダイジェスト）で、脱アミド化ペプチドを含む、フィルターを洗浄します。収集バイアルに蓋をし、軽く混合する渦。 15分間、14,000×gでフィルターに集中しています。すべてのフロースルーを捨てます。 3トリプシンの合計を繰り返しステップ4.1をさらに2回は、バッファの洗浄を消化します。 洗浄が完了したら、収集バイアルを捨てます。新しいコレクションバイアル内のすべての将来の溶離液や洗浄液を収集します。 5トリプシン：それぞれのタンパク質（w / w）の検出または定量プロテオミクス実験用比1:50または1で50μlのブタ修正されたトリプシンを追加します。収集バイアルに蓋をし、軽く混合する渦。 2時間37℃でサンプルをインキュベートします。すぐに作業を、1：50または1でトリプシンの追加の50μlのサンプルやスパイクを削除：5トリプシン：タンパク質比。軽く混合するために1-2秒間のサンプルをボルテックス。さらに2時間50℃でサンプルをインキュベートします。 15分間、14,000×gで回転させることによりペプチドを溶出します。 400μlの1％ギ酸および0.001％のZwittergent 3-16（クエンチバッファー）でフィルターから残りのペプチドを洗い流します。 15分間、14,000×gで回転させることにより、フィルタをオフに溶出します。 ブラッドフォード19またはBCAアッセイ20によって試料中のペプチド濃度を定量します。 （30〜60分）を凍結するまで℃のフリーザーで-80ペプチドサンプルをインキュベートします。真空濃縮器（4-6時間）で室温で、完了までドライ。 注：乾燥したペプチドは、最大3ヶ月間-20℃で保存することができます。 直前LIQUIにトリプシンのタンパク質を再懸濁し2％アセトニトリル、98％のH 2 O、0.1％ギ酸（移動相A）中のdクロマトグラフィー-質量分析（LC-MS）分析を所望の濃度まで。 300 ngの/μlの – 100から2.5μlの血漿範囲からのトリプシンペプチド濃度。 N 5.誘導体化は、疎水性ヒドラジドタググリカンを-結合しました 0.25mg / mlの最終濃度のために、酢酸（誘導体化溶液）：75:25のMeOH 1mlの乾燥重（SIL）または光（NAT）P2GPN試薬を再構成します。試薬は完全に可溶化するために10分かかります。広範囲に完全な可溶化を確実にするためにボルテックス。 注：イベントでは、この誘導体化プロトコルは、標準のN -glycansで使用され、精製されたグリカンに対して、P2GPNのモル比：1：グリカンは、およそ（と劣ら）17以上あってはなりません。 タグは、SILまたはNAT P2GPN試薬200μlの（50μgの）とNの -glycansを乾燥させました。乾燥したグリカンを再懸濁するために上下にピペット。渦のsaその後mplesとベンチトップ遠心分離機に〜5秒間のサンプルをスピンダウン。 56℃で3時間試薬とグリカンを反応させます。 直ちに真空コンセントレータにインキュベーターからグリカンを移動します。 55°C（3-5時間）で完了にドライ。 注：この手順は誘導体化反応をクエンチ。サンプルは、後の工程で交差反応を防ぐために、完全に乾燥していなければなりません。 注：乾燥した、タグ付けされたサンプルは、最大6ヶ月間-20℃で保存することができます。 再懸 ​​濁直前LC-MS分析にH 2 Oの25-50μlのN個の -glycansをタグ付けしました。 Nの -glycansが完全に可溶化していることを確認するために上下にピペット。 注：再懸濁のボリュームは、出発タンパク質濃度から推定することができる糖タンパク質の開始濃度に依存します。しかし、範囲はサンプルタイプごとに異なりますし、個別に最適化されなければなりません。 5分間、14,000×gで遠心分離したサンプル。 supernを削除しますatant、ピペットの先端は遠心管の底に触れないように注意して。 注：過剰タグは目には見えないかもしれないが、遠心分離によって削減されます。 タンデム分析のための1：1の比率で、相対的な定量化のために必要であれば、NATやSILサンプルのペアを結合します。 6.超高圧液体クロマトグラフィーと質量分析注：簡単NLC-1000およびQ Exactive高磁場のために説明したLCとMSの条件は、それぞれ、社内のプロテオミクス解析のためおよびグリカン分析21のために最適化しました。これらの条件は、他の超高耐圧またはナノLCシステムなどの高分解能質量分析計に適合させることができるが、若干の変更を必要とし得ます。高分解能質量分析法の使用は、グリカン同定および脱アミド解析22,23のために必要です。 注：手順6.1から6.3をsとすることができます適切な逆相クロマトグラフィーまたは親水性相互作用商業トラップカラムが使用される場合kipped。 Meiring らトラップとして使用するための24によると、100μMのIDキャピラリーでフリットを合成します。 、2.6μMで100オングストローム、C 18梱包材と5cmの長さに切断し、圧力下でのトラップを梱包してください。 2.6μM、100Å、C 18充填剤を圧力下で75μMIDエミッタ列をパックし、30cmの長さに切断。 プロテオミクス（6.4.1）とグライコミクス（6.4.2）のワークフローのための2つの異なるLC-MS法を準備します。 注：タンパク質およびグリカン試料は、任意の順序で同じトラップ/列の設定で実行されてもよいです。 タンパク質分析のために、移動相A（MPA）でカラム上にタンパク質の〜400 ngのを注入します。 1μlのプレカラム平衡化（500バール）及び5μlの分析カラムの平衡化と、 表1によれば、300 NL /分でサンプルを実行します（500バール）。 表2に提供MS条件下でタンパク質をイオン化します。 グリカン分析のために、再懸濁の5μLを注入し、P2GPNをカラムにNAT / SIL等モルのサンプルをタグ付けしました。 2μlのプレカラム平衡化（500バール）5μlを分析カラムの平衡化（500バール）で、 表3によると、300 NL / minでサンプルを実行します。 表4にMS条件下グリカンをイオン化します。 時間 ％MPA ％MPB 0 100 0 5 98 2 105 80 20 135 68 32 136 5 95 151 5 95 152 100 0 167 100 0 プロテオーム解析のために、表1 LC条件。移動相B（MPB、98％アセトニトリル、2％のH 2 O、0.1％ギ酸）を用いた勾配溶出は、ショットガンプロテオミクス、データ依存取得するためのペプチドを溶出するために行きました、MS実験。 MS 1パラメータ 質量範囲（TH） 375-1500 解決 12万 AGC 1×10 6 最大イオン化時間 30 S-レンズFRレベル 55 キャピラリーテムP（°C） 300 電圧をスプレー 1.75 MS 2パラメータ 取得タイプ TOP20 解決 15,000 AGC 1×10 5 最大イオン化時間 30 アンダーフィルレシオ 2％ 分離ウィンドウ（TH） 1.4 充電状態の除外 1 正規化衝突エネルギー 27 除外時間（s） 20 表2：プロテオーム解析のためのMS条件エレクトロスプレーイオン化のためのパラメータ、MS 1の取得、および高エネルギーdissociatioを使用してオービトラップ機器におけるMS 2買収。n個（HCD）が与えられています。 時間 ％MPA ％MPB 0 95 5 1 70 30 41 60 40 46 37 63 47 10 90 55 10 90 56 95 5 66 95 5 表3：グリカン分析のためのLC条件グラジエント溶出ヒドラジドNは MS分析のためにタグ付けさ-glycans溶出するために行きました。 <TR> MS 1パラメータ 質量範囲（TH） 600-1900 解決 60,000 AGC 5×10 5 最大イオン化時間 64 S-レンズFRレベル 65 キャピラリー温度（°C） 325 電圧をスプレー 1.75 MS 2パラメータ 取得タイプ Top12 解決 15,000 AGC 5×10 4 最大イオン化時間 100 アンダーフィルレシオ 1％ 分離ウィンドウ（TH） 1.4 固定された第1マス</tD> 125 段付正規化衝突エネルギー 10/20/30 除外時間（秒） 15 表4：ヒドラジドのためのMS条件は、N -glycan分析をタグ付けされたエレクトロスプレーイオン化のためのパラメータ、MS 1の取得、および高エネルギー解離（HCD）を使用してオービトラップ機器におけるMS 2買収が与えられています。 7.プロテオミクス、脱アミド化分析標準のバイオインフォマティクス検索ツールを使用して、タンパク質/ペプチドを同定します。 注：以下の分析プロトコルはUniprotKBにスイス-Protの/ TREMBLデータベースを使用し、プロテオームDiscovererの1.4ソフトウェアでSEQUESTを経由して検索するように設計された、しかし、プロトコルは直接GUIソフトウェアを使用して、任意のタンパク質の検索とスコアリングエンジンに変換することができます。以下に与えられたすべてのコマンドは、ドロップダウンメニューでのソフトウェアインタフェースにアクセスすることができます。 <LI> Apweiler らによって記載されているように、ゲノムデータまたは利用可能なプロテオームデータベースから生物適切なタンパク質配列データベースを作成するか、またはダウンロードしてください。25 注意：一般的なプロテオームデータベースはスイス-Protの、TREMBL、およびNCBIが挙げられるが、これらだけでなく、社内のデータから構築することができます。 パーキンスらによって記載されているように、ソフトウェアの中で、取得したデータの品質及び所望の検索の硬直性に応じてデータベースの検索エンジンを選択したパラメータを選択します。 MASCOT 26または工学ら SEQUEST 27用のため。 高質量精度のデータについては、ソフトウェアでの検索の設定パラメータは、次のように最大2切れ残り、5 ppmの前駆体の質量許容度、および0.02ダフラグメント質量許容値（最適化された正確な脱アミド化検出22用）とを以下のトリプシンペプチドの修飾を含みます：「カルバミドメチル（C）「静的な変更及び「脱アミド（N / Q）」と「牛idation（M）「動的な変更。18 O消化の標識を使用している場合には、含まれる「脱アミド18 O（1）「追加の動的な変更など。 探索、タンパク質データベース（7.1.1）に対して選択されたエンジン、生のペプチドのデータを使用。 注：質量公差が使用される機器のための適切かつ任意に低くないでなければなりません。 注：検索機能は、さまざまな検索エンジン特定のアルゴリズムを使用してソフトウェアによって自動的に完了します。パーコレーターアルゴリズム（MASCOT）、SEQUEST、またはアルゴリズムの他の組み合わせは、ペプチドからタンパク質を同定するとヒットの妥当性を獲得するために使用されています。使用可能なツールの詳細については、ゴンザレス-Galarza ら 28,29からのレビューで覆われています。ソフトウェアによって、追加の検索パラメータは、ユーザの判断に応じて選択する必要があるかもしれません。 マニュアルキュレーションとフュルトのために同定されたペプチドをエクスポートえー分析。 手動でNのアスパラギンに識別された脱アミドを含有するペプチドのリストをキュレーショングリコシル化モチーフ（X≠P NX-（S / T）、）を-結合。文献から既知のグリコシル化モチーフを有するこれらのサイトをクロス検証し、その結果（検証と理論）の2つのプールを作成します。 脱アミド化および非脱アミド化形態の存在量を比較することによって、与えられたグリコシル化部位のパーセント占有率を比較するために、スペクトルカウント30を使用してください。 8.グリカン相対定量注：以下の同定および定量はXCaliburソフトウェアを使用して完成させました。しかし、生のデータを分析し、自動的にクロマトグラフィーピークを統合するソフトウェアは、置換されていてもよいです。 ヘキソース、デオキシヘキソース、ヘキソサミン、シアル酸の生物学的に可能な組み合わせからグリカン組成物の理論的なリスト、および他のSAを生成しますccharides。この目的のために、人間のグリカンデータベースはウォーカーら 15によって公開されており、そのまま使用してもよいです。理論上のデータベースでは、種特異的な生物学的な制約は、組み合わせた空間に課さなければならず、これらのルールはKronewitter ら 31に記載されています。 プロトン電荷状態+ 1-3用の各組成物について原子質量からグリカンモノアイソトピック質量（M）を計算します。 NAT（254.14191グラム/モル）またはSIL（260.162042グラム/モル）P2GPNタグの追加を含むようにモノアイソトピック質量を変更します。 XCaliburにおけるロードマップビューから「処理設定」プログラムを開きます。正確ウォーカーらから補足資料に記載されているように、[M + H] 1+、[M + 2H] 2+のための理論的モノアイソトピック質量を含むステップ8.2で作成したリストを使用して15。処理方法を設定し、[ M + 3H] 3+種。 注：正確超えグリカン同一性を確認するには質量は、NAT用/ SILは、NATとSIL N -glycanペアが同じ保持時間との共溶出することを確認し、実行を二重化しました。定性的には、オキソニウムイオンシリーズ32に属するピークを含んでいなければならない、MS 2スペクトルと識別をクロス検証します。 正確ウォーカーらから補足資料に記載されているように、SILとNAT存在量を得るために、Excelに領域を統合、抽出イオンクロマトグラム（XIC）をエクスポートします。15 Excelでは、プログラムの新しい列のセルは、ウォーカーらによって公表式に従ってSILの豊かさを調整することにより、分子量のオーバーラップのための補正を計算する1 5。： 、 Aは、モノアイソトピックピークと理論的な同位体の重なりがある場合、 、独立して、組成物ごとに計​​算することができます。 ウォーカーらが説明したように、第2欄には、プログラム細胞は、スペクトルごとに、合計正規化されたグリカン因子（TGNF）の計算式を使用して、NATとSILのチャンネルを正規化する1 5。： 、 Nは、定量限界上記のN -glycansの数です。 2サンプル間の濃度の倍率変化を計算するために、NATグリカン（またはその逆）：新しい列には、プログラム細胞は、SILの比を取ります。