JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

Glycomics כמוני ואסטרטגית טיהור המשולבת פרוטאומיקה

Published: March 08, 2016
doi:
10.3791/53735
, ,
1Department of Chemistry,North Carolina State University

Summary

A high-throughput protocol was developed for combined proteomics and glycomics purification and LC-MS/MS quantification in plasma. Deamidation analysis of N-linked glycosylation motifs was specific to deglycosylated sites. Accurate quantitation of N-glycans was achieved by coupling filter aided N-glycan separation to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy.

Abstract

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define pathways, improve treatment, understand disease, and aid biomarker discovery. N-linked glycosylation is one of the most important and robust post-translational modifications on proteins and regulates critical cell functions such as signaling, adhesion, and enzymatic function. Analytical techniques to purify and analyze N-glycans have remained relatively static over the last decade. While accurate and effective, they commonly require significant expertise and resources. Though some high-throughput purification schemes have been developed, they have yet to find widespread adoption and often rely on the enrichment of glycopeptides. One promising method, developed by Thomas-Oates et al., filter aided N-glycan separation (FANGS), was qualitatively demonstrated on tissues. Herein, we adapted FANGS to plasma and coupled it to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy in order to achieve accurate relative quantification by liquid chromatography mass spectrometry and enhanced electrospray ionization. Furthermore, we designed new functionality to the protocol by achieving tandem, shotgun proteomics and glycosylation site analysis on hen plasma. We showed that N-glycans purified on filter and derivatized by hydrophobic hydrazide tags were comparable in terms of abundance and class to those by solid phase extraction (SPE); the latter is considered a gold standard in the field. Importantly, the variability in the two protocols was not statistically different. Proteomic data that was collected in-line with glycomic data had the same depth compared to a standard trypsin digest. Peptide deamidation is minimized in the protocol, limiting non-specific deamidation detected at glycosylation motifs. This allowed for direct glycosylation site analysis, though the protocol can accommodate 18O site labeling as well. Overall, we demonstrated a new in-line high-throughput, unbiased, filter based protocol for quantitative glycomics and proteomics analysis.

Introduction

בתחום חקר חלבונים, הכנת מדגם בעזרת מסנן (FASP) אומצה באופן נרחב על יכולתו כדי למזער את הכמות של חומר מוצא, להקטין חפצי הכנת מדגם, וכן למקסם את תפוקת מדגם 1. עם זאת, שיטה כזו אמורה לצמוח ולהשיג מתיחה לתחום glycomics. פיתוח של תפוקה גבוהה, זרימות עבודה כמותיים נדרשות בגלל התפקיד האינטגרלי של glycosylation בהגנה ביולוגית האפנון על ידי סרטן או מחל 2,3. ביונקים, -glycans N מורכבים חוזר יחידות saccharide (hexoses (Hex), hexosamines (HexNac), חומצות sialic (NeuAc), ו fucoses (FUC)), אשר לקשט מבנה הליבה (Hex 3 HexNac 2) 4 קוולנטית כבול כדי asparagine. למרות glycospace הוא גדול משמעותית כאשר איזומרים נספרים (> 10 12), הוא קטן למדי על בסיס הרכב ומשקל מולקולרי בדרך כלל נע בין 1,000-8,000 Da 5 </ Sup>. ההומוגניות ההלחנה של המעמד ואת hydrophilicity של גליקנים אתגרים ייחודיים טיהור, הפרדה, ו ספקטרומטריית מסה (MS) זרימות עבודה 6.

באופן מסורתי, -glycans N מתעכלים מחלבונים או פפטידים על ידי peptide- N -glycosidase F (PNGase F) והעשירו מכן על ידי זיקה לקטינים כרומטוגרפיה 7, שנתפסו על ידי חרוזים hydrazide 8, או מטוהרים באמצעות מיצוי שלב מוצק (SPE) 9,10. בעוד שיטות אלה הן כל יעילות, הם מציגים שלבים נוספים עבור desalting ולהגביל את מספר דגימות מעובד בו זמנית. בעשור האחרון, מספר רב של פלטפורמות תפוקה גבוהה עבור glycomics הוצע. קים et al. מפרסמת שיטה חצי אוטומטית באמצעות מופעלי ואקום, 96-גם צלחת SPE 11. לחלופין, שיטת זיקה-מסנן (N -glyco-FASP) פותחה על ידי קבוצת מאן, אשר חייבה את derivatization הראשונית של fiLTER עם שילוב של לקטינים 12. לבסוף, הקבוצה תומאס-אוטס הציע שיטה כמותית למחצה, מסנן בעזרת N -Glycan ההפרדה (ניבים), אשר ניצלו את גודל הרכב הצר של glycospace 13. בהסתמך על מסנני משקל מולקולרי חתוכים, מזהמים קטנים נשטפו ראשון לבזבז ואז -glycans N היו מתעכלים eluted. חלבונים Deglycosylated להישאר על המסנן בפרוטוקול זה ואת יכולה להיות נתונה FASP ב-קו.

זיהוי וכימות של גליקנים על ידי יינון electrospray (ESI) MS דורשים off-line פרדות עבור (חלקית) ברזולוציה של איזומרים derivatization לגילוי של מינים נמוכים בשפע. תיוג של האינדיבידואליות כאשר נרמול עם האסטרטגיה תגי hydrazide glycan מקנה תאימות עם כרומטוגרפיה נוזלית הפוכה פאזיים (RPLC) 14,15. 4-phenethyl-benzohydrazide (P2PGN) תג הידרופובי מתווך hydrophilicity של גליקנים, enhancing יינון ידי, בממוצע, פי ארבעה 16. למרות טכניקות אחרות, כגון permethylation 17 או אמין-reactive כימי תיוג 18, מציעות יתרונות דומים, תגובת hydrazide, גליקנים מגיבים 1: 1 stoichiometrically בתנאים קלילים. כימות יחסית מושגת על ידי ניתוח טנדם של דגימות derivatized עם הילידים (NAT) או 13 תוויות איזוטופ סטאבילה C 6 (SIL).

השיטה הבאה מתפתחת ניבים ליישומי פלזמה וזוגות אותו אל תג הידרופובי P2GPN כימות ביחס מדויק. יתר על כן, היא תוכננה לבצע חקר חלבונים רובה הציד, פרופיל deamidation, ו glycomics כמוני על aliquot יחיד של מדגם, מבלי להתפשר על שלמות הניתוחים.

Protocol

חלבון 1. גליקופרוטאין Denaturation ו אלקילציה תכשירים סטנדרטיים, עומס 2.5 μl של פתרון 0.1 מיקרוגרם / μl של גליקופרוטאין (למשל Fetuin או RNase B) על 30 kDa או 10 משקל מולקולרי kDa (MW) חתוכים מסננים. לקבלת דוגמיות פלזמה ביולוגיות, לבדוק את ריכוז החלבון על ידי 20 חומצת תקן ברדפורד 19 או bicinchoninic (BCA) assay חלבון. לדלל את הפלזמה, במידת הצורך, עם אמוניום ביקרבונט 100 מ"מ (NH 4 HCO 3) ב H 2 O (Buffer Digest PNGase) ב- pH של ~ 7 להכיל בין 10-100 מ"ג / מ"ל החלבון הכולל. פלזמה טען 2.5 μl (25-250 חלבון מיקרוגרם) על מסנן. הערה: פרוטוקול זה נבדק רק על פלזמה מדגימות דם שנאספו בנוכחות חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA). הוסף 2 μl של 1 M Dithiothreitol פתרון (DTT) לדגום כל במסנן. לדלל את המדגם עם 200 μl PNGase לעכל חיץ. כיסוי או צינור מסנן מדגם מערבולת בקלילות, נזהר שלא להפריע את המסנן ממקומו שלה. דגירת המדגם ב 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לפגל חלבונים גליקופרוטאינים. כדי alkylate הדגימות, להוסיף 50 μl 1 M iodoacetamide, לתת ריכוז סופי של ~ 200 מ"מ, ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. הערה: אם הניתוח פרוטאומיקה אינו רצוי, צעד 1.5 ניתן לדלג. תתרכז גליקופרוטאין מפוגל על ​​המסנן על ידי צנטריפוגה דגימות ב 14,000 XG במשך 40 דקות. וזורקים לזרום. 2. N -linked עיכול אנזימתי glycan לשטוף את המדגם עם 100 μl PNGase לעכל חיץ. תתרכז גליקופרוטאין על המסנן 14,000 XG במשך 20 דקות וזורקים לזרום. חזור על השלב לשטוף ותרכיז פעמים, עבור סכום כולל של שלוש פעמים, מניב להתרכז בהיקף המת המסנן (~ 5 μl). מחק את כללזרום דרך. בקבוקון אוסף מחק פעם השטיפות הושלם. לאסוף את כל eluents ושוטף בעתיד בבקבוקון הקולקציה חדש. הערה: PNGase לעכל חיץ H 2 O 18 ניתן להשתמש במהלך שלב עיכול PNGase F תיוג איזוטופ יציב של אתרי asparagine-glycosylated דה, אשר הופכים כימי deamidated. הוסף 2 μl של נטול גליצרול PNGase F (75,000 x יחידות / מ"ל) כדי לסנן אחרי שעברה בקבוקון אוסף טרי. להוסיף 98 μl של PNGase לעכל חיץ, להביא הנפח הכולל עד 100 μl, ו פיפטה בעדינות מעלה ומטה על מסנן לערבב. Enzymatically לעכל את גליקנים בתנאים בצעדים 2.2.1, 2.2.2, 2.2.3 או. הערה: שלוש שיטות עבור deglycosylation של חלבונים ניתן להשתמש. לניתוח glycomics בלבד (לא חקר חלבונים), הדגירה הארוכה בשלב 2.2.1 מומלצת. למחקר glycomics ו פרוטאומיקה, צעדים 2.2.2 ו -2.2.3 יפיק פפטידים באיכות גבוהה עם אי-sp מינימליdeamidation ecific. Glycomics בלבד פרוטוקול העיכול (18hr): דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות כדי לבקע enzymatically כל -glycans N. ספייק-בפרוטוקול העיכול (SPI): דגירה דגימות ב 50 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. עבודה במהירות, להסיר דגימות ספייק בתוך μl 2 נוספות של F PNGase ללא גליצרול (75,000 x יחידות / מ"ל). קלות המערבולת דגימות במשך 1-2 שניות כדי לערבב. דגירת הדגימות ב 50 מעלות צלזיוס למשך שעה 2 נוספת. פרוטוקול עיכול מיקרוגל (MD): דגימות מקום במעמד צף microcentrifuge צינור. דגימות Float בכוס L 1 מלא 1 ליטר של מים deionized (DI). מניחים את הכוס במרכז במיקרוגל (950 W) עם צלחת מסתובבת. מיקרוגל בהספק 60% (570 W) במשך 5 דקות. כדי לקרר, להסיר דגימות וחזקות בטמפרטורת חדר למשך 2 דקות. ואז במיקרוגל במשך 5 דקות נוספות בהספק 60%. הערה: הגדרות צריכת חשמל מיקרוגל תצטרכנה להיות מותאמות על בסיס עוצמת השידור המרבי של במיקרוגל.הספק ממוצע צריך להיות מוחזק קבוע בין הדגמים. 3. Elution של N -glycans Elute גליקנים על ידי צנטריפוגה מדגם ב 14,000 XG במשך 20 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. הוספת 100 μl של PNGase לעכל חיץ לפילטר צנטריפוגות ב 14,000 XG במשך 20 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. אסוף לשטוף המכילים כל שנותר N -linked glycan, באותו בקבוקון אוסף כמו eluent. חזור פעמיים. הסר מסנן ומכניסים בקבוקון אוסף חדש. דגירה דגימות glycan במקפיא -80 ° C עד (דקות 30-60) קפוא. יבש עד להשלמתו, בטמפרטורת החדר, ב concentrator ואקום (4-6 שעות). הערה: N -glycans עשוי להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים לפני derivatization. 4. חלבון עיכול FASP הערה: אם פרוטאומיקה או deamidation באתר ניתוח אינו רצוי, סעיף 4 של הפרוטוקול ניתן לדלג. לשטוף tהוא לסנן, המכיל פפטידים deamidated, עם 400 μl של חיץ 8 אוריאה ז. כיסוי או בקבוקון אוסף קלות המערבולת לערבב. תתרכז המסנן 14,000 XG במשך 15 דקות. מחק את כל הזרימה דרך. חזור על שלב 4.1 פעמים נוספות, עבור סכום כולל של שטיפות חיץ שלוש אוריאה. יש לשטוף את המסנן, המכיל פפטידים deamidated, עם 400 μl של 2 M אוריאה, 10 מ"מ CaCl 2 חיץ (טריפסין לעכל חיץ). כיסוי או בקבוקון אוסף קלות המערבולת לערבב. תתרכז המסנן 14,000 XG במשך 15 דקות. מחק את כל הזרימה דרך. חזור על שלב 4.1 פעמים נוספות, עבור סכום כולל של טריפסין שלוש לעכל שוטף חיץ. בקבוקון אוסף מחק פעם השטיפות הושלם. לאסוף את כל eluents ושוטף בעתיד בבקבוקון הקולקציה חדש. הוסף 50 μl טריפסין החזירי שונה בתוך 1:50 או 1: טריפסין 5: חלבון (w / w) יחס לניסויי גילוי או פרוטאומיקה כמוני, בהתאמה.כיסוי או בקבוקון אוסף קלות המערבולת לערבב. דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. עבודה במהירות, להסיר דגימות ספייק בתוך 50 μl נוספים של טריפסין על 1:50 או 1: יחס חלבון: טריפסין 5. קלות המערבולת דגימות במשך 1-2 שניות כדי לערבב. דגירת הדגימות ב 50 מעלות צלזיוס למשך שעה 2 נוספת. Elute פפטידים על ידי ספינינג ב 14,000 XG במשך 15 דקות. שוטפים את פפטידים הנותרים ממסנן עם 400 μl 1% חומצה פורמית 0.001% Zwittergent 3-16 (חיץ להרוות). Elute את המסנן על ידי ספינינג ב 14,000 XG במשך 15 דקות. לכמת את ריכוז הפפטיד בדגימות על ידי ברדפורד 19 או BCA assay 20. דגירת דגימות פפטיד מקפיאה -80 מעלות צלזיוס עד קפוא (30-60 דקות). יבש עד להשלמתו, בטמפרטורת החדר, ב concentrator ואקום (4-6 שעות). הערה: פפטידים יבשים ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד שלושה חודשים. Resuspend חלבונים tryptic רק לפני Liquiד-כרומטוגרפיה המוני ספקטרומטריית (LC-MS) ניתוח אצטוניטריל 2%, 98% H 2 O, ו -0.1% חומצה פורמית (שלב א נייד) לריכוז רצוי. ריכוזי הפפטיד tryptic מטווח פלזמה 2.5 μl מ 100 – 300 ננוגרם / μl. Derivatization 5. N -linked גליקנים עם הידרופובי Hydrazide תגיות לשקם קל או כבד מיובש (SIL) (NAT) ריאגנטים P2GPN ב 1 מ"ל של 75:25 MeOH: חומצה אצטית (פתרון derivatization), ריכוז סופי של 0.25 מ"ג / מ"ל. ריאגנטים ייקחו עד 10 דקות כדי solubilize מלא. מערבולת נרחבת כדי להבטיח solubilization מלא. הערה: במקרה פרוטוקול derivatization זה נמצא בשימוש עם -glycans תקן N, לעומת גליקנים מטוהרים, היחס הטוחן של P2GPN: glycan צריך להיות כ (ולא פחות) מ -17: 1. תג יבשים N -glycans עם 200 μl (50 מיקרוגרם) של מגיב SIL או NAT P2GPN. פיפטה מעלה ומטה כדי resuspend גליקנים יבשים. sa וורטקסmples ואז ספין למטה דוגמאות ~ 5 שניות על צנטריפוגות הספסל העליון. מגיב גליקנים עם ריאגנט עבור 3 שעות ב 56 מעלות צלזיוס. מיד להעביר גליקנים מן החממה עד concentrator ואקום. יבש עד להשלמתו על 55 מעלות צלזיוס (3-5 שעות). הערה: שלב זה מרווה התגובה derivatization; חייב להיות המדגם יבש לחלוטין למנוע תגובתיות צולבת בשלבים הבאים. הערה: יבשים, מתויג דגימות עשויות להיות מאוחסנות ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים. Resuspend מתויג N -glycans ב 25-50 μl של H 2 O רק לפני ניתוח LC-MS. פיפטה מעלה ומטה כדי להבטיח -glycans N הם solubilized לחלוטין. הערה: היקף עבור resuspension הוא תלוי בריכוז ההתחלתי של גליקופרוטאין, אשר עשוי להיות מוערך מן הריכוז המוצא חלבון. עם זאת, בטווח ישתנה לפי סוג מדגם צריך להיות מותאם באופן אינדיבידואלי. דגימות צנטריפוגה ב 14,000 XG במשך 5 דקות. הסר את supernatant, נזהר לא לתת את קצה פיפטה לגעת התחתון של הצינור צנטריפוגות. הערה: תג עודף לא יכול להיות גלוי לעין, אך יופחת על ידי צנטריפוגה. שלב זוג דגימות NAT ו- SIL, אם תרצה בכך כימות יחסית, ביחס של 1: 1 לניתוח טנדם. 6. Ultra-בלחץ גבוה כרומטוגרפיה נוזלית וניתוח ספקטרומטריית מסה הערה: תנאי LC ו- MS תארו קלים nLC-1000 ושדה גבוה Q Exactive, בהתאמה, היו אופטימיזציה ללא צורך במיקור חוץ עבור ניתוח proteomics ו לניתוח glycan 21. תנאים אלו יכולים להיות מותאמים למערכות LC גבוהות במיוחד pressure- או ננו אחרות ספקטרומטרים המוניים כוח גבוה בפתרון אחרים אבל עשוי לדרוש שינויים קלים. השימוש ספקטרומטריית מסה מתח גבוה בפתרון הכרחי לזיהוי glycan וניתוח deamidation 22,23. הערה: שלבי 6.1-6.3 יכול להיות יםkipped אם כרומטוגרפיה הפוכה פאזיים מתאים או מלכודת ועמודה מסחרית אינטראקצית הידרופילי משמשות. לסנתז frit ב נימי 100 מיקרומטר מזהה פי Meiring et al. 24 לשימוש כמלכודת. ארוז את המלכודת בלחץ עם 2.6 מיקרומטר, 100, חומרי אריזה C 18 ופצע באורך של 5 סנטימטר. לארוז טור פולט מזהה 75 מיקרומטר תחת לחץ עם 2.6 מיקרומטר, 100, חומרי האריזה C 18 ופצע באורך של 30 ס"מ. הכינו שתי שיטות LC-MS שונה עבור פרוטאומיקה (6.4.1) ו glycomics (6.4.2) זרימות עבודה. הערה: חלבון דגימות glycan ניתן לרוץ על ההתקנה מלכודת / עמודה זהה בכל סדר. לניתוח חלבונים, להזריק ~ 400 ng של חלבון על הטור בשלב נייד (MPA). הפעל את המדגם ב 300 NL / min, לפי טבלה 1, עם איזון 1 μl מראש הטור (500 הבר) וכן איזון עמודה 5 μl אנליטיים(500 בר). ליינן חלבונים בתנאי MS הניתנים בטבלה 2. לניתוח glycan, להזריק 5 μl של resuspended, P2GPN מתויג NAT / SIL דגימות equimolar על הטור. הפעל את המדגם ב 300 NL / min, לפי טבלה 3, עם איזון 2 μl מראש טור (500 בר) וכן איזון טור אנליטי 5 μl (500 בר). ליינן גליקנים בתנאי MS הניתנים בטבלה 4. זְמַן MPA% MPB% 0 100 0 5 98 2 105 80 20 135 68 32 136 5 95 151 5 95 152 100 0 167 100 0 טבלת 1. תנאי LC לניתוח proteomic. Elution שיפוע עם B שלב נייד (MPB, 98% אצטוניטריל, 2% H 2 O, 0.1% חומצה פורמית) בוצעו על מנת elute פפטידים עבור פרוטאומיקה-רובה ציד, נתוני רכישה תלויה , ניסויי MS. פרמטרים MS 1 Mass טווח (Th) 375-1500 הַחְלָטָה 120,000 AGC 1 × 10 6 מקס יינון זמן 30 S-Lens FR רמה 55 נימי TemPC) 300 תרסיס מתח 1.75 פרמטרים MS 2 סוג הרכישה Top20 הַחְלָטָה 15,000 AGC 1 × 10 5 מקס יינון זמן 30 יחס underfill 2% חלון בידוד (ה ') 1.4 הרחקת מדינת תשלום +1 אנרגית התנגשות מנורמלת 27 זמן הכללה (ים) 20 טבלה 2: MS תנאים לניתוח proteomic הפרמטרים עבור יינון electrospray, רכישת MS 1, ו- MS 2 רכישת מכשיר orbitrap באמצעות dissociatio אנרגיה גבוהה יותר.n (HCD) מקבלים. זְמַן MPA% MPB% 0 95 5 1 70 30 41 60 40 46 37 63 47 10 90 55 10 90 56 95 5 66 95 5 טבלה 3:. תנאי LC לניתוח glycan elution שיפוע בוצע כדי elute hydrazide מתויג N -glycans לניתוח MS. <tr> פרמטרים MS 1 Mass טווח (Th) 600-1900 הַחְלָטָה 60,000 AGC 5 × 10 5 מקס יינון זמן 64 S-Lens FR רמה 65 Temp נימים (° C) 325 תרסיס מתח 1.75 פרמטרים MS 2 סוג הרכישה Top12 הַחְלָטָה 15,000 AGC 5 × 10 4 מקס יינון זמן 100 יחס underfill 1% חלון בידוד (ה ') 1.4 קבועה מהדרגה הראשונה Mass </tד> 125 אנרגית התנגשות מנורמלת פסעה 10/20/30 הכללת זמן (שניות) 15 לוח 4: תנאי MS עבור hydrazide מתויג ניתוח N -glycan הפרמטרים עבור יינון electrospray, רכישת MS 1, ו- MS רכישת 2 מכשיר orbitrap באמצעות ניתוק-אנרגיה גבוהה יותר (HCD) מקבלים.. פרוטאומיקה 7. וניתוח Deamidation לזהות חלבונים / פפטידים באמצעות כלי חיפוש ביואינפורמטיקה סטנדרטיים. הערה: פרוטוקול הניתוח הבא תוכנן באמצעות מסדי נתונים Swiss-Prot / TrEMBL ב UniprotKB וחיפוש דרך SEQUEST בתוכנה 1.4 Discoverer Proteome, אולם בפרוטוקול עלול להיות מתורגם ישירות לכל מנוע חיפוש הניקוד חלבון באמצעות תוכנת GUI. כל הפקודות כדלקמן ניתן לגשת ממשקי תוכנה באמצעות תפריטים נפתחים. <li> צור או להוריד מסד נתוני רצף החלבון מתאים האורגניזם מנתונים גנומית או מסדי נתוני proteome זמינים כפי שתואר על ידי Apweiler et al. 25 הערה: מאגרי מידע proteome נפוצים כוללים Swiss-Prot, TrEMBL, ואת צמח שדה, אך ניתן לבנות מנתונים בתוך הבית גם כן. בתוך התוכנה, לבחור מנוע חיפוש בבסיס נתונים ופרמטרים בחרו לפי איכות הנתונים שנרכשו ואת הכללים המחמירים של החיפוש הרצוי, כפי שתואר על ידי פרקינס et al. עבור הקמע 26 או Eng et al. עבור SEQUEST 27. לקבלת נתוני דיוק גבוהים המוניים, מאפיינים קבועים עבור החיפוש בתוכנה כדלקמן: שסעי מקסימום 2 החמיץ, 5 עמודים לדקה מבשר סובלנות המונית, 0.02 סובלנות Da שבר מסה (לגילוי deamidation המדויק אופטימיזציה 22) וכולל את שינויי פפטיד tryptic הבאים : "carbamidomethyl (C)" שינוי סטטי "deamidation (N / Q)" ו "שורidation (M) "שינויים דינמיים. אם אתה משתמש 18 O תיוג עיכול, כולל" deamidation 18 O (1) "בתור שינוי דינמי נוסף. חיפוש, באמצעות המנוע שנבחר, נתוני פפטיד הגלם מול מסד נתוני החלבון (7.1.1). הערה: טולרנסים Mass צריכים להיות מתאימים עבור המכשיר בשימוש ולא נמוכים באופן שרירותי. הערה: פונקציית החיפוש הושלמה באופן אוטומטי על ידי התוכנה באמצעות אלגוריתמים ספציפיים חיפוש שונה מנוע. האלגוריתם פרקולטור (הקמע), SEQUEST, או שילובים אחרים של אלגוריתמים מועסקים לזהות חלבונים ופפטידים להבקיע את תוקפו של להיטים; מידע נוסף על הכלים הזמינים מכוסים בביקורתם מ גונזלס-Galarza et al. 28,29. בהתאם לתוכנה, פרמטרים חיפוש נוספים ייתכן שיהיה צורך נבחרים על פי שיקול דעתו של המשתמש. יצאת את פפטידים המזוהים אוצרות ו Furth ידניותניתוח אה. ידני לאצור רשימה של פפטידים המכילים deamidation מזוהה על asparagine של N -linked מוטיב glycosylation (NX- (S / T), כאשר X ≠ P). חוצה לאמת את האתרים הללו עם מוטיבים glycosylation הידוע מהספרות וליצור שתי בריכות של התוצאות (תוקף תיאורטי). השתמש רפאי ספירה 30 להשוות את תפוסת אחוזי אתר glycosylation נתון על ידי השוואת השפע של צורות deamidated והלא deamidated. 8. כימות glycan יחסית הערה: זיהוי וכימות הבאים הושלמה באמצעות תוכנת Xcalibur. עם זאת, כל תוכנת מנתחת נתונים גולמיים ומשלבת אוטומטי פסגות chromatographic ניתן להחליף. צור רשימה תיאורטית של יצירות glycan מן הצירופים אפשריים הביולוגי של hexoses, deoxy-hexoses, hexosamines, חומצות sialic, ו- SA האחרccharides. לשם כך, מסד נתונים glycan אנוש יוצא לאור על ידי ווקר et al. 15 וניתן להשתמש בו כפי שהוא. עבור מסדי נתונים תיאורטיים, אילוצים ביולוגיים ספציפי מינים חייבים להיות מוטלים על שטח קומבינטורית, וכללים אלה מתוארים על ידי Kronewitter et al. 31. חשבתי את המוני monoisotopic glycan (M) מההמונים האטומיים לכל רכב למדינות תשלום פרוטון + 1-3. שנה את ההמונים monoisotopic לכלול תוספת של NAT (254.14191 g / mol) או SIL (260.162042 g / mol) תג P2GPN. פתח את התוכנית "הגדרת עיבוד" מתצוגת מפת הדרכים Xcalibur. הגדרת שיטת עיבוד כמתואר בדיוק ההשלמות מווקר et al. 15 באמצעות הרשימה שנוצר בשלב 8.2 המכיל את ההמונים monoisotopic התיאורטי [M + H] 1+, [M + 2H] 2 +, ו [ M + 3H] 3+ מינים. הערה: כדי לאמת את זהות glycan מעבר מדויקהמוני עבור NAT / SIL duplexed ריצות, לבדוק כי NAT ו- SIL N -glycan זוגות שיתוף elute עם אותו זמן השמירה. איכותי, צולב לאמת הזדהויות עם ספקטרה 2 MS, אשר חייב לכלול פסגות השייכים סדרת oxonium יון 32. יצא את הכרומתוגרמה יון משולבת, חילוץ (XIC) באזורים ל- Excel כדי להשיג את שכיחותם SIL ונט כמתואר בדיוק ההשלמות מווקר et al. 15 ב- Excel, תכנית תאי עמודה חדשה לחשב את התיקון נדרש חפיפת המשקל המולקולרית על ידי התאמת שפע SIL פי המשוואה בהוצאת ווקר ואח 1 5.: , כאשר A היא פסגת monoisotopic ואת חפיפת איזוטופ תיאורטיים, , ניתן לחשב לכל רכב באופן עצמאי. בטור שני, תכנית התאים לנרמל את ערוצי NAT ו- SIL באמצעות המשוואה עבור גורם glycan המנורמל הכולל (TGNF), לכל ספקטרום, כפי שתוארו על ידי ווקר ואח 1 5.: , כאשר N הוא מספר N -glycans מעל לגבול הכימות. בטור חדש, תוכנית התאים לקחת את היחס של SIL: גליקנים NAT (או להיפך) על מנת לחשב את השינוי לקפל בריכוז בין שני המדגמים.

Representative Results

איור 1:. התוכנית של תיוג הידרופובי ניבים-P2GPN מצמידים השיטה (שיטה) לניתוח פרוטאומיקה ו glycomics בשילוב ניתנת שלבים שונים בין glycomics בלבד glycomics עיבוד טנדם וניתוח פרוטאומיקה, עם זיהוי האתרים glycosylation, מודגשים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. ב-קו פרוטאומיקה ו glycomics, מסנן מבוסס שיטת תיוג הידרופובי P2GPN (שיטה) קבלה תוקף לזיהוי, לכמת, והטיית משקל מולקולרי באמצעות דגימות פלזמת תרנגולת נקווה (איור 1). בניסויים glycomics בלבד, בין השוואות שכיחותם של N -glycans שחולצו על ידי שיטהא 'עד carbograph SPE (תקן הזהב, שיטה ב) נעשו (איור 2). לא היו הבדלים משמעותיים שכיחותם של גליקנים בין שתי השיטות. התוך-ההשתנות גם הוערכו על ידי לכימות SIL: יחס NAT של גליקנים חילוץ באותה השיטה. יומן 2 -distributions של שתי השיטות היו גאוס, התרכזו אפס, ולא שונה משמעותית (איור 3A-B). המשקל המולקולרי נע בין שני הפרוטוקולים חפפו לחלוטין, דבר המצביע על כך מסנן לא להפלות N -glycans מבוסס על טווח המשקל המולקולרי hydrophilicity (איור 4). איור 2: תערובת equimolar של NAT ו- SIL N -glycans שחולצה על ידי שיטה או שיטה ב הוכן מ -2.5 μl של פלזמת תרנגולת (N = 4) דוגמאות אנאליות היו.yzed ידי UPLC-MS פי הפרמטרים מומלץ הציע בסעיף 6. שכיחותם עבור כל glycan, בכל ערוץ NAT / SIL, חושבו על ידי שילוב השטח מתחת הכרומתוגרמה יון חילוץ (MMA = 3 ppm), תיקון עבור מולקולרית חפיפת משקל, וכוונון ידי TGNF. יחסים אלו מוצגים עם סטיות התקן שלהם. השכיחויות של השיטה ב: -glycans N השיטה לא היו שונות משמעותי (p <0.05). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3: The-השתנות התוך ב (א) שיטת א (N = 133) או (ב) שיטה ב (N = 123) אסטרטגיות הושוו. תערובות equimolar NAT ו- SIL של -glycans N, מאותה תוכנית החילוץ , נותחו מעל שלושה משכפל טכני. יומן 2 -distributions התרכזו על אפס ולא היו שונים משמעותית בין שתי זרימות עבודה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 4: טווח המשקל המולקולרי של גליקנים מכל אסטרטגיה הושווה. שתי זרימות עבודה הניב גליקנים פורש באותו טווח משקל מולקולרי. N -glycans מזוהה בפרוטוקול אחד מול השני נפל בדיוק מעל הגבול של גילוי (1 × 10 5 בשפע) ואינם משקפים הטיה שיטתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גדול גרסה של נתון זה. <p class="jove_content" fo:keep-together.בתוך-page = "1"> שייר של חלבוני deglycosylated ידי מסנן המשקל המולקולרי לאפשר אונליין ניתוח ואתר glycosylation רחב proteome זיהוי. פרוטוקולים מרובים עבור הטיהור של גליקנים וחלבונים בשילוב הושוו הכנת FASP מסורתית ללא deglycosylation (לוח 5). טיפוסי 18 hr מסנן מבוסס PNGase F העיכול, ואחריו FASP טריפסין לעכל (פרוטוקול Std) שלנו הביא רמות משמעותיות של deamidation שאינם ספציפיים, אשר יכול להפריע לזיהוי glycosites. לכן, שיטת ניצול זמן דגירה קצרה בטמפרטורה גבוהה (50 מעלות צלזיוס), צעד ספייק-ב PNGase F (פרוטוקול SPI) שנחקרה כחלופה, יחד עם פרוטוקול עיכול מיקרוגל (פרוטוקול MD), כדי למזער אי deamidation הספציפי. גליקנים שנצפו שיטות העיכול החדשות לא היו שונים משמעותי בהרכבים או שכיחותם מ -18 שעות התקן, 37 ° C מסנן PNGase F לעכל ( <strong> איור 5). בשילוב עם דגירת טריפסין קצרה, שאינו ספציפי deamidation צומצם משמעותי, עם שיעור חיובי כוזב עבור glycosites <5% (לוח 5). חלבונים פפטידים פפטידים Deamidated Glycosites גליקופרוטאינים + – + – + – + – + – FASP <td colspan="2"> 249 3083 795 5 5 18hr 217 304 6013 5086 1029 733 257 24 112 18 MD 270 266 5190 5125 465 455 254 8 102 7 SPI 281 288 4729 4482 602 573 232 10 145 8 . לוח 5: השוואות של נתונים proteomic מתוך טריפסין תקן לעכל לעומת שיטת תיוג ב-קו ניבים-P2GPN נעשו הכנות בוצעו עם (+) ובלי (-) PNGase F לקבוע שיעורי רקע deamidation הלא ספציפית ואומדן glycosite שיעורי חיובי כוזב. חלבונים זוהו עם שיעור התגליות השגויות 1% (FDR); פפטידים סוננו מבוסס על אמון פפטיד "גבוה" Proteome Discoverer 1.4 (q <0.01); glycosites היה identified מבוסס על רצפים ייחודיים המכילים deamidation של מוטיב glycosylation המשומר (NXS / T); גליקופרוטאינים הוגדרו חלבונים מזוהים המכילים לפחות glycosite אחד מזוהה. איור 5: קיצור פרוטוקולים גליקנים פותחו כדי למזער דיאמינציה בדגימות ולעומת לעכל 18hr ניבים PNGase F. ממוצע ההבדלים ב שכיחותם היו 10% ו -5% עבור MD (2.2.3) ו SPI (2.2.2) פרוטוקולים, בהתאמה. של 48 גליקנים מזוהים, 90% מוצגים פחות מ וריאציה פי 1.5. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

High-throughput quantitative methods are needed to facilitate routine glycan analysis. For the last thirty years, glycomics analysis has been limited to a subset of research groups, despite its importance in disease, clinical applications, and pharmaceuticals. The FANGS-P2GPN purification and tagging method for glycomics and proteomics performs the same analysis on a single aliquot of sample, reducing the cost of supplies and the amount of material needed (particularly important in human and mouse studies). Furthermore, efforts to minimize variability in preparations are critically important, as every additional step contributes to error, potentially masking important but low-abundant changes in case-control studies. Coupling of FANGS to hydrophobic hydrazide tagging allows protein and glycan samples to be run on the same RPLC column, enhances glycan ionization, provides for relative quantification, and can be quantitatively applied to plasma.

For N-glycan analysis, it is critical to use the suggested level of PNGase F to achieve full de-glycosylation. Though glycans are solvent exposed, denaturation of proteins and excess enzyme help ensure efficient and complete cleavage. For accurate quantitation of the glycans, it is necessary to ensure that they are completely dried after derivatization to quench the reaction and prevent cross-reactions when mixing the NAT and SIL species. Finally, when extending the workflow to glycosite analysis, timing of the steps is critical to minimize non-specific deamidation. The modified protocols provided for combined glycomics and proteomics analysis work consistently when performed accordingly.

The workflow achieves accurate relative quantitation of N-glycans from plasma compared to the gold-standard, SPE method. There is no apparent bias in the types of glycans extracted in terms of molecular weight, hydrophilicity, and compositional structure. Though we have not explored the qualitative analysis of O-linked glycans, we expect that FANGS could accommodate the addition of a β-elimination step post-PNGase F digestion of N-linked glycans. However, procedures would require significant modification for reagent cleanup prior to mass spectrometry, and peptide analysis will be significantly impacted. For proteomics, the same depth of proteome coverage is achieved compared to traditional FASP methods. Importantly, methods achieve a minimal false discovery rate for N-glycan deamidation. While the method is compatible with 18O labeling of Asn during the PNGase digestion step22,23, the low glycosylation site false discovery rate suggests that it may not be necessary, further reducing costs and complexity.

The proteome is not enriched for glycoproteins in this method, which has both advantages and disadvantages. Certain low abundant glycoproteins may not be detected in the analysis. However, the occupancy of glycosylated sites per protein, can be compared between biological samples. Additionally, the error and bias introduced from lectin affinity purification or chemical enrichment is eliminated. In conclusion, coupling of FANGS to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy results in a simplified, quantitative, high-throughput method for the tandem analysis of the glycome and proteome with great potential for application in clinical case-control studies.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was generously funded by the NIH NCI IMAT Program Grant R33 (CA147988-02), the NIH NIGMS Graduate Training in Molecular Biotechnology at NC State Grant (T32GM008776), the US Dept. of Education GAANN Fellowship Program in Molecular Biotechnology at NC State Grant (P200A140020), the W.M. Keck Foundation, and North Carolina State University. Hen plasma was obtained with the assistance of Dr. James N. Petitte and Rebecca Wysocky in the NC State University Dept. of Poultry Science.

Materials

Acetic Acid (50%):  Sigma Aldrich  45754
Acetonitrile, HPLC grade Burdick & Jackson  AH015-4
Ammonium Bicarbonate Sigma Aldrich  A6141
Bradford Reagent Sigma Aldrich  B6916 Alternative: Bicinchoninic acid kit (Sigma Aldrich BCA1)
Calcium chloride Sigma Aldrich  C1016
Centrifuge Eppendorf 5804 R Alternate centrifuges that reach 14,000 x g are suitable
DL-Dithiothreitol, 1M in solution Sigma Aldrich  646563
Easy-nLC 1000 Thermo Scientific LC120 Alternate nano or ultra high pressure LCs will produce similar data, such as: 1. Dionex UltiMateÒ 3000 LC (Thermo Scientific) 2. Acquity UPLC (Waters)
Floating Tube Rack TedPella 20831-20
Fetuin New England Biolabs  P6042S
Fisher Scientific Isotemp Standard Lab Ovens Fisher Scientific 11-690-625F Alternate incubators that reach 56 °C are suitable
Formic Acid Sigma Aldrich  56302
GE Microwave Oven General Electric 57B5 E82904 Any microwave with adjustable power settings is suitable
INLIGHT Glycan Tagging Kit  Cambridge Isotope Laboratories GTK-1000 The INLIGHT kit provides NAT and SIL versions of the P2GPN reagent.
Iodoacetamide Sigma Aldrich  A3221
Kinetix 2.6 mM, 100 Å, C18 bulk stationary phase Phenomenex  Bulk Media Alternative: Any C18 stationary phase £ 5 mM 
Mascot Daemon Software and Server Matrix Science Alternative: Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific)
Methanol, HPLC grade Burdick & Jackson  AH230-4
PicoFrit Self-Pack Column: 360 um, OD 75um ID, 15 um tip, non-coated, 5 per box, 50 cm New Objective 1 5 PF360-75-15-N-5
PNGase F (glycerol-free), 75,000 units/ml New England BioLabs  P0705L
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer Thermo Scientific Alternate high mass accuracy (£ 5 ppm) mass spectrometers will provide similar data
RNase B New England Biolabs  P7817S
Trypsin from Porcine Pancreas Sigma Aldrich  T6567-5X
Urea Sigma Aldrich  51456
Vacuum ConcentratorSavant SPD131DDA SpeedVac Concentrator Thermo Scientific SPD131DDA Alternate vacuum concentrators are suitable
Vivacon 500 30 kDa Filters  Sartorius Stedim Biotech VN01H22 Alternative: Amicon Ultra 0.5 Centrifugal Filter Units with Ultracel-10 kDa Membrane (Millipore UFC501096)
Water, HPLC grade Burdick & Jackson  AH365-4
Water, 18O Cambridge Isotope Laboratories OLM-240-97-1 The addition of 18O in the PNGase F digest step is optional and may not be necessary for deamidation studies completed with 95% confidence
Xcalibur 2.0 Thermo Scientific XCALIBUR20
Zwittergent Test Kit Merck Millipore 693030
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
  2. Preston, R. J. S., Rawley, O., Gleeson, E. M., O’Donnell, J. S. Elucidating the role of carbohydrate determinants in regulating hemostasis: insights and opportunities. Blood. 121, 3801-3810 (2013).
  3. Hasnain, S. Z., Gallagher, A. L., Grencis, R. K., Thornton, D. J. A new role for mucins in immunity: Insights from gastrointestinal nematode infection. Int. J. Biochem. Cell Biol. 45, 364-374 (2013).
  4. Roseman, S. Reflections on glycobiology. J. Biol. Chem. 276, 41527-41542 (2001).
  5. Laine, R. A. A calculation of all possible oligosaccharide isomers both branched and linear yields 1.05 x 10(12) structures for a reducing hexasaccharide: The isomer barrier to development of single-method saccharide sequencing or synthesis systems. Glycobiology. 4, 759-767 (1994).
  6. Zaia, J. Mass spectrometry and glycomics. Omics. 14, 401-418 (2010).
  7. Hirabayashi, J. Lectin-based structural glycomics: Glycoproteomics and glycan profiling. Glycoconjugate J. 21, 35-40 (2004).
  8. Nilsson, J., et al. Enrichment of glycopeptides for glycan structure and attachment site identification. Nat. Methods. 6, 809-811 (2009).
  9. Redmond, J. W., Packer, N. H. The use of solid-phase extraction with graphitised carbon for the fractionation and purification of sugars. Carbohyd. Res. 319, 74-79 (1999).
  10. Ruhaak, L. R., et al. Hydrophilic interaction chromatography-based high-throughput sample preparation method for N-glycan analysis from total human plasma glycoproteins. Anal. Chem. 80, 6119-6126 (2008).
  11. Kim, Y. -. G., et al. Rapid and high-throughput analysis of N-glycans from ovarian cancer serum using a 96-well plate platform. Anal. Biochem. 391, 151-153 (2009).
  12. Zielinska, D. F., Gnad, F., Wiśniewski, J. R., Mann, M. Precision mapping of an in vivo N-glycoproteome reveals rigid topological and sequence constraints. Cell. 141, 897-907 (2010).
  13. Abdul Rahman, S., et al. Filter-aided N-glycan separation (FANGS): a convenient sample preparation method for mass spectrometric N-glycan profiling. J. Proteome Res. 13, 1167-1176 (2014).
  14. Walker, S. H., Carlisle, B. C., Muddiman, D. C. Systematic comparison of reverse phase and hydrophilic interaction liquid chromatography platforms for the analysis of N-linked glycans. Anal. Chem. 84, 8198-8206 (2012).
  15. Walker, S. H., Taylor, A. D., Muddiman, D. C. Individuality normalization when labeling with isotopic glycan hydrazide tags (INLIGHT): A novel glycan-relative quantification strategy. J. Am. Soc. Mass Spectr. 24, 1376-1384 (2013).
  16. Walker, S. H., Lilley, L. M., Enamorado, M. F., Comins, D. L., Muddiman, D. C. Hydrophobic derivatization of N-linked glycans for increased ion abundance in electrospray ionization mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass. Spectr. 22, 1309-1317 (2011).
  17. Baldwin, M. A., et al. Permethylation and tandem mass spectrometry of oligosaccharides having free hexosamine: Analysis of the glycoinositol phospholipid anchor glycan from the scrapie prion protein. Anal. Biochem. 191, 174-182 (1990).
  18. Harvey, D. J. Derivatization of carbohydrates for analysis by chromatography; electrophoresis and mass spectrometry. J. Chromatogr. B. 879, 1196-1225 (2011).
  19. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  20. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
  21. Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, inlight plasma N-glycans. Anal. Chem. 87, 7305-7312 (2015).
  22. Nepomuceno, A. I., Gibson, R. J., Randall, S. M., Muddiman, D. C. Accurate identification of deamidated peptides in global proteomics using a quadrupole orbitrap mass spectrometer. J. Proteome Res. 13, 777-785 (2013).
  23. Yen, T. -. Y., et al. Overcoming challenges and opening new opportunities in glycoproteomics. Biomolecules. 3, 270-286 (2013).
  24. Meiring, H. D., van der Heeft, E., ten Hove, G. J., de Jong, A. P. J. M. Nanoscale LC-MS(n): technical design and applications to peptide and protein. J. Sep. Sci. 25, 557-568 (2002).
  25. Apweiler, R., et al. UniProt: the Universal Protein knowledgebase. Nucleic Acids Res. 32, 115-119 (2004).
  26. Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20, 3551-3567 (1999).
  27. Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 5, 976-989 (1994).
  28. Gonzalez-Galarza, F. F., et al. A critical appraisal of techniques, software packages, and standards for quantitative proteomic analysis. Omics. 16, 431-442 (2012).
  29. Spivak, M., Weston, J., Bottou, L., Käll, L., Noble, W. S. Improvements to the Percolator Algorithm for Peptide Identification from Shotgun Proteomics Data Sets. J Proteome Res. 8, 3737-3745 (2009).
  30. Collier, T. S., et al. Comparison of stable-isotope labeling with amino acids in cell culture and spectral counting for relative quantification of protein expression. Rapid Commun Mass Sp. 25, 2524-2532 (2011).
  31. Kronewitter, S. R., et al. The development of retrosynthetic glycan libraries to profile and classify the human serum N-linked glycome. Proteomics. 9, 2986-2994 (2009).
  32. Sheeley, D. M., Reinhold, V. N. Structural characterization of carbohydrate sequence, linkage, and branching in a quadrupole ion trap mass spectrometer: Neutral oligosaccharides and N-linked glycans. Anal. Chem. 70, 3053-3059 (1998).

Tags

GlycomicsProteomicsPurification StrategyMass SpectrometryN-glycansGlycosylationProteinsCancerBiomarker DiscoveryDithiothreitolPNGase FIodoacetamideDerivatizationQuantification

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy. J. Vis. Exp. (109), e53735, doi:10.3791/53735 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image