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Chemistry

A Quantitative Glycomics e Proteomics Combinada estratégia de purificação

Published: March 08, 2016
doi:
10.3791/53735
, ,
1Department of Chemistry,North Carolina State University

Summary

A high-throughput protocol was developed for combined proteomics and glycomics purification and LC-MS/MS quantification in plasma. Deamidation analysis of N-linked glycosylation motifs was specific to deglycosylated sites. Accurate quantitation of N-glycans was achieved by coupling filter aided N-glycan separation to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy.

Abstract

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define pathways, improve treatment, understand disease, and aid biomarker discovery. N-linked glycosylation is one of the most important and robust post-translational modifications on proteins and regulates critical cell functions such as signaling, adhesion, and enzymatic function. Analytical techniques to purify and analyze N-glycans have remained relatively static over the last decade. While accurate and effective, they commonly require significant expertise and resources. Though some high-throughput purification schemes have been developed, they have yet to find widespread adoption and often rely on the enrichment of glycopeptides. One promising method, developed by Thomas-Oates et al., filter aided N-glycan separation (FANGS), was qualitatively demonstrated on tissues. Herein, we adapted FANGS to plasma and coupled it to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy in order to achieve accurate relative quantification by liquid chromatography mass spectrometry and enhanced electrospray ionization. Furthermore, we designed new functionality to the protocol by achieving tandem, shotgun proteomics and glycosylation site analysis on hen plasma. We showed that N-glycans purified on filter and derivatized by hydrophobic hydrazide tags were comparable in terms of abundance and class to those by solid phase extraction (SPE); the latter is considered a gold standard in the field. Importantly, the variability in the two protocols was not statistically different. Proteomic data that was collected in-line with glycomic data had the same depth compared to a standard trypsin digest. Peptide deamidation is minimized in the protocol, limiting non-specific deamidation detected at glycosylation motifs. This allowed for direct glycosylation site analysis, though the protocol can accommodate 18O site labeling as well. Overall, we demonstrated a new in-line high-throughput, unbiased, filter based protocol for quantitative glycomics and proteomics analysis.

Introduction

No campo de proteómica, a preparação da amostra do filtro auxiliado (FASP) tem sido amplamente adoptada para a sua capacidade de minimizar a quantidade de material de partida, diminuir a amostra de preparação de artefactos, e maximizar a taxa de transferência de amostra 1. No entanto, um tal processo tem ainda a surgir e ganhar espaço para o campo de glycomics. Desenvolvimento de high-throughput, os fluxos de trabalho quantitativos são necessários por causa do papel integrante da glicosilação em defesa biológica e sua modulação por câncer ou doenças 2,3. Nos mamíferos, N-glicanos são constituídos por unidades de repetição de sacarídeos (hexoses (HEX), hexosaminas (HexNAc), ácidos siálicos (NeuAc), e fucoses (Fuc)), que decoram uma estrutura de núcleo (Hex 3 HexNAc 2) 4 ligado covalentemente para asparagina. Embora o glycospace é consideravelmente grande quando isómeros são contados (> 10 12), ela é muito pequena numa base composição e pesos moleculares variam tipicamente de 1,000-8,000 Da 5 </ Sup>. A homogeneidade de composição da classe e suas propriedades hidrofílicas de glicanos representam desafios únicos para purificação, separação e espectrometria de massa (MS) fluxos de trabalho 6.

Tradicionalmente, os N-glicanos são digeridos a partir de proteínas ou péptidos por p�tido N -glycosidase F (PNGase F) e, em seguida, enriquecido por cromatografia por afinidade de lectina 7, capturado por esferas de hidrazida 8, ou purificados por meio de extracção em fase sólida (SPE) 9,10. Enquanto estes métodos são altamente eficazes, eles introduzem passos extra para dessalinização e limitar o número de amostras simultaneamente processados. Durante a última década, têm sido propostos uma série de plataformas de alto rendimento para glycomics. Kim et ai. Publicado um método semi-automatizado usando, uma placa de SPE de 96 poços operado a vácuo 11. Alternativamente, um método de afinidade-filtro (N -glyco-FASP) foi desenvolvido pelo grupo de Mann, que exigiu a derivação inicial do filtro com uma composição de lectinas 12. Por último, o grupo Thomas-Oates proposto um método semi-quantitativo, o filtro de separação Aided N-glicano (PRESAS), o qual explorado o tamanho de composição estreita do glycospace 13. Baseando-se no peso molecular filtros de corte, pequenos contaminantes foram primeiro lavadas para o lixo e, em seguida N-glicanos foram digeridos e fluido. proteínas desglicosiladas permanecem no filtro no presente protocolo, e pode ser submetido a FASP em-linha.

A identificação e quantificação dos glicanos por ionização por electrospray (ESI) MS requer separações off-line para resolução (parcial) de isómeros e derivatização para a detecção de espécies de baixo abundantes. Rotulagem na individualidade quando normalizar com a estratégia de glicano etiquetas hidrazida confere compatibilidade com cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) 14,15. O 4-fenetil-benzo-hidrazida (P2PGN) tag hidrofóbico medeia a hidrofilicidade dos glicanos, ENHancing ionização por, em média, quatro vezes 16. Embora outras técnicas, tais como a permetilação 17 ou químicos de marcação reactivo a amina 18, oferecem vantagens semelhantes, na reacção hidrazida, glicanos são feitos reagir 1: 1 estequiometricamente em condições fáceis. A quantificação relativa ser efectuada por análise conjunto de amostras derivados com nativa (NAT) ou 13 C 6 etiquetas estável isótopos (SIL).

O método a seguir evolui FANGS para aplicações de plasma e casais se para a tag hidrofóbico P2GPN para a quantificação relativa preciso. Além disso, ele foi projetado para executar proteômica shot-gun, profiling desamidação e glycomics quantitativos em uma única alíquota de amostra, sem comprometer a integridade das análises.

Protocol

1. A proteína e glicoproteína Desnaturação e Alquilação Para preparações convencionais de carga, com 2,5 ul de uma solução 0,1 ug / uL de glicoproteína (por exemplo ARNase fetuína ou B) para um de 30 kDa ou 10 peso molecular de corte do filtro kDa (MW). Para amostras de plasma biológicos, verifique a concentração de proteína através de um ensaio de 20 (BCA) proteína ácida padrão Bradford 19 ou bicincon�ico. Dilui-se o plasma, se necessário, com bicarbonato de amónio 100 mM (NH 4 HCO 3) em H2O (Digest Tampão PNGase) a um pH de 7 ~ para conter entre 10-100 mg de proteína total / ml. Carregar 2,5 ul de plasma (25-250 ug de proteína) para um filtro. Nota: Este protocolo foi testado apenas no plasma a partir de amostras de sangue recolhidas na presença de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Adicionar 2 mL de uma solução de ditiotreitol (DTT) para cada amostra no filtro. Dilui-se a amostra com 200 ul de tampão de digestão com PNGase. Tapar o tubo de amostra e filtro levemente vórtice, tomando cuidado para não perturbar o filtro a partir do seu assento. Incubar a amostra a 56 ° C durante 30 min para desnaturar as proteínas e glicoproteínas. Para alquilar as amostras, adicionar 50 ul de 1 M iodoacetamida, para se obter uma concentração final de ~ 200 mM e incuba-se a 37 ° C durante 60 min. NOTA: Se a análise proteômica não é desejada, o passo 1.5 pode ser ignorada. Concentra-se a glicoproteína desnaturado para o filtro de amostras por centrifugação a 14000 xg durante 40 min. Descarte fluir. 2. N -linked Glicano Digestão Enzimática Lava-se a amostra com 100 ul de tampão de digestão com PNGase. Concentra-se a glicoproteína no filtro a 14000 xg durante 20 min e descartar fluir. Repetir o passo de lavagem e concentrado duas vezes, para um total de três vezes, obtendo-se um concentrado no volume morto filtro (~ 5 mL). descartar tudofluir através. frasco de recolha de descarte vez lavagens estão completos. Colete todos os eluentes futuros e lavagens em um novo frasco de coleta. NOTA: PNGase digerir tampão 18 em H 2 O pode ser utilizado durante o passo de digestão com PNGase F para a marcação isotópica estável de locais de asparagina glicosilado, que se tornam quimicamente desamidada. Adicionar 2 mL de glicerol livre de PNGase F (75,000 x unidades / ml), para realizar uma filtragem após transferência para um frasco de recolha de fresco. Adicionar 98 ul de tampão de digestão com PNGase, trazendo para o volume total de 100 ul, e gentilmente pipeta cima e para baixo sobre o filtro para misturar. Enzimaticamente digerir os glicanos nas condições em etapas 2.2.1, 2.2.2, 2.2.3 OR. NOTA: Três métodos para a desglicosilação de proteínas pode ser usado. Para a análise exclusiva glycomics (não há proteómica), o tempo de incubação no passo 2.2.1 é recomendada. Para glycomics e proteómica investigação, os passos 2.2.2 e 2.2.3 irá produzir peptídeos de alta qualidade com o mínimo não-spdesamidação ecific. Glycomics-somente protocolo de digestão (18 horas): Incubar as amostras a 37 ° C durante 18 horas para clivar enzimaticamente todos os N-glicanos. Espiga no protocolo de digestão (SPI): Incubar as amostras a 50 ° C durante 2 h. Trabalhando rapidamente, retire amostras e pico em um 2 ul adicional de livre de glicerol PNGase F (75.000 x unidades / ml). Levemente vortex as amostras para 1-2 segundos para misturar. Incubar as amostras a 50 ° C durante mais 2 horas. protocolo de microondas digestão (MD): Colocar as amostras em um rack de tubo de microcentrífuga flutuante. amostras flutuar no de 1 L copo cheio com 1 L de água desionizada (Dl). Colocar a proveta no centro de um forno de micro-ondas (950 W) com uma placa rotativa. Micro-ondas a 60% de potência (570 W) durante 5 min. Para esfriar, retire amostras e mantenha a temperatura ambiente durante 2 min. Então microondas por 5 minutos adicionais à potência de 60%. NOTA: As configurações de potência de microondas terá de ser ajustada com base na potência máxima de microondas.potência média deve ser mantida constante entre os modelos. 3. A eluição de N-glicanos Eluir glicanos centrifugando a amostra a 14.000 xg durante 20 min a 20 ° C. Adicionar 100 ul de tampão de digestão com PNGase para o filtro e centrifugar a 14000 xg durante 20 min a 20 ° C. Recolha de lavagem contendo qualquer restantes N -ligada glicanos, no mesmo frasco coleção, como o eluente. Repita duas vezes. Retire o filtro e coloque em novo frasco de coleta. Incubar as amostras de glicano no -80 ° C congelador até congelado (30-60 min). A seco de conclusão, à temperatura ambiente, em concentrador de vácuo (4-6 h). NOTA: N-glicanos podem ser armazenadas a -20 ° C durante até seis meses antes da derivatização. 4. Proteína FASP Digestão NOTA: Se proteómica ou análise do local desamidação não é desejada, secção 4 do protocolo pode ser ignorada. Lavar tele filtrar, contendo os péptidos desamidados, com 400 ul de tampão de ureia 8 M. Tapar o frasco de recolha e levemente vortex para misturar. Concentra-se no filtro a 14000 xg durante 15 min. Descarte todo o flow-through. Repetir o passo 4.1 mais duas vezes, para um total de três lavagens com tampão de ureia. Lavar o filtro, contendo os péptidos desamidados, com 400 ul de 2 M de ureia, 10 mM CaCl 2 (tampão de tripsina digerir tampão). Tapar o frasco de recolha e levemente vortex para misturar. Concentra-se no filtro a 14000 xg durante 15 min. Descarte todo o flow-through. Repetir etapa 4.1 duas vezes adicionais para um total de três lavagens com tampão de tripsina de digerir. frasco de recolha de descarte vez lavagens estão completos. Colete todos os eluentes futuros e lavagens em um novo frasco de coleta. Adicionar 50 ul de tripsina porcina modificado de 1:50 ou 1: 5 de tripsina: proteína (w / w) proporção para a descoberta ou proteómica quantitativos experiências, respectivamente.Tapar o frasco de recolha e levemente vortex para misturar. Incubar as amostras a 37 ° C durante 2 h. Trabalhando rapidamente, retire amostras e pico de um adicional de 50 ul de tripsina na 1:50 ou 1: relação proteína: tripsina 5. Levemente vortex as amostras para 1-2 segundos para misturar. Incubar as amostras a 50 ° C durante mais 2 horas. Elui-se os péptidos por centrifugação a 14000 xg durante 15 min. Lavar os péptidos restantes do filtro com 400 ul de ácido fórmico a 1% e 0,001% de Zwittergent 3-16 (tampão de têmpera). Elui-se fora o filtro por centrifugação a 14000 xg durante 15 min. Quantificar a concentração de peptídeo nas amostras por Bradford 19 ou ensaio BCA 20. Incubar as amostras de péptidos na -80 ° C congelador até congelado (30-60 min). A seco de conclusão, à temperatura ambiente, em concentrador de vácuo (4-6 h). NOTA: secada péptidos podem ser armazenadas a -20 ° C durante até três meses. Ressuspender proteínas trípticos pouco antes de Liquicromatografia de massa espectrometria de d (LC-MS) análise em 2% de acetonitrilo, 98% H2O, e ácido fórmico a 0,1% (fase móvel A) a concentração desejada. As concentrações de peptídeos trípticos de gama plasma 2,5 ul 100-300 ng / mL. 5. A derivatização de N glicanos com -linked hidrofóbicos hidrazida Marcações Reconstituir pesados ​​(SIL) ou luz (NAT) reagentes P2GPN secas em 1 ml de 75:25 MeOH: ácido acético (solução de derivatização), para uma concentração final de 0,25 mg / ml. Reagentes vai levar até 10 min para solubilizar completamente. Extensivamente vortex para assegurar a solubilização completa. Nota: Na eventualidade de este protocolo de derivatização é usado com N-glicanos normais, contra glicanos purificada, a razão molar de P2GPN: glicano deve ser aproximadamente (e não menos) do que 17: 1. Tag seca N-glicanos com 200 ul (50 ug) de SIL ou NAT P2GPN reagente. Pipeta cima e para baixo para voltar a suspender glicanos secos. Vortex samples e depois girar amostras para ~ 5 segundos em uma centrífuga de bancada. Reagir os glicanos com o reagente durante 3 h a 56 ° C. Imediatamente mover glicanos da incubadora para o concentrador de vácuo. A seco para completar a 55 ° C (3-5 h). Nota: Esta etapa sacia a reação de derivação; a amostra deve estar completamente seca para evitar reactividade cruzada nas etapas subsequentes. NOTA: As amostras secas, marcadas podem ser armazenadas a -20 ° C durante até seis meses. Ressuspender etiquetado N-glicanos em 25-50 ul de H2O imediatamente antes da análise LC-MS. Pipeta cima e para baixo para garantir N-glicanos são totalmente solubilizado. NOTA: O volume de ressuspensão é dependente da concentração de partida de glicoproteína que pode ser estimada a partir da concentração de proteína inicial. No entanto, o intervalo vai variar consoante o tipo de amostra e devem ser otimizados individualmente. Centrifugar as amostras a 14.000 xg durante 5 min. Remover o supernatant, tomando cuidado para não deixar a ponta da pipeta tocar o fundo do tubo de centrifugação. Nota: O excesso de marcação pode não ser visível a olho nu, mas irá ser reduzida por centrifugação. Combinar um par de amostras de NAT e SIL, se desejado para a quantificação relativa, em uma proporção de 1: 1 para análise em tandem. 6. pressão ultra-elevada Cromatografia Líquida e Espectrometria de Massa de Análise NOTA: A LC e MS condições descritas para um Fácil NLC-1000 e um Q Exactive alta campo, respectivamente, foram otimizados in-house para análise proteômica e análise de glicanos 21. Estas condições podem ser adaptadas para outros sistemas de LC de pressão ou de nano ultra-altos e outros espectrómetros de massa de alta resolução de energia, mas pode necessitar de modificações ligeiras. A utilização de alta resolução de espectrometria de massa de potência é necessário para a identificação e análise de glicano desamidação 22,23. NOTA: As etapas 6,1-6,3 pode ser skipped se uma cromatografia de fase inversa apropriado ou interacção hidrófila armadilha comercial e são utilizados em coluna. Sintetizar um filtro poroso em ID 100 uM capilar de acordo com Meiring et al. 24, para utilização como uma armadilha. Embalar a armadilha sob pressão com 2,6 uM, 100 A, C 18, o material de embalagem e cortar um comprimento de 5 cm. Pacote de uma coluna de 75 uM ID emissor sob pressão com 2,6 uM, 100 A, C 18, o material de embalagem e cortar um comprimento de 30 cm. Prepare dois métodos diferentes de LC-MS para a proteômica (6.4.1) e Glycomics (6.4.2) workflows. Nota: Proteína e amostras de glicano pode ser executado na mesma configuração de armadilha / coluna em qualquer ordem. Para a análise de proteínas, injectar ~ 400 ng de proteína para a coluna de fase A móvel (MPA). Executar a amostra em 300 nl / min, de acordo com a Tabela 1, com um 1 ml de equilíbrio pré-coluna (500 bar) e uma 5 ul de equilíbrio coluna analítica(500 bar). Ionizar proteínas nas condições MS fornecidos na Tabela 2. Para a análise de glicano, 5 ul de injectar ressuspensas, com etiquetas P2GPN amostras equimolares NAT / SIL na coluna. Executar a amostra em 300 nl / min, de acordo com a Tabela 3, com um 2 ul de equilíbrio pré-coluna (500 bar) e uma coluna analítica de equilíbrio 5 ul (500 bar). Ionizar glicanos nas condições MS fornecidos na Tabela 4. Tempo % MPA % MPB 0 100 0 5 98 2 105 80 20 135 68 32 136 5 95 151 5 95 152 100 0 167 100 0 Quadro 1. Condições de LC para análise proteómica. Um gradiente de eluição com a fase móvel B (MPB, 98% de acetonitrilo, 2% de H2O, 0,1% ácido fórmico) foi realizada para eluir os péptidos para proteómica shot-gun, dados dependentes de aquisição , experiências de EM. MS 1 Parâmetros Faixa de massa (Th) 375-1500 Resolução 120.000 AGC 1 x 10 6 Max Ionização Tempo 30 S-Lens FR Nível 55 capilar TemP (° C) 300 Spray de tensão 1.75 MS 2 Parâmetros aquisição Tipo Top20 Resolução 15.000 AGC 1 × 10 5 Max Ionização Tempo 30 Rácio underfill 2% Isolamento Window (Th) 1.4 Exclusão cobrança Estado +1 Normalizado energia de colisão 27 Tempo (s) de Exclusão 20 Tabela 2: Condições MS para análise proteômica Os parâmetros para ionização electrospray, MS 1 aquisição e MS 2 aquisição de um instrumento Orbitrap usando dissociatio de maior energia.n (HCD) são dadas. Tempo % MPA % MPB 0 95 5 1 70 30 41 60 40 46 37 63 47 10 90 55 10 90 56 95 5 66 95 5 Tabela 3:. Condições de LC para a análise de glicano Um gradiente de eluição foi realizada com etiquetas para eluir hidrazida N-glicanos por análise de MS. <tr> MS 1 Parâmetros Faixa de massa (Th) 600-1900 Resolução 60.000 AGC 5 x 10 5 Max Ionização Tempo 64 S-Lens FR Nível 65 Capilar Temp (° C) 325 Spray de tensão 1.75 MS 2 Parâmetros aquisição Tipo Top12 Resolução 15.000 AGC 5 x 10 4 Max Ionização Tempo 100 Rácio underfill 1% Isolamento Window (Th) 1.4 Corrigido Primeira Missa </td> 125 Pisou Normalizada energia de colisão 10/20/30 Exclusão Tempo (seg) 15 Tabela 4: Condições MS para hidrazida marcado N análise de glicanos Os parâmetros para ionização electrospray, MS 1 aquisição, e aquisição de MS 2 em um instrumento Orbitrap usando a dissociação de maior energia (HCD) são dadas.. 7. Proteomics e Análise desamidação Identificar proteínas / péptidos usando o padrão ferramentas de pesquisa bioinformática. Nota: O seguinte protocolo de análise foi projetada usando as bases de dados Swiss-Prot / Trembl em UniProtKB e busca através SEQUEST no 1.4 software Proteome Discoverer, no entanto, o protocolo pode ser diretamente traduzidos para qualquer motor de busca de proteínas e de pontuação usando um software GUI. Todos os comandos a seguir indicados podem ser acessados ​​em interfaces de software através de menus drop-down. <li> Criar ou baixar um banco de dados de sequência de proteína organismo apropriado de dados genômicos ou bancos de dados proteoma disponíveis como descrito por Apweiler et al. 25 Nota: as bases de dados comuns incluem proteoma da Swiss-Prot, TrEMBL, e NCBI, mas pode ser construída a partir de dados in-house bem. Dentro do software, escolher um motor de busca de banco de dados e seleccione os parâmetros de acordo com a qualidade dos dados adquiridos e o rigor da busca desejada, como descrito por Perkins et al. para MASCOTE 26 ou Eng et al. para SEQUEST 27. Para dados de alta massa de precisão, definir parâmetros para a busca no software da seguinte forma: Max 2 perdeu clivagens, 5 ppm precursor tolerância de massa, e 0,02 Da fragmento de tolerância de massa (para otimizado de detecção desamidação precisas 22) e incluem as seguintes modificações de péptidos trípticos : "carbamidomethyl (C)" modificação estática e "desamidação (N / Q)" e "boiidation (M) "alterações dinâmicas. Se usando 18O digestão rotulagem, incluem" desamidação 18 O (1) ", tal como uma modificação dinâmica adicional. Search, usando o motor seleccionado, os dados de peptídeos matérias contra o banco de dados de proteínas (7.1.1). Nota: tolerâncias de massa deve ser apropriado para o instrumento utilizado e não arbitrariamente baixa. Nota: A função de busca é concluída automaticamente pelo software utilizando algoritmos específicos diferentes de pesquisa do motor. O algoritmo coador (MASCOTE), SEQUEST, ou outras combinações de algoritmos são utilizados para identificar proteínas de peptídeos e para marcar a validade dos hits; obter mais informações sobre as ferramentas disponíveis são cobertas em uma revisão de Gonzalez-Galarza et al. 28,29. Dependendo do software, parâmetros de pesquisa adicionais podem precisar ser selecionados de acordo com o critério do usuário. Exportar os peptídeos identificados para curadoria manual e furthanálise er. Curador manualmente uma lista de péptidos contendo uma desamidação na asparagina identificados da N -linked motivo de glicosilação (NX- (S / T), onde X ≠ P). Cross-validar esses sites com motivos de glicosilação conhecidos da literatura e criar dois conjuntos de resultados (validados e teórica). Use contagem espectral 30 a comparar a percentagem de ocupação de um dado sítio de glicosilação através da comparação da abundância de formas desamidada e não desamidada. 8. Quantificação Relativa Glycan Nota: O seguinte identificação e quantificação foi completada usando o software XCalibur. No entanto, qualquer software que analisa os dados em bruto e integra automaticamente picos cromatograf icos podem ser substituídos. Gerar uma lista teórica de composições de glicano dos biologicamente possíveis combinações de hexoses, desoxi-hexoses, hexosaminas, ácidos siálico, e outras saccharides. Para este efeito, uma base de dados de glicano humano foi publicada por Walker et ai. 15 e pode ser usado como está. Para bancos de dados teóricos, as restrições biológicas específicas da espécie deve ser imposta ao espaço combinatória, e essas regras são descritas por Kronewitter et al. 31. Calcule as massas monoisotópico glicanos (M) das massas atômicas para cada composição para estados de carga de prótons + 1-3. Modificar as massas monoisotópico para incluir a adição de NAT (254,14191 g / mol) ou SIL (260,162042 g / mol) tag P2GPN. Abra o programa "Setup Processing" do ponto de vista roteiro em XCalibur. Configurar um método de processamento de como exatamente o descrito no material suplementar de Walker et al. 15, utilizando a lista gerada na etapa 8.2, contendo as massas monoisotópico teóricas para o [M + H] 1+, [M + 2H] 2+ e [ M + 3H] 3+ espécies. Nota: Para confirmar a identidade de glicanos além precisasmassa, por NAT / SIL duplexado corridas, verificar se NAT e SIL N-glicanos pares co-eluir com o mesmo tempo de retenção. Qualitativamente, cruzada validar identificações com os espectros de MS 2, que deve conter picos que pertencem à série de iões oxónio 32. Exportar o, cromatograma de iões extraídos integrado (XIC) áreas para o Excel para obter as abundâncias SIL e NAT como exatamente descritas no material suplementar de Walker et al. 15 No Excel, programa as células de uma nova coluna para calcular a correcção para a sobreposição de peso molecular ajustando a abundância SIL de acordo com a equação de publicada por Walker et ai 5 1.: , em que A é o pico monoisotópico e a sobreposição isótopo teórico, , Pode ser calculada de forma independente por composição. Em uma segunda coluna, o programa das células para normalizar os canais de NAT e SIL usando a equação para o total do factor de glicano normalizada (TGNF), por espectro, como descrito por Walker et ai 5 1.: , onde N é o número de N-glicanos acima do limite de quantificação. Em uma nova coluna, as células programa para levar a razão entre SIL: glicanos NAT (ou vice-versa) para calcular a dobra-a mudança de concentração entre as duas amostras.

Representative Results

Figura 1:. O esquema do método FANGS-P2GPN marcação hidrofóbico acoplado (Método A) para a proteômica e glycomics combinados análise é dado passos que diferem entre glycomics de processamento e em tandem Glycomics apenas e análise do proteoma e com identificação do local de glicosilação, são destacados. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. A in-line e proteómica glycomics, P2GPN método de marcação hidrófobo à base de filtro (Método A) foi validado para a identificação, quantificação, e polarização peso molecular usando amostras de plasma de galinha em pool (Figura 1). Para exclusiva experimentos Glycomics, inter-comparações nas abundâncias de N-glicanos extraído pelo métodoA a carbograph SPE (ouro-padrão, Método B) foram feitas (Figura 2). Não houve diferenças significativas nas abundâncias de glicanos entre os dois métodos. A variabilidade intra-foi também avaliada quantificando-se a SIL: NAT proporção de glicanos extraídos pelo mesmo método. Os log 2 -distributions de ambos os métodos foram gaussiano, centrada no zero, e não é significativamente diferente (Figura 3A-B). O peso molecular varia entre os dois protocolos completamente sobrepostas, sugerindo que o filtro não discriminaram N-glicanos com base no intervalo de peso molecular e de hidrofilicidade (Figura 4). Figura 2: Uma mistura equimolar de NAT e SIL N-glicanos extraiu-se pelo Método A ou Método B foi preparado a partir de 2,5 mL de plasma de galinha (n = 4) As amostras foram Anal.yzed por UPLC-MS de acordo com os parâmetros recomendados sugeridas na secção 6. As abundâncias para cada glicano, em cada canal NAT / SIL, foram calculados por integração da área sob o cromatograma de iões extraídos (MMA = 3 ppm), corrigindo para o molecular sobreposição de peso e ajuste pelo TGNF. Estas proporções são mostrados com os seus erros padrões. As abundâncias de Método B: Método A glicanos N não foram significativamente diferentes (p> 0,05). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: A variabilidade intra-no (A) Método A (n = 133) ou (B) Método B (n = 123) foi comparada estratégias. NAT e SIL misturas equimolares de N-glicanos, a partir do mesmo esquema de extracção, Foram analisadas mais de três repetições técnicas. O log 2 -distributions foram centradas em zero e não foram significativamente diferentes entre os dois fluxos de trabalho. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: As gamas de pesos moleculares de glicanos a partir de cada uma das estratégias foram comparados. Os dois fluxos de trabalho rendeu glicanos abrangendo a mesma faixa de peso molecular. N-glicanos detectado em um protocolo contra o outro caiu um pouco acima do limite de detecção (1 × 10 5 abundância) e não refletem tendência sistemática. Por favor clique aqui para ver uma maior versão desta figura. <p class="jove_content" fo:keep-together.dentro-page = "1"> A retenção das proteínas desglicosilada pelo filtro peso molecular ativado in-line proteoma ampla análise e local de glicosilação identificação. Vários protocolos para a purificação combinada de glicanos e proteínas foram comparados com uma preparação FASP tradicional sem desglicosilação (Tabela 5). O nosso filtro típico de 18 horas com base PNGase F digestão, seguido por digestão de tripsina FASP (protocolo Std) resultaram em níveis significativos de desamidação não-específica, o que pode interferir com a identificação de glycosites. Por conseguinte, um método utilizando um tempo de incubação mais curto a temperatura elevada (50 ° C) e um passo de pico-a PNGase F (protocolo SPI) foi explorada como uma alternativa, juntamente com um protocolo de digestão microondas (protocolo MD), para minimizar não- desamidação específica. Os glicanos observadas nos novos métodos de digestão não foram significativamente diferentes em composições ou abundâncias do padrão 18 horas, 37 ° C filtro PNGase F digest ( <strong> Figura 5). Combinado com uma curta incubação de tripsina, desamidação não específica foi significativamente reduzida, com uma taxa de falsos positivos para glycosites <5% (Tabela 5). proteínas peptídeos péptidos desamidados Glycosites glicoproteínas + – + – + – + – + – FASP <td colspan="2"> 249 3083 795 5 5 18hr 217 304 6013 5086 1029 733 257 24 112 18 MD 270 266 5190 5125 465 455 254 8 102 7 SPI 281 288 4729 4482 602 573 232 10 145 8 . Tabela 5: Comparação de dados proteomic de uma tripsina padrão digerir versus o método de marcação em-linha PRESAS-P2GPN foram feitas preparações foram realizadas com (+) e sem (-) de PNGase F para determinar as taxas de desamidação e estimativa não específica de fundo glycosite taxas de falsos positivos. As proteínas foram identificadas com 1% de taxa de descoberta de falsas (FDR); peptídeos foram filtradas com base na confiança peptídeo "alta" em Proteome Discoverer 1.4 (q <0,01); glycosites foram identified com base em sequências únicas contendo desamidação do motivo conservado de glicosilação (NXS / T); e glicoproteínas foram definidos como proteínas identificadas contendo, pelo menos, um glycosite identificado. Figura 5: encurtado protocolos para glicanos foram desenvolvidos para minimizar a desaminação das amostras e em comparação com o 18hr PRESAS PNGase F Digest. As diferenças médias em abundâncias foram de 10% e 5% para o MD (2.2.3) e (2.2.2) SPI protocolos, respectivamente. Dos 48 glicanos identificados, 90% apresentaram menor que a variação de 1,5 vezes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

High-throughput quantitative methods are needed to facilitate routine glycan analysis. For the last thirty years, glycomics analysis has been limited to a subset of research groups, despite its importance in disease, clinical applications, and pharmaceuticals. The FANGS-P2GPN purification and tagging method for glycomics and proteomics performs the same analysis on a single aliquot of sample, reducing the cost of supplies and the amount of material needed (particularly important in human and mouse studies). Furthermore, efforts to minimize variability in preparations are critically important, as every additional step contributes to error, potentially masking important but low-abundant changes in case-control studies. Coupling of FANGS to hydrophobic hydrazide tagging allows protein and glycan samples to be run on the same RPLC column, enhances glycan ionization, provides for relative quantification, and can be quantitatively applied to plasma.

For N-glycan analysis, it is critical to use the suggested level of PNGase F to achieve full de-glycosylation. Though glycans are solvent exposed, denaturation of proteins and excess enzyme help ensure efficient and complete cleavage. For accurate quantitation of the glycans, it is necessary to ensure that they are completely dried after derivatization to quench the reaction and prevent cross-reactions when mixing the NAT and SIL species. Finally, when extending the workflow to glycosite analysis, timing of the steps is critical to minimize non-specific deamidation. The modified protocols provided for combined glycomics and proteomics analysis work consistently when performed accordingly.

The workflow achieves accurate relative quantitation of N-glycans from plasma compared to the gold-standard, SPE method. There is no apparent bias in the types of glycans extracted in terms of molecular weight, hydrophilicity, and compositional structure. Though we have not explored the qualitative analysis of O-linked glycans, we expect that FANGS could accommodate the addition of a β-elimination step post-PNGase F digestion of N-linked glycans. However, procedures would require significant modification for reagent cleanup prior to mass spectrometry, and peptide analysis will be significantly impacted. For proteomics, the same depth of proteome coverage is achieved compared to traditional FASP methods. Importantly, methods achieve a minimal false discovery rate for N-glycan deamidation. While the method is compatible with 18O labeling of Asn during the PNGase digestion step22,23, the low glycosylation site false discovery rate suggests that it may not be necessary, further reducing costs and complexity.

The proteome is not enriched for glycoproteins in this method, which has both advantages and disadvantages. Certain low abundant glycoproteins may not be detected in the analysis. However, the occupancy of glycosylated sites per protein, can be compared between biological samples. Additionally, the error and bias introduced from lectin affinity purification or chemical enrichment is eliminated. In conclusion, coupling of FANGS to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy results in a simplified, quantitative, high-throughput method for the tandem analysis of the glycome and proteome with great potential for application in clinical case-control studies.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was generously funded by the NIH NCI IMAT Program Grant R33 (CA147988-02), the NIH NIGMS Graduate Training in Molecular Biotechnology at NC State Grant (T32GM008776), the US Dept. of Education GAANN Fellowship Program in Molecular Biotechnology at NC State Grant (P200A140020), the W.M. Keck Foundation, and North Carolina State University. Hen plasma was obtained with the assistance of Dr. James N. Petitte and Rebecca Wysocky in the NC State University Dept. of Poultry Science.

Materials

Acetic Acid (50%):  Sigma Aldrich  45754
Acetonitrile, HPLC grade Burdick & Jackson  AH015-4
Ammonium Bicarbonate Sigma Aldrich  A6141
Bradford Reagent Sigma Aldrich  B6916 Alternative: Bicinchoninic acid kit (Sigma Aldrich BCA1)
Calcium chloride Sigma Aldrich  C1016
Centrifuge Eppendorf 5804 R Alternate centrifuges that reach 14,000 x g are suitable
DL-Dithiothreitol, 1M in solution Sigma Aldrich  646563
Easy-nLC 1000 Thermo Scientific LC120 Alternate nano or ultra high pressure LCs will produce similar data, such as: 1. Dionex UltiMateÒ 3000 LC (Thermo Scientific) 2. Acquity UPLC (Waters)
Floating Tube Rack TedPella 20831-20
Fetuin New England Biolabs  P6042S
Fisher Scientific Isotemp Standard Lab Ovens Fisher Scientific 11-690-625F Alternate incubators that reach 56 °C are suitable
Formic Acid Sigma Aldrich  56302
GE Microwave Oven General Electric 57B5 E82904 Any microwave with adjustable power settings is suitable
INLIGHT Glycan Tagging Kit  Cambridge Isotope Laboratories GTK-1000 The INLIGHT kit provides NAT and SIL versions of the P2GPN reagent.
Iodoacetamide Sigma Aldrich  A3221
Kinetix 2.6 mM, 100 Å, C18 bulk stationary phase Phenomenex  Bulk Media Alternative: Any C18 stationary phase £ 5 mM 
Mascot Daemon Software and Server Matrix Science Alternative: Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific)
Methanol, HPLC grade Burdick & Jackson  AH230-4
PicoFrit Self-Pack Column: 360 um, OD 75um ID, 15 um tip, non-coated, 5 per box, 50 cm New Objective 1 5 PF360-75-15-N-5
PNGase F (glycerol-free), 75,000 units/ml New England BioLabs  P0705L
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer Thermo Scientific Alternate high mass accuracy (£ 5 ppm) mass spectrometers will provide similar data
RNase B New England Biolabs  P7817S
Trypsin from Porcine Pancreas Sigma Aldrich  T6567-5X
Urea Sigma Aldrich  51456
Vacuum ConcentratorSavant SPD131DDA SpeedVac Concentrator Thermo Scientific SPD131DDA Alternate vacuum concentrators are suitable
Vivacon 500 30 kDa Filters  Sartorius Stedim Biotech VN01H22 Alternative: Amicon Ultra 0.5 Centrifugal Filter Units with Ultracel-10 kDa Membrane (Millipore UFC501096)
Water, HPLC grade Burdick & Jackson  AH365-4
Water, 18O Cambridge Isotope Laboratories OLM-240-97-1 The addition of 18O in the PNGase F digest step is optional and may not be necessary for deamidation studies completed with 95% confidence
Xcalibur 2.0 Thermo Scientific XCALIBUR20
Zwittergent Test Kit Merck Millipore 693030
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Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy. J. Vis. Exp. (109), e53735, doi:10.3791/53735 (2016).
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