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Chemistry

Un quantitativo Glycomics e proteomica combinata strategia Purificazione

Published: March 08, 2016
doi:
10.3791/53735
, ,
1Department of Chemistry,North Carolina State University

Summary

A high-throughput protocol was developed for combined proteomics and glycomics purification and LC-MS/MS quantification in plasma. Deamidation analysis of N-linked glycosylation motifs was specific to deglycosylated sites. Accurate quantitation of N-glycans was achieved by coupling filter aided N-glycan separation to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy.

Abstract

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define pathways, improve treatment, understand disease, and aid biomarker discovery. N-linked glycosylation is one of the most important and robust post-translational modifications on proteins and regulates critical cell functions such as signaling, adhesion, and enzymatic function. Analytical techniques to purify and analyze N-glycans have remained relatively static over the last decade. While accurate and effective, they commonly require significant expertise and resources. Though some high-throughput purification schemes have been developed, they have yet to find widespread adoption and often rely on the enrichment of glycopeptides. One promising method, developed by Thomas-Oates et al., filter aided N-glycan separation (FANGS), was qualitatively demonstrated on tissues. Herein, we adapted FANGS to plasma and coupled it to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy in order to achieve accurate relative quantification by liquid chromatography mass spectrometry and enhanced electrospray ionization. Furthermore, we designed new functionality to the protocol by achieving tandem, shotgun proteomics and glycosylation site analysis on hen plasma. We showed that N-glycans purified on filter and derivatized by hydrophobic hydrazide tags were comparable in terms of abundance and class to those by solid phase extraction (SPE); the latter is considered a gold standard in the field. Importantly, the variability in the two protocols was not statistically different. Proteomic data that was collected in-line with glycomic data had the same depth compared to a standard trypsin digest. Peptide deamidation is minimized in the protocol, limiting non-specific deamidation detected at glycosylation motifs. This allowed for direct glycosylation site analysis, though the protocol can accommodate 18O site labeling as well. Overall, we demonstrated a new in-line high-throughput, unbiased, filter based protocol for quantitative glycomics and proteomics analysis.

Introduction

Nel campo della proteomica, filtro aided preparazione del campione (FASP) è stato ampiamente adottato per la sua capacità di ridurre la quantità di materiale di partenza, ridurre artefatti preparazione del campione, e massimizzare la produttività del campione 1. Tuttavia, un tale metodo è ancora emergere e guadagnare trazione per il campo di glycomics. Lo sviluppo di high-throughput, flussi di lavoro quantitativi sono necessari a causa del ruolo fondamentale di glicosilazione in difesa biologica e la sua modulazione da cancro o malattie 2,3. Nei mammiferi, N -glycans sono composti di ripetere unità saccaridiche (esosi (Hex), esosamine (HexNac), acidi sialico (NeuAc), e fucoses (FUC)), che decorano una struttura di base (hex 3 HexNac 2) 4 a legame covalente a asparagina. Sebbene il glycospace è considerevolmente grande quando isomeri sono contati (> 10 12), è piuttosto modesto in termini di composizione e peso molecolare tipicamente variano da 1,000-8,000 Da 5 </ Sup>. L'omogeneità compositiva della classe e l'idrofilia dei glicani pongono sfide uniche per la purificazione, la separazione, e spettrometria di massa (MS) dei flussi di lavoro 6.

Tradizionalmente, N -glycans vengono digeriti da proteine ​​o peptidi da peptide- N -glycosidase F (PNGase F) e poi arricchite da lectina cromatografia di affinità 7, catturati da perline idrazide 8, o purificati mediante estrazione in fase solida (SPE) 9,10. Mentre questi metodi sono tutti altamente efficaci, introducono passaggi aggiuntivi per dissalazione e limitare il numero di campioni trattati simultaneamente. Negli ultimi dieci anni, sono stati proposti una serie di piattaforme high-throughput per glycomics. Kim et al. Pubblicato un metodo semi-automatico utilizzando una piastra SPE 96 pozzetti a depressione 11. In alternativa, un metodo di affinità-filtro (N–glyco FASP) è stato sviluppato dal gruppo di Mann, che ha richiesto la derivatizzazione iniziale del filtro con un composito di lectine 12. Infine, il gruppo di Thomas-Oates ha proposto un metodo semi-quantitativo, il filtro Aided N -Glycan di separazione (ZANNE), che ha sfruttato la dimensione composizione ristretta del glycospace 13. Basandosi su filtri cut-off peso molecolare, piccoli contaminanti sono stati lavati per i rifiuti e poi i -glycans N sono stati digeriti e eluiti. proteine ​​deglicosilata rimangono sul filtro in questo protocollo e possono essere sottoposti a FASP in linea.

L'identificazione e la quantificazione dei glicani per ionizzazione elettrospray (ESI) MS richiede separazioni off-line per la risoluzione (parziale) di isomeri e derivatizzazione per il rilevamento di specie a basso abbondanti. Etichettatura nella individualità, quando la normalizzazione con la strategia glycan tag idrazide conferisce compatibilità con cromatografia liquida in fase inversa (RPLC) 14,15. Il 4-fenetil-benzohydrazide (P2PGN) tag idrofobo media la idrofilia dei glicani, ENHarbitrare la ionizzazione da, in media, quattro volte 16. Anche altre tecniche, come permethylation 17 o ammina reattiva chimiche codifica 18, offrono vantaggi simili, nella reazione idrazide, glicani vengono fatti reagire 1: 1 stechiometricamente in condizioni facili. Quantificazione relativa è ottenuta mediante l'analisi di campioni tandem derivatizzati con nativo (NAT) o 13 C 6 etichette stabile isotopi (SIL).

Il seguente metodo si evolve ZANNE per le applicazioni di plasma e le coppie con la variabile idrofobico P2GPN per un'accurata quantificazione relativa. Inoltre, è stato progettato per eseguire proteomica tiro-gun, deamidation profilatura e glycomics quantitativi una singola aliquota di campione, senza compromettere l'integrità delle analisi.

Protocol

1. Proteine ​​e Glicoproteina Denaturazione e alchilazione Per i preparati standard, carico di 2,5 microlitri di 0.1 mg / ml soluzione di glicoproteina (per esempio Fetuina o RNase B) su un 30 kDa o 10 peso molecolare filtro cut-off kDa (MW). Per i campioni di plasma biologici, controllare la concentrazione di proteine ​​da un saggio di 20 (BCA) proteina titolato Bradford 19 o bicinconinico. Diluire il plasma, se necessario, con 100 mM di bicarbonato di ammonio (NH 4 HCO 3) in H 2 O (PNGase Digest Buffer) a pH ~ 7 per contenere tra 10-100 mg / ml di proteine ​​totali. Carico 2,5 microlitri di plasma (25-250 mg proteine) su un filtro. Nota: Questo protocollo è stato testato solo su plasma da campioni di sangue raccolti in presenza di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Aggiungere 2 ml di 1 M soluzione di ditiotreitolo (DTT) per ogni campione nel filtro. Diluire il campione con 200 ml PNGase digerire tampone. Tappare la provetta filtro e leggermente vortice, facendo attenzione a non disturbare il filtro dalla sua sede. Incubare il campione a 56 ° C per 30 minuti per denaturare le proteine ​​e glicoproteine. Per alchilata i campioni, aggiungere 50 ml 1 M Iodoacetamide, per dare una concentrazione finale di ~ 200 mM, e incubare a 37 ° C per 60 min. NOTA: Se l'analisi proteomica non è desiderato, passo 1.5 può essere saltato. Concentrare la glicoproteina denaturato sul filtro mediante centrifugazione campioni a 14.000 xg per 40 min. Gettare il flusso attraverso. 2. N linked Glycan digestione enzimatica Lavare il campione con 100 ml PNGase digerire tampone. Concentrare la glicoproteina sul filtro a 14000 g per 20 minuti ed eliminare il flusso attraverso. Ripetere la fase di lavaggio e concentrato due volte, per un totale di tre volte, ottenendo un concentrato nel volume morto filtro (~ 5 microlitri). scartare tuttofluire attraverso. Scartare collezione fiala una volta lavaggi sono completi. Raccogliere tutte le eluenti futuri e lavaggi in un nuovo flacone di raccolta. NOTA: PNGase digerire buffer in H 2 O 18 può essere utilizzato durante la fase di digestione PNGase F per l'etichettatura degli isotopi stabili di siti asparagina de glicosilata, che diventano chimicamente deamidato. Aggiungere 2 ml di libero-glicerolo PNGase F (75.000 x unità / ml) per filtrare dopo il trasferimento in una fiala collezione fresca. Aggiungere 98 ml di PNGase digerire tampone, portando il volume totale di 100 ml, e delicatamente pipetta su e giù sul filtro per mescolare. Enzimatica digerire i glicani alle condizioni di passaggi 2.2.1, 2.2.2, 2.2.3 O. NOTA: tre metodi per la deglycosylation delle proteine ​​possono essere utilizzati. Per l'analisi esclusivamente glycomics (non proteomica), si raccomanda la lunga incubazione nel passo 2.2.1. Per glycomics e proteomica di ricerca, i passi 2.2.2 e 2.2.3 produrrà peptidi di alta qualità con il minimo non-spdeamidation ecific. Glycomics-unico protocollo di digestione (18hr): incubare i campioni a 37 ° C per 18 ore a fendere enzimaticamente tutti N -glycans. Spike-in protocollo digestione (SPI): incubare i campioni a 50 ° C per 2 ore. Lavorando in fretta, rimuovere i campioni e picco di un ulteriore 2 ml di libera-glicerolo PNGase F (75.000 x unità / ml). Leggermente vortice i campioni per 1-2 secondi per mescolare. Incubare i campioni a 50 ° C per un ulteriore 2 ore. protocollo di digestione a microonde (MD): I campioni in un rack provetta galleggiante. campioni galleggiare in un 1 L bicchiere riempito con 1 L di acqua deionizzata (DI). Il becher nel centro di un forno a microonde (950 W) con una piastra rotante. Forno a microonde a 60% di potenza (570 W) per 5 min. Per raffreddare, prelevare campioni e mantenere a temperatura ambiente per 2 min. Poi microonde per altri 5 min a 60% di potenza. NOTA: Le impostazioni di potenza a microonde dovranno essere regolati in base alla potenza massima del forno a microonde.potenza media deve essere mantenuta costante tra i modelli. 3. eluizione di N -glycans Eluire glicani centrifugando il campione a 14.000 xg per 20 min a 20 ° C. Aggiungere 100 pl di tampone di PNGase digeriscono al filtro e centrifugare a 14000 xg per 20 min a 20 ° C. Raccogliere lavaggio contenente ogni residuo N -linked glicani, nella stessa fiala di raccolta come eluente. Ripetere due volte. Rimuovere il filtro e mettere in nuova fiala di raccolta. Incubare campioni glicani nella -80 ° C freezer fino congelati (30-60 min). Lavaggio a compimento, a temperatura ambiente, in concentratore sotto vuoto (4-6 hr). NOTA: N -glycans possono essere conservati a -20 ° C per un massimo di sei mesi prima della derivatizzazione. 4. Le proteine ​​FASP Digestione NOTA: Se proteomica o analisi del sito deamidation non è desiderato, sezione 4 del protocollo può essere saltato. Risciacquare tegli filtro, che contiene i peptidi deamidati, con 400 ml di buffer di 8 M urea. Chiudere la fiala di raccolta e leggermente vortex per miscelare. Concentrati sul filtro a 14000 xg per 15 min. Eliminare tutte le flow-through. Ripetere passaggio 4.1 altre due volte, per un totale di tre lavaggi tampone urea. Lavare il filtro, che contiene i peptidi deamidati, con 400 ml di 2 M urea, 10 mM CaCl 2 Buffer (tripsina digerire buffer). Chiudere la fiala di raccolta e leggermente vortex per miscelare. Concentrati sul filtro a 14000 xg per 15 min. Eliminare tutte le flow-through. Ripetere passo 4.1 altre due volte, per un totale di tre lavaggi tripsina digerire tampone. Scartare collezione fiala una volta lavaggi sono completi. Raccogliere tutte le eluenti futuri e lavaggi in un nuovo flacone di raccolta. Aggiungere 50 ml suina tripsina modificata in un 1:50 o 1: 5 tripsina: proteine ​​(w / w) Rapporto per gli esperimenti di scoperta o di proteomica quantitativa, rispettivamente.Chiudere la fiala di raccolta e leggermente vortex per miscelare. Incubare i campioni a 37 ° C per 2 ore. Funzionando rapidamente, rimuovere i campioni e picco di altri 50 ml di tripsina a 1:50 o 1: rapporto proteine: 5 tripsina. Leggermente vortice i campioni per 1-2 secondi per mescolare. Incubare i campioni a 50 ° C per un ulteriore 2 ore. Eluire i peptidi facendo girare a 14000 xg per 15 min. Sciacquare i peptidi rimanenti dal filtro con acido formico 400 ml 1% e il 0,001% Zwittergent 3-16 (buffer di tempra). Eluire il filtro facendo girare a 14000 xg per 15 min. Quantificare la concentrazione di peptide nei campioni da Bradford 19 o saggio BCA 20. Incubare campioni peptide nel -80 ° C freezer fino congelati (30-60 min). Lavaggio a compimento, a temperatura ambiente, in concentratore sotto vuoto (4-6 hr). NOTA: Secco peptidi possono essere conservati a -20 ° C per un massimo di tre mesi. Risospendere proteine ​​tryptic appena prima di liquid cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS) analisi 2% acetonitrile, 98% H 2 O, e acido formico 0,1% (fase mobile A) alla concentrazione desiderata. Le concentrazioni di peptide tryptic della gamma plasma 2,5 ml 100-300 ng / ml. 5. Derivatizzazione di N -linked glicani con idrofobi idrazide Tag Ricostituire secchi pesanti (SIL) o luce (NAT) reagenti P2GPN in 1 ml di MeOH 75:25: Acido acetico (soluzione derivatizzazione), per una concentrazione finale di 0,25 mg / ml. Reagenti saranno necessari fino a 10 minuti per solubilizzare completamente. Ampiamente vortice per garantire la completa solubilizzazione. Nota: Nel caso in cui questo protocollo derivatizzazione viene utilizzato con -glycans N standard, contro glicani purificati, il rapporto molare di P2GPN: glycan dovrebbe essere di circa (e non meno) di 17: 1. Tag essiccato N -glycans con 200 ml (50 mg) di SIL o NAT P2GPN reagente. Pipetta su e giù per risospendere glicani secchi. Vortex samples e poi spin down campioni per ~ 5 sec su una centrifuga da banco. Reagire i glicani con il reagente per 3 ore a 56 ° C. Immediatamente passare glicani dal termostato al concentratore a vuoto. Secco a compimento a 55 ° C (3-5 ore). NOTA: Questo passaggio spegne la reazione di derivatizzazione; il campione deve essere completamente asciutta per evitare cross-reattività nelle fasi successive. NOTA: campioni essiccati, contrassegnati possono essere conservati a -20 ° C per un massimo di sei mesi. Risospendere tagged N -glycans in 25-50 ml di H 2 O appena prima analisi LC-MS. Pipetta su e giù per garantire N -glycans sono completamente solubilizzato. NOTA: Il volume per risospensione dipende dalla concentrazione iniziale di glicoproteina, che può essere valutato dalla concentrazione proteica di partenza. Tuttavia, la gamma può variare in base alla tipologia del campione e deve essere ottimizzato individualmente. Centrifugare i campioni a 14000 g per 5 min. Rimuovere il supernatant, facendo attenzione a non lasciare che la punta della pipetta toccare il fondo della provetta. Nota: tag eccesso può non essere visibile ad occhio, ma sarà ridotto di centrifugazione. Combinare una coppia di campioni NAT e SIL, se desiderato per quantificazione relativa, in un rapporto 1: 1 per l'analisi tandem. 6. ultra-alta pressione cromatografia liquida e la spettrometria di massa Analisi NOTA: Il LC e MS condizioni descritte per una facile NLC-1000 e un alto campo Q Exactive rispettivamente, sono stati ottimizzati in-house per l'analisi proteomica e per l'analisi dei glicani 21. Queste condizioni possono essere adattati ad altri sistemi LC alla pressione o nano-ultra-alti e altri spettrometri ad alta risoluzione di massa di potenza, ma possono richiedere lievi modifiche. L'uso di alta risoluzione spettrometria di massa di potenza è necessario per l'identificazione e l'analisi glycan deamidation 22,23. NOTA: i passaggi 6,1-6,3 può essere skipped se si utilizzano un adeguato cromatografia in fase inversa o interazione idrofila trappola commerciale e colonna. Sintetizzare un fritta in ID 100 pM capillare secondo Meiring et al. 24 per l'uso come una trappola. Confezione trappola sotto pressione con 2,6 mM, 100 Å, C 18 materiale di imballaggio e tagliato ad una lunghezza di 5 cm. Confezione un colonna ID emettitore 75 pM sotto pressione con 2,6 mM, 100 Å, C 18 materiale di imballaggio e tagliato ad una lunghezza di 30 cm. Preparare due diversi metodi LC-MS per la proteomica (6.4.1) e glicomica (6.4.2) i flussi di lavoro. Nota: Proteine ​​e campioni glycan possono essere eseguiti sulla stessa configurazione trappola / colonna in qualsiasi ordine. Per l'analisi delle proteine, iniettare ~ 400 ng di proteine ​​nella colonna in fase mobile A (MPA). Eseguire il campione a 300 Nl / min, secondo la Tabella 1, con 1 ml di pre-colonna equilibrazione (500 bar) e 5 microlitri colonna analitica equilibrazione(500 bar). Ionizzano proteine ​​nelle condizioni MS forniti in Tabella 2. Per l'analisi glycan, iniettare 5 ml di risospeso, P2GPN tagged campioni equimolari NAT / SIL sulla colonna. Eseguire l'esempio a 300 Nl / min, secondo la tabella 3, con un 2 ml di pre-colonna di equilibrio (500 bar) e un 5 ml equilibrio colonna analitica (500 bar). Ionizzano glicani alle condizioni MS previste nella tabella 4. Tempo % MPA MPB% 0 100 0 5 98 2 105 80 20 135 68 32 136 5 95 151 5 95 152 100 0 167 100 0 Tabella 1. condizioni LC per l'analisi proteomica. Un eluizione gradiente con fase mobile B (MPB, 98% acetonitrile, 2% H 2 O, 0,1% acido formico) è stata effettuata per eluire peptidi per la proteomica fucile da caccia, dipendente dai dati di acquisizione , esperimenti MS. MS 1 Parametri Range di massa (Th) 375-1500 Risoluzione 120.000 AGC 1 × 10 6 Max di ionizzazione Tempo 30 S-Lens FR livello 55 capillare Temp (° C) 300 Spray tensione 1.75 MS 2 Parametri acquisizione Tipo Top20 Risoluzione 15.000 AGC 1 × 10 5 Max di ionizzazione Tempo 30 Rapporto underfill 2% Isolation Finestra (Th) 1.4 Esclusione stato di carica +1 Normalizzato Collision Energy 27 Tempo di esclusione (s) 20 Tabella 2: condizioni di MS per l'analisi proteomica I parametri per Elettrospray, MS 1 di acquisizione, e MS acquisizione 2 in uno strumento Orbitrap utilizzando dissociatio alta energia.n (HCD) sono date. Tempo % MPA MPB% 0 95 5 1 70 30 41 60 40 46 37 63 47 10 90 55 10 90 56 95 5 66 95 5 Tabella 3:. Condizioni per l'analisi LC glicani un gradiente di eluizione è stata effettuata per eluire idrazide tagged N -glycans per l'analisi MS. <tr> MS 1 Parametri Range di massa (Th) 600-1900 Risoluzione 60.000 AGC 5 × 10 5 Max di ionizzazione Tempo 64 S-Lens FR livello 65 Capillare Temp (° C) 325 Spray tensione 1.75 MS 2 Parametri acquisizione Tipo Top12 Risoluzione 15.000 AGC 5 × 10 4 Max di ionizzazione Tempo 100 Rapporto underfill 1% Isolation Finestra (Th) 1.4 Fisso Prima Messa </td> 125 Scalinata normalizzato Collision Energia 10/20/30 Esclusione Tempo (sec) 15 Tabella 4: condizioni MS per idrazide tagged N analisi -glycan I parametri per Elettrospray, MS 1 acquisizione, e l'acquisizione MS 2 in uno strumento Orbitrap mediante dissociazione alta energia (HCD) sono date.. 7. Proteomica e analisi deamidation Identificare le proteine ​​/ peptidi che utilizzano standard di strumenti di ricerca bioinformatica. Nota: Il seguente protocollo di analisi è stato progettato utilizzando i database Swiss-Prot / TrEMBL in UniProtKB e la ricerca tramite SEQUEST nel software Proteome Discoverer 1.4, tuttavia, il protocollo può essere tradotto direttamente a qualsiasi motore di ricerca di proteine ​​e il punteggio utilizzando un software di interfaccia grafica. Tutti i comandi indicati di seguito sono accessibili in interfacce software attraverso i menu a discesa. <li> Crea o scaricare un database di sequenze di proteine ​​organismo appropriato da dati genomici o database proteoma disponibili come descritto da Apweiler et al. 25 Nota: i database comuni proteoma includono Swiss-Prot, TrEMBL, e NCBI, ma possono essere costruiti a partire dai dati in-house come bene. All'interno del software, scegliere un motore di ricerca del database e selezionare i parametri in funzione della qualità dei dati acquisiti e la rigorosità della ricerca desiderata, come descritto da Perkins et al. per mascotte 26 o Eng et al. per SEQUEST 27. Per i dati di massa elevata precisione, impostare i parametri per la ricerca nel software come segue: max 2 perse fratture, 5 ppm precursore tolleranza di massa, e 0.02 Da frammento tolleranza di massa (per ottimizzare il rilevamento preciso deamidation 22) e comprendono le seguenti modifiche peptide tryptic : "carbamidomethyl (C)" modifica statico e "deamidation (N / Q)" e "oxidation (M) "modifiche dinamiche. Se si utilizza 18 O etichettatura digestione, include" deamidation 18 O (1) ", come una modifica dinamica supplementare. Search, utilizzando il motore selezionato, i dati grezzi peptide contro il database di proteine ​​(7.1.1). Nota: le tolleranze di massa devono essere appropriate per lo strumento utilizzato e non arbitrariamente basso. Nota: La funzione di ricerca è completata automaticamente dal software utilizzando algoritmi specifici vari motori di ricerca. L'algoritmo di filtro (MASCOTTE), SEQUEST, o altre combinazioni di algoritmi sono impiegati per identificare le proteine ​​da peptidi e di segnare la validità dei colpi; ulteriori informazioni sugli strumenti disponibili sono coperti in una recensione da Gonzalez-Galarza et al. 28,29. A seconda del software, può essere necessario selezionato a discrezione dell'utilizzatore parametri di ricerca aggiuntivi. Esportare i peptidi identificati per curation manuale e Fürthanalisi ER. Curare manualmente un elenco di peptidi contenenti un deamidation identificati sulla asparagina della N -linked motivo glicosilazione (NX (S / T), dove X ≠ P). Cross-convalidare questi siti con noti motivi di glicosilazione dalla letteratura e creare due piscine di risultati (validati e teorica). Utilizzare il conteggio spettrale 30 per confrontare l'occupazione per cento di un determinato sito di glicosilazione confrontando l'abbondanza di forme deamidati e non deamidati. 8. Glycan quantificazione relativa Nota: L'identificazione e la quantificazione in seguito è stato completato utilizzando il software Xcalibur. Tuttavia, qualsiasi software che analizza i dati grezzi e automaticamente integra picchi cromatografici possono essere sostituiti. Generare un elenco teorica di composizioni glicani dalle biologicamente possibili combinazioni di esosi, desossi-esosi, esosamine, acidi sialici, e altri saccharides. Per questo scopo, un database glycan umana è stato pubblicato da Walker et al. 15 e può essere usato così com'è. Per i database teorici, i vincoli biologici specifici per specie devono essere imposti sullo spazio combinatoria, e queste regole sono descritte da Kronewitter et al. 31. Calcolare le masse monoisotopico glycan (M) dalle masse atomiche per ogni composizione di carica del protone Uniti + 1-3. Modificare le masse monoisotopico per includere l'aggiunta del NAT (254,14,191 mila g / mol) o SIL (260,162,042 mila g / mol) tag P2GPN. Aprire il programma "Setup Processing" dal punto di vista tabella di marcia in Xcalibur. Impostazione di un metodo di lavorazione come esattamente descritto nel materiale supplementare da Walker et al. 15 utilizzando l'elenco generato nel passaggio 8.2 contenente le masse monoisotopico teorici per la [M + H] 1+, [M + 2H] 2+, e [ M + 3H] 3+ specie. Nota: per confermare l'identità glycan oltre accuratadi massa, per NAT / SIL in fronte-retro viene eseguito, verificare che NAT e SIL N coppie -glycan co-eluire con lo stesso tempo di ritenzione. Qualitativamente, cross-validare identificazioni con gli spettri MS 2, che deve contenere picchi appartenenti alla serie ossonio ione 32. Esportare la, cromatogramma ionico estratto integrato (XIC) aree di Excel per ottenere le abbondanze SIL e NAT come esattamente descritto nel materiale supplementare da Walker et al. 15 In Excel, programma le celle di una nuova colonna per calcolare la correzione per la sovrapposizione peso molecolare regolando l'abbondanza SIL secondo l'equazione pubblicato da Walker et al 1 5.: , dove A è il picco monoisotopico e la sovrapposizione isotopo teorica, , Può essere calcolato indipendentemente composizione. In una seconda colonna, il programma le cellule per normalizzare i canali NAT e SIL usando l'equazione per il fattore glicani normalizzata totale (TGNF), per spettro, come descritto da Walker et al 1 5.: , dove N è il numero di N -glycans sopra del limite di quantificazione. In una nuova colonna, programma le cellule di assorbire il rapporto SIL: glicani NAT (o viceversa) per calcolare la piega-cambiamento nella concentrazione tra i due campioni.

Representative Results

Figura 1:. È dato Lo schema del metodo ZANNE-P2GPN codifica idrofobica accoppiato (Metodo A) per combinate proteomica e glycomics analisi passaggi che differiscono tra di lavorazione e tandem glycomics glicomica-only e di analisi proteomica, con l'individuazione dei siti di glicosilazione, sono evidenziati. clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. L'in-linea proteomica e glycomics, filtro a base di P2GPN metodo di codifica idrofobica (Metodo A) è stato convalidato per l'identificazione, quantificazione e pregiudizi peso molecolare utilizzando campioni di plasma pool gallina (Figura 1). Per esclusivamente esperimenti glicomica, inter-comparazioni nelle abbondanze di N -glycans estratti con il metodoA Carbograph SPE (gold standard, Metodo B) sono state effettuate (Figura 2). Non ci sono state differenze significative nei abbondanze dei glicani tra i due metodi. La variabilità intra-è stata valutata anche attraverso la quantificazione della SIL: NAT rapporto tra glicani estratte con lo stesso metodo. I log 2 -distributions di entrambi i metodi erano Gaussiana, centrata sullo zero, e non significativamente diverso (Figura 3A-B). Il peso molecolare compreso tra i due protocolli completamente sovrapposti, suggerendo che il filtro non discrimina N -glycans riferiscono al range di peso molecolare e idrofilicità (Figura 4). Figura 2: una miscela equimolare di NAT e SIL N -glycans estratto secondo il metodo A o il metodo B è stata preparata da 2,5 ml di plasma gallina (n = 4) I campioni sono stati anale.yzed da UPLC-MS secondo i parametri raccomandati suggeriti nella sezione 6. Le abbondanze per ogni glicani, in ogni canale NAT / SIL, sono stati calcolati integrando l'area sotto il cromatogramma ionico estratto (MMA = 3 ppm), la correzione per il molecolare sovrapposizione peso e regolazione dal TGNF. Questi rapporti sono indicati con i loro errori standard. Le abbondanze di Metodo B: Metodo A N -glycans non erano significativamente differenti (p> 0,05). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3: Il intra-variabilità nella (A) Metodo A (N = 133) o (B) Metodo B (N = 123) è stata confrontata strategie. NAT e SIL miscele equimolari di N -glycans, dello stesso schema di estrazione, Sono stati analizzati più di tre repliche tecniche. I log 2 -distributions sono stati centrati sullo zero e non erano significativamente differenti tra i due flussi di lavoro. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 4: Gli intervalli di peso molecolare di glicani da ogni strategia stati confrontati. I due flussi di lavoro ha prodotto glicani che attraversa lo stesso intervallo di peso molecolare. N -glycans rilevato in un protocollo contro l'altro è caduto appena sopra il limite di rilevazione (1 × 10 5 abbondanza) e non riflettono distorsione sistematica. Cliccate qui per visualizzare un più grande versione di questa figura. <p class="jove_content" fo:keep-together.all'interno-page = "1"> Mantenimento delle proteine ​​deglicosilate dal filtro peso molecolare abilitati in linea proteoma ampia analisi e sito di glicosilazione identificazione. Protocolli multipli per la purificazione combinato di glicani e proteine ​​sono stati confrontati con una preparazione FASP tradizionale senza deglycosylation (Tabella 5). Il nostro tipico filtro 18 ore basato PNGase F digestione, seguito da FASP tripsina digest (protocollo Std) ha portato a livelli significativi di deamidation non specifici, che possono interferire con l'identificazione di glycosites. Pertanto, un metodo che utilizza un tempo di incubazione più breve ad elevata temperatura (50 ° C) ed una fase picco-in PNGase F (SPI protocollo) è stato esplorato in alternativa, con un protocollo di digestione a microonde (protocollo MD), per ridurre al minimo non deamidation specifica. I glicani osservati nei nuovi metodi di digestione non erano significativamente differenti in composizioni o abbondanze dallo standard 18 ore, 37 ° C filtro PNGase F digest ( <strong> Figura 5). In combinazione con una breve incubazione tripsina, deamidation non specifica è risultata significativamente ridotta, con un tasso di falsi positivi per glycosites <5% (Tabella 5). proteine peptidi Peptidi Deamidated Glycosites glicoproteine + – + – + – + – + – FASP <td colspan="2"> 249 3083 795 5 5 18hr 217 304 6013 5086 1029 733 257 24 112 18 MD 270 266 5190 5125 465 455 254 8 102 7 SPI 281 288 4729 4482 602 573 232 10 145 8 . Tabella 5: confronto dei dati di proteomica da un tripsina standard di digerire rispetto al metodo di codifica in linea ZANNE-P2GPN sono stati fatti i preparativi sono stati eseguiti con (+) e senza (-) PNGase F per determinare i tassi di non-specifica deamidation e stima di fondo glycosite tassi di falsi positivi. Le proteine ​​sono state identificate con 1% false discovery rate (FDR); peptidi sono stati filtrati in base a "alto" fiducia peptide in Proteome Discoverer 1.4 (q <0.01); glycosites sono stati identifiEd in base a sequenze uniche che contengono deamidation del motivo glicosilazione conservata (NXS / T); e glicoproteine ​​sono stati definiti come proteine ​​identificate contenenti almeno un glycosite identificato. Figura 5: accorciato protocolli per glicani sono stati sviluppati per ridurre al minimo deamination nei campioni e rispetto al 18hr ZANNE PNGase F digest. Le differenze medie di abbondanze erano il 10% e il 5% per il MD (2.2.3) e (2.2.2) protocolli SPI, rispettivamente. Dei 48 glicani individuati, il 90% appare meno variazione di 1,5 volte. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

High-throughput quantitative methods are needed to facilitate routine glycan analysis. For the last thirty years, glycomics analysis has been limited to a subset of research groups, despite its importance in disease, clinical applications, and pharmaceuticals. The FANGS-P2GPN purification and tagging method for glycomics and proteomics performs the same analysis on a single aliquot of sample, reducing the cost of supplies and the amount of material needed (particularly important in human and mouse studies). Furthermore, efforts to minimize variability in preparations are critically important, as every additional step contributes to error, potentially masking important but low-abundant changes in case-control studies. Coupling of FANGS to hydrophobic hydrazide tagging allows protein and glycan samples to be run on the same RPLC column, enhances glycan ionization, provides for relative quantification, and can be quantitatively applied to plasma.

For N-glycan analysis, it is critical to use the suggested level of PNGase F to achieve full de-glycosylation. Though glycans are solvent exposed, denaturation of proteins and excess enzyme help ensure efficient and complete cleavage. For accurate quantitation of the glycans, it is necessary to ensure that they are completely dried after derivatization to quench the reaction and prevent cross-reactions when mixing the NAT and SIL species. Finally, when extending the workflow to glycosite analysis, timing of the steps is critical to minimize non-specific deamidation. The modified protocols provided for combined glycomics and proteomics analysis work consistently when performed accordingly.

The workflow achieves accurate relative quantitation of N-glycans from plasma compared to the gold-standard, SPE method. There is no apparent bias in the types of glycans extracted in terms of molecular weight, hydrophilicity, and compositional structure. Though we have not explored the qualitative analysis of O-linked glycans, we expect that FANGS could accommodate the addition of a β-elimination step post-PNGase F digestion of N-linked glycans. However, procedures would require significant modification for reagent cleanup prior to mass spectrometry, and peptide analysis will be significantly impacted. For proteomics, the same depth of proteome coverage is achieved compared to traditional FASP methods. Importantly, methods achieve a minimal false discovery rate for N-glycan deamidation. While the method is compatible with 18O labeling of Asn during the PNGase digestion step22,23, the low glycosylation site false discovery rate suggests that it may not be necessary, further reducing costs and complexity.

The proteome is not enriched for glycoproteins in this method, which has both advantages and disadvantages. Certain low abundant glycoproteins may not be detected in the analysis. However, the occupancy of glycosylated sites per protein, can be compared between biological samples. Additionally, the error and bias introduced from lectin affinity purification or chemical enrichment is eliminated. In conclusion, coupling of FANGS to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy results in a simplified, quantitative, high-throughput method for the tandem analysis of the glycome and proteome with great potential for application in clinical case-control studies.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was generously funded by the NIH NCI IMAT Program Grant R33 (CA147988-02), the NIH NIGMS Graduate Training in Molecular Biotechnology at NC State Grant (T32GM008776), the US Dept. of Education GAANN Fellowship Program in Molecular Biotechnology at NC State Grant (P200A140020), the W.M. Keck Foundation, and North Carolina State University. Hen plasma was obtained with the assistance of Dr. James N. Petitte and Rebecca Wysocky in the NC State University Dept. of Poultry Science.

Materials

Acetic Acid (50%):  Sigma Aldrich  45754
Acetonitrile, HPLC grade Burdick & Jackson  AH015-4
Ammonium Bicarbonate Sigma Aldrich  A6141
Bradford Reagent Sigma Aldrich  B6916 Alternative: Bicinchoninic acid kit (Sigma Aldrich BCA1)
Calcium chloride Sigma Aldrich  C1016
Centrifuge Eppendorf 5804 R Alternate centrifuges that reach 14,000 x g are suitable
DL-Dithiothreitol, 1M in solution Sigma Aldrich  646563
Easy-nLC 1000 Thermo Scientific LC120 Alternate nano or ultra high pressure LCs will produce similar data, such as: 1. Dionex UltiMateÒ 3000 LC (Thermo Scientific) 2. Acquity UPLC (Waters)
Floating Tube Rack TedPella 20831-20
Fetuin New England Biolabs  P6042S
Fisher Scientific Isotemp Standard Lab Ovens Fisher Scientific 11-690-625F Alternate incubators that reach 56 °C are suitable
Formic Acid Sigma Aldrich  56302
GE Microwave Oven General Electric 57B5 E82904 Any microwave with adjustable power settings is suitable
INLIGHT Glycan Tagging Kit  Cambridge Isotope Laboratories GTK-1000 The INLIGHT kit provides NAT and SIL versions of the P2GPN reagent.
Iodoacetamide Sigma Aldrich  A3221
Kinetix 2.6 mM, 100 Å, C18 bulk stationary phase Phenomenex  Bulk Media Alternative: Any C18 stationary phase £ 5 mM 
Mascot Daemon Software and Server Matrix Science Alternative: Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific)
Methanol, HPLC grade Burdick & Jackson  AH230-4
PicoFrit Self-Pack Column: 360 um, OD 75um ID, 15 um tip, non-coated, 5 per box, 50 cm New Objective 1 5 PF360-75-15-N-5
PNGase F (glycerol-free), 75,000 units/ml New England BioLabs  P0705L
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer Thermo Scientific Alternate high mass accuracy (£ 5 ppm) mass spectrometers will provide similar data
RNase B New England Biolabs  P7817S
Trypsin from Porcine Pancreas Sigma Aldrich  T6567-5X
Urea Sigma Aldrich  51456
Vacuum ConcentratorSavant SPD131DDA SpeedVac Concentrator Thermo Scientific SPD131DDA Alternate vacuum concentrators are suitable
Vivacon 500 30 kDa Filters  Sartorius Stedim Biotech VN01H22 Alternative: Amicon Ultra 0.5 Centrifugal Filter Units with Ultracel-10 kDa Membrane (Millipore UFC501096)
Water, HPLC grade Burdick & Jackson  AH365-4
Water, 18O Cambridge Isotope Laboratories OLM-240-97-1 The addition of 18O in the PNGase F digest step is optional and may not be necessary for deamidation studies completed with 95% confidence
Xcalibur 2.0 Thermo Scientific XCALIBUR20
Zwittergent Test Kit Merck Millipore 693030
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Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy. J. Vis. Exp. (109), e53735, doi:10.3791/53735 (2016).
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