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Chemistry

Un Glicómica cuantitativa y Proteómica estrategia de purificación combinada

Published: March 08, 2016
doi:
10.3791/53735
, ,
1Department of Chemistry,North Carolina State University

Summary

A high-throughput protocol was developed for combined proteomics and glycomics purification and LC-MS/MS quantification in plasma. Deamidation analysis of N-linked glycosylation motifs was specific to deglycosylated sites. Accurate quantitation of N-glycans was achieved by coupling filter aided N-glycan separation to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy.

Abstract

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define pathways, improve treatment, understand disease, and aid biomarker discovery. N-linked glycosylation is one of the most important and robust post-translational modifications on proteins and regulates critical cell functions such as signaling, adhesion, and enzymatic function. Analytical techniques to purify and analyze N-glycans have remained relatively static over the last decade. While accurate and effective, they commonly require significant expertise and resources. Though some high-throughput purification schemes have been developed, they have yet to find widespread adoption and often rely on the enrichment of glycopeptides. One promising method, developed by Thomas-Oates et al., filter aided N-glycan separation (FANGS), was qualitatively demonstrated on tissues. Herein, we adapted FANGS to plasma and coupled it to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy in order to achieve accurate relative quantification by liquid chromatography mass spectrometry and enhanced electrospray ionization. Furthermore, we designed new functionality to the protocol by achieving tandem, shotgun proteomics and glycosylation site analysis on hen plasma. We showed that N-glycans purified on filter and derivatized by hydrophobic hydrazide tags were comparable in terms of abundance and class to those by solid phase extraction (SPE); the latter is considered a gold standard in the field. Importantly, the variability in the two protocols was not statistically different. Proteomic data that was collected in-line with glycomic data had the same depth compared to a standard trypsin digest. Peptide deamidation is minimized in the protocol, limiting non-specific deamidation detected at glycosylation motifs. This allowed for direct glycosylation site analysis, though the protocol can accommodate 18O site labeling as well. Overall, we demonstrated a new in-line high-throughput, unbiased, filter based protocol for quantitative glycomics and proteomics analysis.

Introduction

En el campo de la proteómica, la preparación de muestras de filtro asistido (FASP) ha sido ampliamente adoptado por su capacidad para minimizar la cantidad de material de partida, disminuir los artefactos de preparación de muestras, y maximizar el rendimiento de la muestra 1. Sin embargo, tal método tiene todavía a surgir y ganar tracción para el campo de glycomics. Desarrollo de alto rendimiento, flujos de trabajo cuantitativos son necesarios debido a la función integral de glicosilación en defensa biológica y su modulación por el cáncer o las enfermedades 2,3. En los mamíferos, N -glycans están compuestos de unidades repetitivas de sacáridos (hexosas (Hex), hexosaminas (HexNAc), ácidos siálico (NeuAc), y fucoses (FUC)), que decoran una estructura de núcleo (Hex 3 HexNAc 2) 4 unido covalentemente a asparagina. Aunque el glycospace es considerablemente grande cuando se cuentan isómeros (> 10 12), que es bastante pequeña en una base composición y pesos moleculares suelen oscilar entre 1,000-8,000 Da 5 </ Sup>. La homogeneidad de composición de la clase y la hidrofilia de glicanos plantean desafíos únicos para la purificación, separación y espectrometría de masas (MS) 6 flujos de trabajo.

Tradicionalmente, N -glycans son digeridos a partir de proteínas o péptidos por péptido N -glycosidase F (PNGasa F) y luego enriquecidos mediante cromatografía de afinidad de lectina 7, capturados por los granos de hidrazida 8, o purificarse a través de extracción en fase sólida (SPE) 9,10. Si bien estos métodos son muy eficaces, introducen medidas adicionales para el desalado y limitan el número de muestras procesadas simultáneamente. Durante la última década, se han propuesto una serie de plataformas de alto rendimiento para glycomics. Kim et al. Publicó un método semi-automatizado usando una placa de 96 pocillos SPE accionado por vacío 11. Alternativamente, un método de afinidad-filtro (N–glyco FASP) fue desarrollado por el grupo de Mann, que requiere la derivación inicial de la fifiltro con una combinación de 12 lectinas. Por último, el grupo Thomas-Oates propuso un método semi-cuantitativo, el filtro de separación Aided N -Glycan (FANGS), que explotaba el tamaño de composición estrecha de la glycospace 13. Basándose en filtros de corte de peso molecular, pequeños contaminantes se lavaron primero en perder y luego los -glycans N se digirieron y se eluyeron. desglicosiladas proteínas permanecen en el filtro en este protocolo y se pueden someter a FASP en línea.

Identificación y cuantificación de los glicanos de ionización por electrospray (ESI) MS requiere separaciones fuera de línea para la solución (parcial) de isómeros y derivación para la detección de especies de bajo abundantes. Etiquetado en la individualidad cuando la normalización de las etiquetas con la estrategia de hidrazida glicanos confiere compatibilidad con cromatografía líquida de fase inversa (RPLC) 14,15. El 4-fenetil-benzohydrazide (P2PGN) etiqueta hidrofóbica media la hidrofilicidad de los glicanos, ENHancing ionización por, en promedio, cuatro veces 16. Aunque otras técnicas, tales como permetilación 17 o amina reactiva químicas de marcado 18, ofrecen ventajas similares, en la reacción de la hidrazida, glicanos se hacen reaccionar 1: 1 estequiométricamente en condiciones fáciles. Cuantificación relativa se logra mediante el análisis de muestras tándem derivados con nativo (NAT) o 13 C 6 etiquetas de isótopos estables (SIL).

El siguiente método evoluciona FANGS para aplicaciones de plasma y la acopla a la etiqueta hidrófobo P2GPN para la cuantificación relativa precisa. Además, se ha diseñado para llevar a cabo la proteómica de escopeta, perfiles, desamidación y glycomics cuantitativos en una sola parte alícuota de la muestra, sin comprometer la integridad de los análisis.

Protocol

1. La proteína y glicoproteína desnaturalización y alquilación Para preparaciones estándar, carga de 2,5 l de una solución de 0,1 g / l de glicoproteína (por ejemplo, fetuina o RNasa B) en un 30 kDa o 10 kDa de peso molecular de corte del filtro (MW). Para las muestras de plasma biológicos, comprobar la concentración de proteína mediante un ensayo de 20 proteínas (BCA) de ácido estándar Bradford 19 o bicinconınico. Diluir el plasma, si es necesario, con bicarbonato de amonio 100 mM (NH 4 HCO 3) en H 2 O (PNGasa Recopilación Buffer) a un pH de ~ 7 para contener entre 10 a 100 mg de proteína total / ml. Cargar plasma 2,5 l (25 a 250 mg de proteína) sobre un filtro. Nota: este protocolo sólo se ha probado en plasma a partir de muestras de sangre recogidas en presencia de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Añadir 2 l de solución de ditiotreitol 1 M (DTT) a cada muestra en el filtro. Diluir la muestra con 200 l PNGasa digieren buffer. Se tapa el tubo de muestra del filtro y la ligera vórtice, teniendo cuidado de no perturbar el filtro de su alojamiento. Incubar la muestra a 56 ° C durante 30 min para desnaturalizar las proteínas y glicoproteínas. Para alquilar el muestras, añadir 50 l 1 M yodoacetamida, para dar una concentración final de ~ 200 mM, y se incuba a 37 ° C durante 60 min. NOTA: Si no se desea el análisis de proteómica, paso 1.5 se puede omitir. Se concentra la glicoproteína desnaturalizada en el filtro mediante la centrifugación de las muestras a 14.000 xg durante 40 min. Desechar el flujo a través. 2. N = Conectado glicanos digestión enzimática Lavar la muestra con 100 l de tampón PNGasa digerir. Se concentra la glicoproteína en el filtro a 14.000 xg durante 20 minutos y desechar el flujo a través. Repetir la etapa de lavado y concentrado de dos veces, para un total de tres veces, produciendo un concentrado en el filtro de volumen muerto (~ 5 l). Desechar todode flujo continuo. Descartar colección vial una vez lavados están completos. Recoge todas las futuras eluyentes y lavados en un nuevo vial de recogida. NOTA: se puede utilizar durante la etapa de digestión PNGasa F para el etiquetado de isótopos estables de los sitios de asparagina glicosilada, que se convierten químicamente desamidada PNGasa digerir tampón en H 2 O 18. Añadir 2 l de glicerol libre de PNGasa F (x 75.000 unidades / ml) para filtrar después de transferir a un vial de recogida fresca. Añadir 98 l de PNGasa digieren tampón, con lo que un volumen total de 100 l, y suavemente pipeta hacia arriba y abajo en el filtro para mezclar. Enzimáticamente digerir los glicanos en las condiciones en las medidas 2.2.1, 2.2.2, 2.2.3 O. NOTA: Tres métodos para la desglicosilación de las proteínas se pueden utilizar. Para el análisis únicamente glycomics (no proteómica), se recomienda el tiempo de incubación en el paso 2.2.1. Para glycomics y proteómica de investigación, los pasos 2.2.2 y 2.2.3 se producen péptidos de alta calidad con un mínimo de no-spdesamidación ecific. Protocolo de digestión glycomics sólo para (18 horas): Se incuban las muestras a 37 ° C durante 18 horas para escindir enzimáticamente todos -glycans N. Pico en el protocolo con la digestión (SPI): Incubar las muestras a 50 ° C durante 2 horas. Trabajando rápidamente, extraer muestras y pico en un 2 l adicional de glicerol libre de PNGasa F (x 75.000 unidades / ml). Ligeramente vórtice las muestras durante 1-2 segundos para mezclar. Se incuban las muestras a 50 ° C durante 2 horas más. protocolo de digestión por microondas (MD): Colocar las muestras en un bastidor de tubo de microcentrífuga flotante. muestras de flotar en un 1 L vaso de precipitados llenos de 1 L de agua desionizada (DI). Colocar el vaso de precipitados en el centro de un horno de microondas (950 W) con una placa giratoria. Microondas a 60% de potencia (570 W) durante 5 min. Para enfriar, extraer muestras y mantener a temperatura ambiente durante 2 min. Luego de microondas durante 5 min más a potencia 60%. NOTA: la configuración de energía de microondas tendrán que ser ajustada en base a la potencia de salida máxima del horno de microondas.La potencia media debe mantenerse constante entre los modelos. 3. La elución de N -glycans Eluir glicanos mediante la centrifugación de la muestra a 14.000 xg durante 20 min a 20 ° C. Añadir 100 l de PNGasa digieren tampón para el filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 20 min a 20 ° C. Suma de lavado que contiene cualquier N restante -vinculada glicano, en el mismo vial de recogida como el eluyente. Repetir dos veces. Retire el filtro y el lugar en el nuevo vial de recogida. Incubar las muestras de glicano en el -80 ° C congelador hasta que se congele (30-60 min). Seco hasta su finalización, a temperatura ambiente, en concentrador de vacío (4-6 h). NOTA: N -glycans pueden ser almacenadas a -20 ° C durante un máximo de seis meses antes de la derivatización. 4. La proteína de digestión FASP NOTA: Si no se desea la proteómica o análisis del sitio de desamidación, la sección 4 del protocolo puede ser omitido. enjuague tque filtrar, que contiene los péptidos desamidadas, con 400 l de tampón de 8 M urea. Se tapa el vial de recogida y ligeramente mezclar en vórtex. Concentrarse en el filtro a 14.000 xg durante 15 min. Desechar todo el flujo a través. Repita el paso 4.1 dos veces adicionales, para un total de tres lavados con tampón urea. Enjuague el filtro, que contiene los péptidos deamidadas, con 400 l de 2 M de urea, 2 mM CaCl tampón 10 (tripsina digerir tampón). Se tapa el vial de recogida y ligeramente mezclar en vórtex. Concentrarse en el filtro a 14.000 xg durante 15 min. Desechar todo el flujo a través. Repetir el paso 4.1 dos veces adicionales, para un total de tres lavados con tampón de digestión con tripsina. Descartar colección vial una vez lavados están completos. Recoge todas las futuras eluyentes y lavados en un nuevo vial de recogida. Añadir 50 l de tripsina porcina modificada en un 1:50 o 1: 5 de tripsina: proteína (w / w) relación para el descubrimiento o proteómica cuantitativos experimentos, respectivamente.Se tapa el vial de recogida y ligeramente mezclar en vórtex. Incubar las muestras a 37 ° C durante 2 hr. Trabajando rápidamente, extraer muestras y pico en un 50 l adicionales de tripsina a la 1:50 ó 1: proteínas: tripsina 5. Ligeramente vórtice las muestras durante 1-2 segundos para mezclar. Se incuban las muestras a 50 ° C durante 2 horas más. La elución de los péptidos por girando a 14.000 xg durante 15 min. Enjuagar los péptidos restantes del filtro con ácido fórmico 400 l 1% y Zwittergent 3-16 (tampón de enfriamiento rápido) 0,001%. Eluir fuera el filtro haciendo girar a 14.000 xg durante 15 min. Cuantificar la concentración de péptido en las muestras por Bradford 19 o ensayo BCA 20. Incubar las muestras de péptidos en el congelador a -80ºC hasta que se congele (30-60 min). Seco hasta su finalización, a temperatura ambiente, en concentrador de vacío (4-6 h). NOTA: Secado péptidos pueden ser almacenadas a -20 ° C durante un máximo de tres meses. Volver a suspender las proteínas trípticos justo antes de Liquid cromatografía-espectrometría de masas (LC-MS) análisis en 2% de acetonitrilo, 98% H 2 O, y ácido fórmico 0,1% (fase móvil A) a la concentración deseada. Las concentraciones de péptidos trípticos de la gama de plasma de 2,5 l 100 a 300 ng / l. 5. La derivatización de N -vinculada glicanos con hidrófobos hidrazida Etiquetas Reconstituir pesados ​​(SIL) o la luz (NAT) reactivos P2GPN secas en 1 ml de MeOH 75:25: ácido acético (solución derivatización), para una concentración final de 0,25 mg / ml. Los reactivos tendrá un máximo de 10 minutos para disolver completamente. Ampliamente vórtice para asegurar la solubilización completa. Nota: En el caso de este protocolo se utiliza derivatización con -glycans N estándar, frente a glicanos purificados, la relación molar de P2GPN: glicano debe ser aproximadamente (y no menos) que 17: 1. Tag secado N -glycans con 200 l (50 g) de reactivo SIL o NAT P2GPN. Pipetear arriba y hacia abajo para volver a suspender glicanos secos. sa Vortexmples y luego girar hacia abajo muestras de ~ 5 seg en una centrífuga de mesa. Reaccionar los glicanos con el reactivo durante 3 horas a 56 ° C. pasar de inmediato glicanos de la incubadora para el concentrador de vacío. Seca hasta su finalización a 55 ° C (3-5 horas). NOTA: Este paso apaga la reacción de derivatización; la muestra debe estar completamente seco para evitar la reactividad cruzada en las etapas subsiguientes. NOTA: Las muestras secas, etiquetados pueden ser almacenadas a -20 ° C durante un máximo de seis meses. Resuspender etiquetada N -glycans en 25 a 50 l de H 2 O justo antes del análisis LC-MS. Pipetear arriba y hacia abajo para asegurar N -glycans son totalmente solubilizado. Nota: El volumen para la resuspensión es dependiente de la concentración de partida de la glicoproteína, que puede ser estimada a partir de la concentración de proteína de partida. Sin embargo, el rango variará según el tipo de muestra y debe ser optimizado de forma individual. Centrifugar las muestras a 14.000 xg durante 5 min. Retire el supernatant, teniendo cuidado de no dejar que la punta de la pipeta toque el fondo del tubo de centrífuga. Nota: El exceso de etiqueta puede no ser visible para el ojo, pero será reducida por centrifugación. Combinar un par de muestras de NAT y SIL, si se desea para la cuantificación relativa, en una proporción de 1: 1 para el análisis de tándem. 6. ultra-alta presión cromatografía líquida de espectrometría de masas y análisis NOTA: La LC y MS condiciones descritas para una fácil NLC-1000 y un campo de alta Q Exactive, respectivamente, se optimizaron en el local para el análisis de proteómica y para el análisis de glicanos 21. Estas condiciones pueden ser adaptadas a otros sistemas LC ultra-alta presión-o nano y otros espectrómetros de masas de alta resolución de potencia, pero pueden requerir ligeras modificaciones. El uso de espectrometría de masas de alta potencia de resolución es necesario para la identificación y el análisis de glicanos desamidación 22,23. NOTA: Los pasos pueden ser 6.1-6.3 skipped si se utilizan una cromatografía de fase inversa apropiado o trampa comercial interacción hidrófila y la columna. Sintetizar una frita en capilar ID 100 micras, de conformidad a Meiring et al. 24 para su uso como una trampa. Empaque la trampa bajo presión con 2,6 M, 100 A, C 18 y el material de embalaje cortado a una longitud de 5 cm. Paquete de una columna de ID de emisor 75 M bajo presión con 2,6 M, 100 Å, material de embalaje C18 y cortado a una longitud de 30 cm. Preparar dos métodos LC-MS para los diferentes proteómica (6.4.1) y (6.4.2) glicómica flujos de trabajo. Nota: Las proteínas y glicanos muestras pueden ejecutarse en la misma configuración trampa / columna en cualquier orden. Para el análisis de proteínas, inyectar ~ 400 ng de proteína en la columna en la fase A móvil (MPA). Ejecutar el ejemplo a 300 nl / min, de acuerdo con la Tabla 1, con un 1 l de equilibrio antes de la columna (500 bar) y un 5 l de equilibrio columna analítica(500 bar). Ionizar las proteínas en las condiciones MS proporcionados en la Tabla 2. Para el análisis de glicanos, inyectar 5 l de resuspendido, P2GPN etiquetada muestras equimolares NAT / SIL en la columna. Ejecutar el ejemplo a 300 nl / min, de acuerdo con la Tabla 3, con un 2 l de equilibrio antes de la columna (500 bar) y un 5 l de equilibrio columna analítica (500 bar). Ionizar glicanos en las condiciones MS proporcionados en la Tabla 4. Hora MPA% MPB% 0 100 0 5 98 2 105 80 20 135 68 32 136 5 95 151 5 95 152 100 0 167 100 0 Tabla 1. Condiciones de LC para el análisis proteómico. Una elución en gradiente con fase móvil B (MPB, 98% de acetonitrilo, 2% H 2 O, 0,1% de ácido fórmico) se realizó para eluir los péptidos de la proteómica de escopeta, dependiente de los datos de adquisición , MS experimentos. MS 1 Parámetros Rango de masas (Th) 375-1500 Resolución 120.000 AGC 1 × 10 6 Tiempo máximo de ionización 30 S-Lens Nivel FR 55 capilar Temp (° C) 300 potencial de pulverización 1.75 MS 2 Parámetros Tipo de adquisición Top20 Resolución 15.000 AGC 1 × 10 5 Tiempo máximo de ionización 30 Relación de llenado insuficiente 2% Ventana de aislamiento (Th) 1.4 Exclusión cargo del Estado +1 Normalizado colisión Energía 27 Tiempo (s) de exclusión 20 Tabla 2: Condiciones de MS para el análisis proteómico Los parámetros para la ionización por electrospray, MS 1 y MS adquisición, 2 adquisición de un instrumento Orbitrap utilizando dissociatio de alta energía.n (HCD) se les da. Hora MPA% MPB% 0 95 5 1 70 30 41 60 40 46 37 63 47 10 90 55 10 90 56 95 5 66 95 5 Tabla 3:. Condiciones de LC para el análisis de glicanos una elución en gradiente se realizó para eluir hidrazida etiquetados N -glycans para el análisis de MS. <tr> MS 1 Parámetros Rango de masas (Th) 600-1900 Resolución 60.000 AGC 5 × 10 5 Tiempo máximo de ionización 64 S-Lens Nivel FR sesenta y cinco Capilar de temperatura (° C) 325 potencial de pulverización 1.75 MS 2 Parámetros Tipo de adquisición Top12 Resolución 15.000 AGC 5 × 10 4 Tiempo máximo de ionización 100 Relación de llenado insuficiente 1% Ventana de aislamiento (Th) 1.4 En primer lugar fijo de masas </td> 125 Escalonada Normalizado colisión Energía 10/20/30 Exclusión Tiempo (seg) 15 Tabla 4: Condiciones de MS para el análisis hidrazida etiquetada -glycan N Los parámetros para la ionización por electrospray, MS 1 adquisición, y la adquisición de MS 2 en un instrumento Orbitrap mediante la disociación de alta energía (HCD) se les da.. 7. Análisis de Proteómica y desamidación Identificar proteínas / péptidos usando herramientas de búsqueda bioinformática estándar. Nota: El siguiente protocolo de análisis fue diseñado utilizando las bases de datos Swiss-Prot / TrEMBL en UniProtKB y búsqueda a través de SEQUEST en el software del Proteoma descubridor 1.4, sin embargo, el protocolo puede ser traducido directamente en cualquier motor de búsqueda de proteínas y de puntuación usando un software de interfaz gráfica de usuario. Todos los comandos que se indican a continuación pueden ser accedidos en interfaces de software a través de menús desplegables. <li> Crear o descargar una base de datos de secuencias de proteínas organismo apropiado de los datos genómicos o proteoma bases de datos disponibles como se describe por Apweiler et al. 25 Nota: proteoma bases de datos comunes incluyen Swiss-Prot, TrEMBL, y NCBI, pero pueden ser construidos a partir de datos internos también. Dentro del software, elegir un motor de búsqueda de base de datos y seleccionar los parámetros de acuerdo con la calidad de los datos adquiridos y la rigurosidad de la búsqueda deseada, como se describe por Perkins et al. para la mascota o 26 Eng et al., para SEQUEST 27. Para los datos de gran masa de precisión, definir los parámetros de la búsqueda en el software de la siguiente manera: max 2 fallado divisiones, 5 ppm precursor de tolerancia de masa, y 0,02 Da fragmento de tolerancia de masa (para la detección precisa desamidación optimizado 22) e incluyen las siguientes modificaciones de péptidos trípticos : "Carbamidomethyl (C)" modificación estática y "desamidación (N / Q)" y "bueyconso- (M) "modificaciones dinámicas. Si se utiliza 18 O etiquetado digestión, incluye" desamidación 18 O (1) "como una modificación dinámica adicional. Búsqueda, utilizando el motor seleccionado, los datos de péptidos primas contra la base de datos de proteínas (7.1.1). Nota: Las tolerancias de masas deberán ser apropiados para el instrumento utilizado y no arbitrariamente baja. Nota: La función de búsqueda se ha completado automáticamente por el software utilizando algoritmos específicos diversos motores de búsqueda. El algoritmo percolador (MASCOT), SEQUEST, u otras combinaciones de algoritmos se emplean para identificar las proteínas a partir de péptidos y anotar la validez de los resultados; más información sobre las herramientas disponibles están cubiertas de una revisión de González-Galarza et al. 28,29. Dependiendo del software, los parámetros de búsqueda adicionales pueden necesitar ser seleccionados de acuerdo a la discreción del usuario. Exportar los péptidos identificados para la curación manual y FurthEl análisis er. Cura manualmente una lista de péptidos que contienen una desamidación identificado en la asparagina de la N -vinculada motivo de glucosilación (NX- (S / T), donde X ≠ P). Validación cruzada de estos sitios de glicosilación con motivos conocidos de la literatura y crear dos grupos de resultados (validado y teórica). Utilizar el conteo espectral 30 para comparar el porcentaje de ocupación de un sitio de glicosilación determinado mediante la comparación de la abundancia de formas deamidadas y no desamidada. 8. cuantificación relativa Glycan Nota: se completó la siguiente identificación y cuantificación mediante el software XCalibur. Sin embargo, cualquier software que analiza los datos en bruto y automáticamente integra picos cromatográficos pueden estar sustituidos. Generar una lista teórica de composiciones de glicanos de las biológicamente posibles combinaciones de hexosas, desoxi-hexosas, hexosaminas, ácidos siálico, y otra saccharides. Para este propósito, una base de datos de glicano humana ha sido publicada por Walker et al. 15 y puede ser utilizado como está. Para bases de datos teóricos, las limitaciones biológicas específicas de las especies deben ser impuestas en el espacio combinatoria, y estas reglas son descritos por Kronewitter et al. 31. Calcular las masas monoisotopic glicanos (M) de las masas atómicas para cada composición para estados de carga de protones + 1-3. Modificar las masas monoisotopic para incluir la adición de la NAT (254,14191 g / mol) o SIL (260.162042 g / mol) P2GPN etiqueta. Abra el programa "Configuración de procesamiento" de la vista hoja de ruta en XCalibur. Estableció un método de transformación como se describe exactamente en el material complementario de Walker et al. 15 utilizando la lista generada en el paso 8.2 que contiene las masas monoisotopic teóricos para el [M + H] 1+, [M + 2H] 2+ y [ M + 3H] 3+ especies. Nota: Para confirmar la identidad exacta de glicanos allámasa, para NAT / SIL impresión a doble cara se ejecuta, compruebe que NAT y SIL N pares -glycan co-eluyen con el mismo tiempo de retención. Cualitativamente, validación cruzada de las identificaciones con los espectros MS 2, el cual debe contener picos que pertenecen a la serie de iones oxonio 32. Exportar el, cromatograma de iones extraídos integrado (XIC) áreas a Excel para obtener las abundancias SIL y NAT exactamente como se describe en el material complementario de Walker et al. 15 En Excel, el programa de las células en una nueva columna para el cálculo de la corrección para la superposición de peso molecular mediante el ajuste de la abundancia SIL según la ecuación publicada por Walker et al 1 5.: , donde A es el pico monoisotopic y la superposición de isótopos teórico, , Puede calcularse de forma independiente por cada composición. En una segunda columna, el programa de las células para normalizar los canales de NAT y SIL usando la ecuación para el factor de glicano total normalizada (TGNF), por espectro, como se describe por Walker et al 1 5.: , donde N es el número de N -glycans por encima del límite de cuantificación. En una nueva columna, el programa de las células para llevar la relación de SIL: glicanos NAT (o viceversa) para calcular el factor de cambio en la concentración entre las dos muestras.

Representative Results

Figura 1:. Se da el esquema del método FANGS-P2GPN etiquetado hidrófobo acoplado (método A) para la proteómica y glycomics combinados análisis de los pasos que difieren entre glicómica sólo para glycomics de procesamiento y en tándem y el análisis de proteómica, con identificación del sitio de glicosilación, se destacan. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. La línea en la proteómica y la glycomics, P2GPN método de marcado hidrófobo basado en filtro (Método A) fue validado para la identificación, cuantificación, y el sesgo de peso molecular utilizando muestras de plasma de gallina agrupados (Figura 1). Por únicamente glicómica experimentos, inter-comparaciones en las abundancias de N -glycans extraídos por el métodoUna de carbograph SPE (estándar de oro, Método B) se hicieron (Figura 2). No hubo diferencias significativas en la abundancia de glicanos entre los dos métodos. La variabilidad intra-también se evaluó mediante la cuantificación del SIL: NAT proporción de glicanos extraídos por el mismo método. El registro de 2 -distributions de ambos métodos fueron Gaussian, centrado en cero, y no significativamente diferente (Figura 3A-B). El peso molecular oscila entre los dos protocolos completamente solapados, lo que sugiere que el filtro no discriminó N -glycans basa en rango de peso molecular y carácter hidrófilo (Figura 4). Figura 2: Una mezcla equimolar de NAT y SIL N -glycans extraído por el método A y B se preparó a partir de 2,5 l de plasma de gallina (N = 4) Las muestras fueron anal.yzed por UPLC-MS de acuerdo con los parámetros recomendados sugeridas en la sección 6. Las abundancias para cada glicano, en cada canal de NAT / SIL, se calcularon mediante la integración del área bajo el cromatograma de iones extraídos (MMA = 3 ppm), la corrección de la molecular solapamiento de peso, y el ajuste por el TGNF. Estas relaciones se muestran con sus errores estándar. Las abundancias de Método B: Método A N -glycans no fueron significativamente diferentes (p> 0,05). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: La intra-variabilidad en el (A) Método A (N = 133) o (B) Método B (N = 123) se comparó estrategias. NAT y SIL mezclas equimolares de N -glycans, desde el mismo esquema de extracción, Se analizaron más de tres repeticiones técnica. El registro de 2 -distributions estaban centrados en cero y no fueron significativamente diferentes entre los dos flujos de trabajo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Los rangos de peso molecular de glicanos de cada estrategia se compararon. Los dos flujos de trabajo rindieron glicanos que abarca el mismo rango de peso molecular. N -glycans detectó en un protocolo contra el otro cayó justo por encima del límite de detección (1 × 10 5 abundancia) y no reflejan el sesgo sistemático. Haga clic aquí para ver una más grande versión de esta figura. <p class="jove_content" fo:keep-together.dentro-page = "1"> La retención de las proteínas desglicosiladas por el filtro de pesos moleculares activados en línea proteoma amplio análisis y la identificación del sitio de glicosilación. Múltiples protocolos para la purificación combinada de glicanos y proteínas se compararon con una preparación FASP tradicional sin desglicosilación (Tabla 5). Nuestro típico filtro 18 hr PNGasa F digestión base, seguido de digestión con tripsina FASP (protocolo Std) dio lugar a niveles significativos de desamidación no específica, que pueden interferir con la identificación de glycosites. Por lo tanto, un método que utiliza un tiempo de incubación más corto a temperatura elevada (50 ° C) y una etapa de espiga-en PNGasa F (protocolo SPI) se exploró como alternativa, junto con un protocolo de digestión por microondas (protocolo MD), para minimizar la no desamidación específico. Los glicanos observados en los nuevos métodos de digestión no fueron significativamente diferentes en las composiciones o abundancias de la norma de 18 horas, 37 ° C filtro PNGasa F digerir ( <strong> Figura 5). En combinación con una breve incubación con tripsina, desamidación no específica se redujo significativamente, con una tasa de falsos positivos para glycosites <5% (Tabla 5). Las proteínas péptidos Los péptidos desamidada glycosites glicoproteínas + – + – + – + – + – FASP <td colspan="2"> 249 3083 795 5 5 18hr 217 304 6013 5086 1029 733 257 24 112 18 Maryland 270 266 5190 5125 465 455 254 8 102 7 SPI 281 288 4729 4482 602 573 232 10 145 8 . Tabla 5: Las comparaciones de los datos proteómicos de una tripsina estándar resumida en lugar se hizo el método de marcado en la línea FANGS-P2GPN Los preparativos se realizaron con (+) y sin (-) PNGasa F para determinar las tasas de fondo de la desamidación y la estimación no específica glycosite tasas de falsos positivos. Las proteínas se identificaron con 1% de tasa de falso descubrimiento (FDR); péptidos fueron filtradas en base a la confianza péptido "alta" en Proteoma descubridor 1.4 (q <0,01); glycosites se identified basado en secuencias únicas que contienen desamidación del motivo de glucosilación conservado (NXS / T); y glicoproteínas se definieron como proteínas identificadas que contienen al menos un glycosite identificado. Figura 5: acortado protocolos para glicanos se desarrollaron para minimizar la desaminación de las muestras y se compararon con el 18hr FANGS PNGasa F digestión. Las diferencias en las abundancias promedio fueron de 10% y 5% para el MD (2.2.3) y (2.2.2) protocolos SPI, respectivamente. De los 48 glicanos identificados, el 90% está representada la variación de menos de 1,5 veces. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

High-throughput quantitative methods are needed to facilitate routine glycan analysis. For the last thirty years, glycomics analysis has been limited to a subset of research groups, despite its importance in disease, clinical applications, and pharmaceuticals. The FANGS-P2GPN purification and tagging method for glycomics and proteomics performs the same analysis on a single aliquot of sample, reducing the cost of supplies and the amount of material needed (particularly important in human and mouse studies). Furthermore, efforts to minimize variability in preparations are critically important, as every additional step contributes to error, potentially masking important but low-abundant changes in case-control studies. Coupling of FANGS to hydrophobic hydrazide tagging allows protein and glycan samples to be run on the same RPLC column, enhances glycan ionization, provides for relative quantification, and can be quantitatively applied to plasma.

For N-glycan analysis, it is critical to use the suggested level of PNGase F to achieve full de-glycosylation. Though glycans are solvent exposed, denaturation of proteins and excess enzyme help ensure efficient and complete cleavage. For accurate quantitation of the glycans, it is necessary to ensure that they are completely dried after derivatization to quench the reaction and prevent cross-reactions when mixing the NAT and SIL species. Finally, when extending the workflow to glycosite analysis, timing of the steps is critical to minimize non-specific deamidation. The modified protocols provided for combined glycomics and proteomics analysis work consistently when performed accordingly.

The workflow achieves accurate relative quantitation of N-glycans from plasma compared to the gold-standard, SPE method. There is no apparent bias in the types of glycans extracted in terms of molecular weight, hydrophilicity, and compositional structure. Though we have not explored the qualitative analysis of O-linked glycans, we expect that FANGS could accommodate the addition of a β-elimination step post-PNGase F digestion of N-linked glycans. However, procedures would require significant modification for reagent cleanup prior to mass spectrometry, and peptide analysis will be significantly impacted. For proteomics, the same depth of proteome coverage is achieved compared to traditional FASP methods. Importantly, methods achieve a minimal false discovery rate for N-glycan deamidation. While the method is compatible with 18O labeling of Asn during the PNGase digestion step22,23, the low glycosylation site false discovery rate suggests that it may not be necessary, further reducing costs and complexity.

The proteome is not enriched for glycoproteins in this method, which has both advantages and disadvantages. Certain low abundant glycoproteins may not be detected in the analysis. However, the occupancy of glycosylated sites per protein, can be compared between biological samples. Additionally, the error and bias introduced from lectin affinity purification or chemical enrichment is eliminated. In conclusion, coupling of FANGS to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy results in a simplified, quantitative, high-throughput method for the tandem analysis of the glycome and proteome with great potential for application in clinical case-control studies.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was generously funded by the NIH NCI IMAT Program Grant R33 (CA147988-02), the NIH NIGMS Graduate Training in Molecular Biotechnology at NC State Grant (T32GM008776), the US Dept. of Education GAANN Fellowship Program in Molecular Biotechnology at NC State Grant (P200A140020), the W.M. Keck Foundation, and North Carolina State University. Hen plasma was obtained with the assistance of Dr. James N. Petitte and Rebecca Wysocky in the NC State University Dept. of Poultry Science.

Materials

Acetic Acid (50%):  Sigma Aldrich  45754
Acetonitrile, HPLC grade Burdick & Jackson  AH015-4
Ammonium Bicarbonate Sigma Aldrich  A6141
Bradford Reagent Sigma Aldrich  B6916 Alternative: Bicinchoninic acid kit (Sigma Aldrich BCA1)
Calcium chloride Sigma Aldrich  C1016
Centrifuge Eppendorf 5804 R Alternate centrifuges that reach 14,000 x g are suitable
DL-Dithiothreitol, 1M in solution Sigma Aldrich  646563
Easy-nLC 1000 Thermo Scientific LC120 Alternate nano or ultra high pressure LCs will produce similar data, such as: 1. Dionex UltiMateÒ 3000 LC (Thermo Scientific) 2. Acquity UPLC (Waters)
Floating Tube Rack TedPella 20831-20
Fetuin New England Biolabs  P6042S
Fisher Scientific Isotemp Standard Lab Ovens Fisher Scientific 11-690-625F Alternate incubators that reach 56 °C are suitable
Formic Acid Sigma Aldrich  56302
GE Microwave Oven General Electric 57B5 E82904 Any microwave with adjustable power settings is suitable
INLIGHT Glycan Tagging Kit  Cambridge Isotope Laboratories GTK-1000 The INLIGHT kit provides NAT and SIL versions of the P2GPN reagent.
Iodoacetamide Sigma Aldrich  A3221
Kinetix 2.6 mM, 100 Å, C18 bulk stationary phase Phenomenex  Bulk Media Alternative: Any C18 stationary phase £ 5 mM 
Mascot Daemon Software and Server Matrix Science Alternative: Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific)
Methanol, HPLC grade Burdick & Jackson  AH230-4
PicoFrit Self-Pack Column: 360 um, OD 75um ID, 15 um tip, non-coated, 5 per box, 50 cm New Objective 1 5 PF360-75-15-N-5
PNGase F (glycerol-free), 75,000 units/ml New England BioLabs  P0705L
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer Thermo Scientific Alternate high mass accuracy (£ 5 ppm) mass spectrometers will provide similar data
RNase B New England Biolabs  P7817S
Trypsin from Porcine Pancreas Sigma Aldrich  T6567-5X
Urea Sigma Aldrich  51456
Vacuum ConcentratorSavant SPD131DDA SpeedVac Concentrator Thermo Scientific SPD131DDA Alternate vacuum concentrators are suitable
Vivacon 500 30 kDa Filters  Sartorius Stedim Biotech VN01H22 Alternative: Amicon Ultra 0.5 Centrifugal Filter Units with Ultracel-10 kDa Membrane (Millipore UFC501096)
Water, HPLC grade Burdick & Jackson  AH365-4
Water, 18O Cambridge Isotope Laboratories OLM-240-97-1 The addition of 18O in the PNGase F digest step is optional and may not be necessary for deamidation studies completed with 95% confidence
Xcalibur 2.0 Thermo Scientific XCALIBUR20
Zwittergent Test Kit Merck Millipore 693030
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Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy. J. Vis. Exp. (109), e53735, doi:10.3791/53735 (2016).
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