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Chemistry

Eine quantitative Glycomics und Proteomics Kombinierte Reinigungsstrategie

Published: March 08, 2016
doi:
10.3791/53735
, ,
1Department of Chemistry,North Carolina State University

Summary

A high-throughput protocol was developed for combined proteomics and glycomics purification and LC-MS/MS quantification in plasma. Deamidation analysis of N-linked glycosylation motifs was specific to deglycosylated sites. Accurate quantitation of N-glycans was achieved by coupling filter aided N-glycan separation to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy.

Abstract

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define pathways, improve treatment, understand disease, and aid biomarker discovery. N-linked glycosylation is one of the most important and robust post-translational modifications on proteins and regulates critical cell functions such as signaling, adhesion, and enzymatic function. Analytical techniques to purify and analyze N-glycans have remained relatively static over the last decade. While accurate and effective, they commonly require significant expertise and resources. Though some high-throughput purification schemes have been developed, they have yet to find widespread adoption and often rely on the enrichment of glycopeptides. One promising method, developed by Thomas-Oates et al., filter aided N-glycan separation (FANGS), was qualitatively demonstrated on tissues. Herein, we adapted FANGS to plasma and coupled it to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy in order to achieve accurate relative quantification by liquid chromatography mass spectrometry and enhanced electrospray ionization. Furthermore, we designed new functionality to the protocol by achieving tandem, shotgun proteomics and glycosylation site analysis on hen plasma. We showed that N-glycans purified on filter and derivatized by hydrophobic hydrazide tags were comparable in terms of abundance and class to those by solid phase extraction (SPE); the latter is considered a gold standard in the field. Importantly, the variability in the two protocols was not statistically different. Proteomic data that was collected in-line with glycomic data had the same depth compared to a standard trypsin digest. Peptide deamidation is minimized in the protocol, limiting non-specific deamidation detected at glycosylation motifs. This allowed for direct glycosylation site analysis, though the protocol can accommodate 18O site labeling as well. Overall, we demonstrated a new in-line high-throughput, unbiased, filter based protocol for quantitative glycomics and proteomics analysis.

Introduction

Auf dem Gebiet der Proteomik, Filter gestützten Probenvorbereitung (FASP) wurde für seine Fähigkeit , zu minimieren , um die Menge des Ausgangsmaterials, verringern die Probenvorbereitung Artefakte und maximieren den Probendurchsatz 1 weithin angenommen. Jedoch ist ein solches Verfahren noch entstehen und gewinnen Traktion für den Bereich der glycomics. Entwicklung von Hochdurchsatz werden quantitative Abläufe in biologischen Verteidigung wegen der integrale Rolle der Glykosylierung erforderlich und ihre Modulation durch Krebs oder Krankheiten 2,3. Bei Säugetieren sind N – Glycane von sich wiederholenden Saccharideinheiten (Hexosen (Hex), Hexosamine (HexNAc), Sialinsäure (NeuAc) und fucoses (Fuc)) zusammengesetzt ist , die eine Kernstruktur (Hex 3 HexNAc 2) 4 kovalent gebundene dekorieren zu Asparagin. Obwohl die glycospace beträchtlich groß ist , wenn Isomere gezählt (> 10 12), ist es ziemlich klein auf eine Zusammensetzung Basis und Molekulargewichte typischerweise im Bereich von 1.000-8.000 Da 5 </ Sup>. Die kompositorische Homogenität der Klasse und die Hydrophilie der Glykane stellen besondere Herausforderungen an die Reinigung, Trennung und Massenspektrometrie (MS) Workflows 6.

Herkömmlicherweise werden N – Glycane aus Proteinen oder Peptiden von Peptid – N -glycosidase F (PNGase F) und dann angereichert durch Lectin – Affinitätschromatographie 7, eingefangen durch Hydrazid beads verdaut 8 oder über Festphasenextraktion (SPE) 9,10 gereinigt. Während diese Verfahren alle sehr wirksam sind, stellen sie zusätzliche Schritte zur Entsalzung und begrenzen die Anzahl der Proben gleichzeitig verarbeitet. Während des letzten Jahrzehnts wurde eine Reihe von Hochdurchsatz-Plattformen für glycomics vorgeschlagen. Kim et al. Veröffentlichte eine halbautomatisierte Verfahren einen vakuumbetriebenen, SPE 96-Well – Platte unter Verwendung von 11. Alternativ wurde ein Affinitäts-Filter – Methode (N -glyco-FASP) von der Gruppe Mann entwickelt, die die anfängliche Derivatisierung der fi erforderlichlter mit einem Verbund aus Lektinen 12. Schließlich schlägt die Thomas-Oates Gruppe eine semi-quantitatives Verfahren, das Filter Aided N – Glycan Separation (FANGS), die die enge Zusammensetzungs Größe des glycospace 13 ausgenutzt. Unter Berufung auf das Molekulargewicht Cut-off – Filter wurden kleine Verunreinigungen zuerst zu verschwenden gewaschen und dann wurden die N – Glycane verdaut und eluiert. Deglycosylierten Proteine ​​bleiben auf dem Filter in diesem Protokoll und kann in-line FASP unterworfen werden.

Identifizierung und Quantifizierung von Glykane durch Elektrospray-Ionisation (ESI) MS erfordert Offline-Trennungen für (teilweise) Auflösung von Isomeren und Derivatisierung zum Nachweis von niedrig häufig vorkommende Arten. Beschriften in der Individualität , wenn sie mit Glycan Hydrazid Tags Strategie verleiht Kompatibilität mit Umkehrphasen – Flüssigkeitschromatographie (RPLC) 14,15 normalisieren. Das 4-phenethyl-benzohydrazide (P2PGN) hydrophob tag vermittelt die Hydrophilie der Glykane, enhwuchten Ionisation durch im Durchschnitt vierzähligen 16. Obwohl andere Techniken, wie Permethylierung 17 oder aminreaktiven Markierungschemien 18, ähnliche Vorteile bieten, in dem Hydrazid Reaktion umgesetzt Glykane 1: 1 stöchiometrisch in facile Bedingungen. Relative Quantifizierung erfolgt durch Tandem – Analyse von Proben erreicht mit nativen derivatisiert (NAT) oder 13 C 6 stabile Isotopenmarkierungen (SIL).

Die folgende Methode entwickelt FANGS für Plasmaanwendungen und koppelt es an die P2GPN hydrophoben Tag für eine genaue relative Quantifizierung. Weiterhin wurde entworfen Schrotflinte Proteomik, Deamidierung Profilierung und quantitative glycomics auf einem einzelnen Aliquot von Probe durchzuführen, ohne die Integrität der Analysen zu beeinträchtigen.

Protocol

1. Protein und Glycoprotein Denaturierung und Alkylierungen Für Standardpräparate, Last 2,5 ul einer 0,1 ug / ul – Lösung von Glykoprotein (zB Fetuin oder RNase B) auf ein 30 kDa oder 10 kDa Molekulargewicht (MW) Cut-off – Filter. Für biologische Plasmaproben, überprüfen Sie die Proteinkonzentration durch eine Standard – Bradford 19 oder Bicinchoninsäure 20 (BCA) Protein – Assay. Verdünne das Plasma gegebenenfalls mit 100 mM Ammoniumbicarbonat (NH 4 HCO 3) in H 2 O (PNGase Digest Buffer) bei einem pH – Wert von ~ 7 enthält zwischen 10-100 mg / ml Gesamtprotein. Belastung 2,5 ul Plasma (25-250 ug Protein) auf einen Filter. Hinweis: Dieses Protokoll wurde nur auf die Plasma aus Blutproben getestet in Gegenwart von Ethylendiamintetraessigsäure gesammelt (EDTA). Fügen Sie 2 ul 1 M Dithiothreitol-Lösung (DTT) zu jeder Probe in dem Filter. Verdünnen Sie die Probe mit 200 ul PNGase verdauen Puffer. Verschließen Sie die Filterprobenröhrchen und leicht Wirbel, wobei darauf geachtet, nicht den Filter aus seinem Sitz zu stören. Inkubieren der Probe bei 56 ° C für 30 min, die Proteine ​​und Glykoproteine ​​zu denaturieren. Um die Proben alkylieren, fügen Sie 50 ul 1 M Iodacetamid, um eine Endkonzentration von ~ 200 mM geben, und bei 37 ° C für 60 min. HINWEIS: Wenn die Proteomik-Analyse nicht erwünscht ist, Schritt 1.5 übersprungen werden kann. Man konzentriert das denaturierte Glykoprotein auf den Filter durch Proben bei 14.000 × g für 40 min zentrifugiert. Entsorgen Sie durchströmen. 2. N -verknüpftem Glycan enzymatische Verdauung Waschen Sie die Probe mit 100 ul PNGase Puffer verdauen. Konzentriere das Glykoprotein auf dem Filter bei 14.000 xg für 20 min und entsorgen durchströmen. Wiederholen des Wasch und Konzentrat Schritt zweimal für insgesamt drei Mal, um ein Konzentrat in dem Filter Totvolumen (~ 5 & mgr; l) ergibt. Entsorgen Sie alledurchströmen. Verwerfen Sammelgefäß einmal Waschungen sind abgeschlossen. Sammeln Sie alle zukünftigen Eluenten und Waschungen in einem neuen Sammelgefäß. HINWEIS: PNGase verdauen Puffer in H 2 18 O während des PNGase F Digerierungsstufe für stabile Isotopenmarkierung von de-glycosylierten Asparagin Seiten, die sich chemisch deamidiertes verwendet werden. Fügen Sie 2 ul glycerinfreie PNGase F (x 75.000 Einheiten / ml) zu filtern, nachdem es auf eine frische Sammelgefäß übertragen. Hinzufügen 98 ul PNGase verdauen Puffer Gesamtvolumen auf 100 ul zu bringen und vorsichtig pipettiert nach oben und unten auf dem Filter zu mischen. Enzymatisch verdauen die Glykane unter den Bedingungen in den Schritten 2.2.1, 2.2.2, 2.2.3 ODER. HINWEIS: Drei Verfahren zur Deglykosylierung von Proteinen verwendet werden können. Für ausschließlich glycomics Analyse (keine Proteomics), die lange Inkubation in Schritt 2.2.1 empfohlen. Für die Forschung glycomics und Proteomik, Schritte 2.2.2 und 2.2.3 werden qualitativ hochwertige Peptide mit minimalen nicht-sp produzierenecific Desamidierung. Glycomics-only Verdau Protokoll (18 h): Inkubieren Proben bei 37 ° C für 18 Stunden enzymatisch alle N – Glycane spalten. Spike-Verdau in Protokoll (SPI): Inkubieren Proben bei 50 ° C für 2 Stunden. Arbeits schnell entfernen Proben und Spike in einem zusätzlichen 2 ul glycerinfreie PNGase F (x 75.000 Einheiten / ml). verwirbeln leicht die Proben für 1-2 Sekunden zu mischen. Inkubieren der Proben bei 50 ° C für weitere 2 Stunden. Mikrowellenaufschluss-Protokoll (MD): Ort Proben in einem Mikrozentrifugenröhrchen Floating-Rack. Float Proben in einem 1 L-Becherglas mit 1 l entionisiertem (DI) Wasser gefüllt. Das Becherglas in der Mitte eines Mikrowellenofens (950 W) mit einer rotierenden Platte. Mikrowellen bei 60% Leistung (570 W) für 5 min. Zur Kühlung entfernen Proben und halten Sie für 2 Minuten bei Raumtemperatur. Dann Mikrowelle für weitere 5 Minuten bei 60% Leistung. HINWEIS: Mikrowellen-Leistungseinstellungen müssen auf der Basis der maximalen Leistungsabgabe der Mikrowellen eingestellt werden.Durchschnittliche Leistung sollte konstant zwischen Modellen statt. 3. Elution von N – Glycane für 20 min bei 20 ° C eluieren Glykane, indem die Probe bei 14000 xg zentrifugiert. Füge 100 & mgr; l PNGase verdauen Puffer zu dem Filter und Zentrifuge bei 14.000 xg für 20 min bei 20 ° C. Sammeln Sie waschen alle verbleibenden N enthält -verknüpftem Glykan, in der gleichen Sammlung Fläschchen als Eluens. Zweimal wiederholen. Filter entfernen und in neuen Sammelgefäß. Inkubieren Glykan Proben in den Wert von -80 ° C Gefrierschrank bis gefroren (30-60 min). Trocken bis zur Fertigstellung, bei Raumtemperatur im Vakuum-Konzentrator (4-6 h). HINWEIS: N – Glycane können für bis zu sechs Monate vor der Derivatisierung bei -20 ° C gelagert werden. 4. Protein FASP Verdauung HINWEIS: Wenn die Analyse Proteomics oder Deamidierung Website nicht erwünscht ist, Abschnitt 4 des Protokolls übersprungen werden kann. Spülen ter filtern, die deamidiertes Peptide, mit 400 ul 8 M Harnstoffpuffer enthält. Verschließen Sie die Sammelgefäß und leicht Wirbel zu mischen. Konzentrieren sich auf dem Filter bei 14.000 xg für 15 min. Entsorgen Sie alle Flow-Through. Wiederholen Sie Schritt 4.1 zwei weitere Male für insgesamt drei Waschungen Harnstoffpuffer. Spülen Sie den Filter, die deamidiertes Peptide enthält, mit 400 ul 2 M Harnstoff, 10 mM CaCl 2 – Puffer (Trypsin zu verdauen Puffer). Verschließen Sie die Sammelgefäß und leicht Wirbel zu mischen. Konzentrieren sich auf dem Filter bei 14.000 xg für 15 min. Entsorgen Sie alle Flow-Through. Wiederholen Sie Schritt 4.1 zwei weitere Male für insgesamt drei Trypsin verdaut Pufferwäschen. Verwerfen Sammelgefäß einmal Waschungen sind abgeschlossen. Sammeln Sie alle zukünftigen Eluenten und Waschungen in einem neuen Sammelgefäß. Zugabe von 50 & mgr; l porcine modifizierten Trypsin in 1:50 oder 1: 5 Trypsin: Protein (w / w) -Verhältnis für Experimente Entdeckung oder quantitative Proteomik, respectively.Verschließen Sie die Sammelgefäß und leicht Wirbel zu mischen. Inkubieren Proben bei 37 ° C für 2 Stunden. Arbeiten schnell, entfernen Proben und Spike in weiteren 50 ul Trypsin am 01.50 oder 1: 5 Trypsin: Protein-Verhältnis. verwirbeln leicht die Proben für 1-2 Sekunden zu mischen. Inkubieren der Proben bei 50 ° C für weitere 2 Stunden. Eluieren der Peptide durch 15 min bei 14000 xg drehen. Spülen Sie die verbleibenden Peptide aus dem Filter mit 400 ul 1% Ameisensäure und 0,001% Zwitter 16.03 (Quench-Puffer). Eluieren den Filter aus, indem Sie für 15 Minuten bei 14.000 xg Spinnen. Quantifizierung der Peptid – Konzentration in den Proben von Bradford 19 oder BCA – Test 20. Inkubieren Peptidproben in der -80 ° C Gefrierschrank bis gefroren (30-60 min). Trocken bis zur Fertigstellung, bei Raumtemperatur im Vakuum-Konzentrator (4-6 h). HINWEIS: Getrocknete Peptide können für bis zu drei Monate bei -20 ° C gelagert werden. Resuspendieren tryptischen Proteine ​​unmittelbar vor dem LIQUId – Chromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) -Analyse in 2% Acetonitril, 98% H 2 O und 0,1% Ameisensäure (Eluent A) auf die gewünschte Konzentration. Tryptic Peptidkonzentrationen von 2,5 ul Plasma Bereich von 100 bis 300 ng / ul. 5. Die Derivatisierung von N -verknüpftem Glykane mit hydrophober Hydrazide Stichworte Rekonstituieren getrocknet schwere (SIL) oder Licht (NAT) P2GPN Reagenzien in 1 ml von 75:25 MeOH: Essigsäure (Derivatisierung Lösung), für eine Endkonzentration von 0,25 mg / ml. Die Reagenzien werden bis 10 Minuten dauern, bis vollständig löslich zu machen. Weitgehend Wirbel vollständige Auflösung zu gewährleisten. Hinweis: Bei dieser Derivatisierung Protokoll wird mit handelsüblichem N – Glycane verwendet, im Vergleich zu gereinigten Glycans, das molares Verhältnis von P2GPN: Glycan sollte etwa (und nicht weniger) als 17: 1. Tag getrocknet N – Glycane mit 200 ul (50 ug) von SIL oder NAT P2GPN Reagenz. Pipette nach oben und unten getrocknet Glykane zu suspendieren. Vortex samples und dann drehen, um Proben für ca. 5 sec auf einer Tischzentrifuge. Reagieren, um die Glycane mit dem Reagenz für 3 h bei 56 ° C. Unmittelbar bewegen Glykane aus dem Inkubator zu dem Vakuum-Konzentrator. Trocken bis zur Fertigstellung bei 55 ° C (3-5 h). Hinweis: Dieser Schritt löscht die Derivatisierungsreaktion; die Probe muß vollständig trocken sein Kreuzreaktivität in den nachfolgenden Stufen zu verhindern. HINWEIS: Getrocknete, markierte Proben können für bis zu sechs Monate bei -20 ° C gelagert werden. Resuspendieren tagged N – Glycane in 25-50 ul H 2 O kurz vor der LC-MS – Analyse. Pipette nach oben und unten N – Glycane sind vollständig löslich gemacht zu gewährleisten. HINWEIS: Die Lautstärke für Resuspension ist abhängig von der Anfangskonzentration von Glykoprotein, welches von der Ausgangsproteinkonzentration abgeschätzt werden kann. Allerdings wird die Reichweite pro Probentyp variieren und sollte individuell optimiert werden. Zentrifuge Proben bei 14000 × g für 5 min. Entfernen Sie die supernatant, wobei darauf geachtet, nicht zu lassen, die Spitze der Pipette den Boden des Zentrifugenröhrchen berühren. Hinweis: Überschüssige Tag kann für das Auge nicht sichtbar sein, sondern wird durch Zentrifugation reduziert werden. Kombinieren Sie ein Paar von NAT und SIL-Proben, wenn für die relative Quantifizierung gewünscht, in einem Verhältnis 1: 1 für die Tandem-Analyse. 6. Ultrahochdruck-Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie-Analyse HINWEIS: Die LC und MS – Bedingungen für eine einfache NLC-1000 beschrieben und einem Q Exactive Hochfeld wurden jeweils für Proteomanalyse im Haus optimiert und für Glykananalyse 21. Diese Bedingungen können zu anderen Ultrahoch druck- oder Nano- LC-Systeme und andere High-Auflösungsvermögen Massenspektrometern angepasst werden, sondern können leichte Modifikationen erforderlich. Die Verwendung von hohem Auflösungsvermögen Massenspektrometrie ist für Glykan Identifizierung und Analyse Desamidierung 22,23 erforderlich. Hinweis: Die Schritte 6,1-6,3 kann skipped wenn eine entsprechende Umkehrphasen-Chromatographie oder hydrophile Wechselwirkung kommerzielle Falle und Spalte verwendet werden. Synthetisieren einer Fritte in 100 uM ID Kapillare gemäß Meiring et al. 24 zur Verwendung als eine Falle. Packen Sie die Falle unter Druck mit 2,6 & mgr; M, 100 Å, C 18 Verpackungsmaterial und auf eine Länge von 5 cm. Packen Sie ein 75 & mgr; M ID Emitter – Säule unter Druck mit 2,6 & mgr; M, 100 Å, C 18 Verpackungsmaterial und auf eine Länge von 30 cm. Bereiten Sie zwei verschiedene LC-MS-Methoden für die Proteomik (6.4.1) und glycomics (6.4.2) Workflows. Hinweis: Protein und Glykan Proben können auf die gleiche Falle / Spalte Setup in beliebiger Reihenfolge ausgeführt werden. Für die Proteinanalyse, injizieren ~ 400 ng Protein auf die Säule in der mobilen Phase A (MPA). Führen Sie die Probe bei 300 nl / min, entsprechend Tabelle 1, mit einer 1 & mgr; l-Vorsäule Äquilibrierung (500 bar) und eine 5 & mgr; l Analysesäule Äquilibrierung(500 bar). Ionisieren Proteine ​​unter den MS vorgesehenen Bedingungen in Tabelle 2. Für Glykananalyse, injizieren 5 ul resuspendiert, getaggt P2GPN NAT / SIL äquimolare Proben auf die Säule. Führen Sie die Probe bei 300 nl / min, entsprechend der Tabelle 3 mit einem 2 & mgr; l-Vorsäule Äquilibrierung (500 bar) und eine 5 & mgr; l Analysesäule Äquilibrierung (500 bar). Ionisieren 4 vorgesehen Glykane unter den MS – Bedingungen in der Tabelle. Zeit % MPA % MPB 0 100 0 5 98 2 105 80 20 135 68 32 136 5 95 151 5 95 152 100 0 167 100 0 Tabelle 1 LC Bedingungen für Proteomanalyse. Eine Gradientenelution mit mobiler Phase B (MPB, 98% Acetonitril, 2% H 2 O, 0,1% Ameisensäure) wurde durchgeführt , Peptide für Schrotflinte Proteomik zu eluieren, datenabhängigen Erfassungs , MS-Experimente. MS 1 Parameter Massenbereich (Th) 375-1500 Lösung 120.000 AGC 1 × 10 6 Max Ionisationszeit 30 S-Lens FR Ebene 55 Kapillar-Temp (° C) 300 Spray Voltage 1,75 MS 2 Parameter Erfassungsart Top20 Lösung 15.000 AGC 1 × 10 5 Max Ionisationszeit 30 Underfill-Verhältnis 2% Isolation Fenster (Th) 1.4 Gebühr Staat Ausschluss +1 Normierte Kollisionsenergie 27 Ausschluss Zeit (s) 20 Tabelle 2: MS – Bedingungen für Proteomanalyse Die Parameter für Elektrospray – Ionisation, 1 MS Erwerb und MS 2 Erwerb in einem Orbitrap Instrument mit höherer Energie dissociatio.n (HCD) gegeben sind. Zeit % MPA % MPB 0 95 5 1 70 30 41 60 40 46 37 63 47 10 90 55 10 90 56 95 5 66 95 5 Tabelle 3:. LC Bedingungen für Glykananalyse Eine Gradientenelution wurde durchgeführt , zu eluieren Hydrazid markiert N für MS – Analyse – Glycane. <tr> MS 1 Parameter Massenbereich (Th) 600-1900 Lösung 60.000 AGC 5 × 10 5 Max Ionisationszeit 64 S-Lens FR Ebene 65 Kapillar-Temp (° C) 325 Spray Voltage 1,75 MS 2 Parameter Erfassungsart top12 Lösung 15.000 AGC 5 × 10 4 Max Ionisationszeit 100 Underfill-Verhältnis 1% Isolation Fenster (Th) 1.4 Feste Primiz </td> 125 Gestufte Normalized Kollisionsenergie 10/20/30 Ausschlusszeit (sec) 15 Tabelle 4: MS – Bedingungen für Hydrazid markiert N – Glycan – Analyse Die Parameter für Elektrospray – Ionisation, MS 1 Erwerb und MS 2 Erwerb in einem Orbitrap Instrument mit höherer Energie Dissoziation (HCD) gegeben sind.. 7. Proteomics und Deamidierung Analyse Identifizieren Proteine ​​/ Peptide unter Verwendung von Standard Bioinformatik Suchmaschinen. Hinweis: Die folgende Analyse-Protokoll wurde entwickelt, um die Swiss-Prot / TrEMBL Datenbanken in UniProtKB mit und über SEQUEST in der Proteome Discoverer 1.4 Software suchen, jedoch kann das Protokoll kann auf jedes Protein Suche und Scoring-Engine mit einer GUI-Software direkt übersetzt. Alle unten angegebenen Befehle können in der Software-Schnittstellen, über Drop-Down-Menüs zugegriffen werden. <li> Erstellen oder einen Organismus entsprechende Proteinsequenz – Datenbank von genomischen Daten oder zur Verfügung Proteom Datenbanken herunterladen , wie von Apweiler et al. 25 Hinweis: Gemeinsame Proteom-Datenbanken umfassen Swiss-Prot, TrEMBL und NCBI, kann aber auch aus der eigenen Daten aufgebaut werden. Innerhalb der Software, eine Datenbank – Suchmaschine und wählen Parameter wählen , je nach der Qualität der gewonnenen Daten und die Rigorosität der Suche gewünscht wird , wie von Perkins al et. für MASCOT 26 oder Eng et al. für SEQUEST 27. Für High-Massengenauigkeit Daten, Parameter für die Suche in der Software wie folgt: max 2 verpassten cleavages 5 ppm Vorläufer Massentoleranz und 0,02 Da Fragment Massentoleranz (für optimierte genaue Desamidierung Erkennung 22) und umfassen die folgenden tryptischen Peptidmodifikationen : "carbamidomethyl (C)" statische Modifikation und "Desamidierung (N / Q)" und "Ochse"mit 18 O Verdauung Etikettierung umfassen dynamische Änderungen. Wenn" Desamidierung 18 O (1) "als zusätzliche dynamische Modifikation dierung (M). Suchen, unter Verwendung der ausgewählten Motor, die rohen Peptid Daten gegen das Protein-Datenbank (7.1.1). Hinweis: Massentoleranzen sollten für das Instrument verwendet und nicht willkürlich niedrig angebracht. Hinweis: Die Suchfunktion abgeschlossen wird automatisch durch die Software verschiedene Suchmaschinen-spezifischen Algorithmen. Der percolator Algorithmus (MASCOT), SEQUEST oder andere Kombinationen von Algorithmen verwendet werden Proteine ​​aus Peptide zu identifizieren und die Gültigkeit der Treffer zu landen; Weitere Informationen zu den verfügbaren Tools sind in einer Bewertung von Gonzalez-Galarza et al bedeckt. 28,29. Je nach Software können zusätzliche Suchparameter müssen nach dem Ermessen des Anwenders ausgewählt werden. Exportieren Sie die identifizierten Peptide für die manuelle Kuration und further Analyse. Eine Liste von Peptiden ein identifiziertes Deamidierung am Asparagin des N -verknüpften Glykosylierungsmotivpeptide (NX (S / T), wobei X ≠ P) enthält , manuell kuratieren. Kreuz validieren diese Seiten mit bekannten Glykosylierung Motive aus der Literatur und schaffen zwei Pools von Ergebnissen (validiert und Theorie). Verwenden 30 spektralen Zählen der prozentualen Belegung eines gegebenen Glycosylierungsstelle zu vergleichen , indem die Fülle von deamidierten und nicht-deamidierten Formen zu vergleichen. 8. Glycan Relative Quantifizierung Hinweis: Die folgende Identifizierung und Quantifizierung wurde die XCalibur Software abgeschlossen werden. jede Software jedoch die Rohdaten analysiert und integriert sich automatisch chromatographischen Peaks substituiert sein kann. Generieren Sie eine theoretische Liste von Glycan Zusammensetzungen aus den biologisch möglichen Kombinationen von Hexosen, Desoxy-Hexosen, hexosaminen, Sialinsäure und andere saccharides. Zu diesem Zweck wurde eine menschliche Glykan Datenbank durch Walker veröffentlicht et al. 15 und kann wie sie ist verwendet werden. Für theoretische Datenbanken, artspezifischen biologischen Einschränkungen müssen auf dem kombinatorischen Raum auferlegt werden, und diese Regeln beschrieben werden von Kronewitter et al. 31. Berechnen Sie die Glykan monoisotopisch Massen (M) von den Atommassen für jede Zusammensetzung für die Protonenladungszustände + 1-3. Ändern Sie die monoisotopisch Massen die Zugabe des NAT zu umfassen (254,14191 g / mol) oder SIL (260,162042 g / mol) P2GPN-Tag. Öffnen Sie die "Verarbeitung Setup" aus der Roadmap Blick in XCalibur. Richten Sie wie genau ein Verarbeitungsverfahren in das ergänzende Material von Walker et al. 15 die Liste in Schritt erzeugt mit 8.2 die theoretischen monoisotopisch Massen für die [M + H] 1+ enthält, [M + 2H] 2+ und [ M + 3H] 3+ Arten. Hinweis: Um Glykan Identität jenseits genaue bestätigenMasse, für NAT / SIL läuft beidseitig bedruckt, überprüfen Sie, dass NAT und SIL N – Glycan Paare koeluieren mit der gleichen Retentionszeit. Qualitativ Quer validieren Identifikationen mit der MS 2 – Spektren, die 32 Spitzen Zugehörigkeit zur Oxoniumions Serie enthalten. Exportieren Sie die integrierte, extrahiert Ionenchromatogramms (XIC) Bereiche zu Excel die SIL und NAT Abundanzen zu erhalten , wie genau in das ergänzende Material von Walker et al. 15 In Excel Programm die Zellen in einer neuen Spalte die Korrektur für das Molekulargewicht Überlappung zu berechnen , indem die SIL Fülle Anpassung gemäß der Gleichung veröffentlicht von Walker et al 1 . 5: . wobei A die monoisotopischen peak und der theoretischen Isotopenüberlappungs, Unabhängig je Zusammensetzung berechnet werden. In einer zweiten Spalte, die Zellen Programm die NAT und SIL – Kanäle unter Verwendung der Gleichung für die Gesamt normalisierten Glykan factor (TGNF) pro Spektrum zu normalisieren, wie von Walker et al beschrieben 1 . 5: . wobei N die Anzahl der N – Glycane über der Bestimmungsgrenze liegt. In einer neuen Spalte Programm die Zellen das Verhältnis von SIL zu nehmen: NAT Glykane (oder umgekehrt), um den Fold-Konzentrationsänderung zwischen den beiden Proben zu berechnen.

Representative Results

Abb . 1: Das Schema des FANGS-P2GPN hydrophobe Tagging gekoppelt Verfahren (Verfahren A) für den kombinierten Proteomik und glycomics Analyse gegeben Schritte, die zwischen glycomics-only Verarbeitung und Tandem – glycomics und Proteomanalyse, mit Glykosylierungsstelle Identifizierung unterscheiden, werden hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Die in-line Proteomik und glycomics, filterbasierte P2GPN hydrophoben Markierungsverfahren (Verfahren A) wurde zur Identifizierung validiert, Quantifizierung und das Molekulargewicht unter Verwendung von gepoolten Bias hen Plasmaproben (Abbildung 1). Für nur glycomics Experimente, inter-Vergleiche in den Häufigkeiten von N – Glycane durch das Verfahren extrahiertA bis carbograph SPE (Gold-Standard, Methode B) hergestellt (Abbildung 2). Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Abundanz von Glycanen zwischen den beiden Methoden. NAT-Verhältnis von Glycanen mit dem gleichen Verfahren extrahiert: Die intra-Variabilität wurde auch durch Quantifizieren der SIL beurteilt. Die log 2 -distributions beider Methoden waren Gaussian, zentriert auf Null, und nicht signifikant unterschiedlich (3A-B). Das Molekulargewicht liegt im Bereich zwischen den beiden Protokollen vollständig überlappt, was darauf hindeutet , dass der Filter nicht die N – Glycane auf Basis von Molekulargewichtsbereich und Hydrophilie (Figur 4) hat diskriminieren. Figur 2: Eine äquimolare Mischung von NAT und SIL N – Glycane nach Methode A oder Methode B extrahiert wurde , von 2,5 & mgr; l von Hühnerplasma (N = 4) Die Proben wurden Anal.yzed durch UPLC-MS entsprechend den empfohlenen Parameter in Abschnitt vorgeschlagen 6. Die Häufigkeiten für jede Glycan, in jedem NAT / SIL Kanal, wurden durch Integrieren der Fläche unter der extrahierte Ionenchromatogramm (MMA = 3 ppm) berechnet, für die molekulare Korrektur Gewicht Überlappung und durch Einstellen der TGNF. Diese Verhältnisse werden mit ihren Standardfehler dargestellt. Die Häufigkeiten von Methode B: Methode A N – Glycane waren nicht signifikant unterschiedlich (p> 0,05). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3: Die intra-Variabilität in der (A) Verfahren A (N = 133) oder (B) Verfahren B (N = 123) Strategien verglichen. NAT und SIL äquimolaren Mischungen aus N – Glycane aus dem gleichen ExtraktionsschemaWurden über drei technische Replikate analysiert. Die log 2 -distributions wurden auf Null zentriert und unterschied sich nicht signifikant zwischen den beiden Workflows. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 4: Die Molekulargewichtsbereiche von Glykane von jeder Strategie wurden verglichen. Die beiden Workflows ergab Glykane das gleiche Molekulargewichtsbereich überspannen. N in einem Protokoll erfasst Glycane im Vergleich zu den anderen gerade über der Nachweisgrenze (1 × 10 5 Fülle) fiel und spiegeln nicht systematische Verzerrung. Bitte klicken Sie hier um ein , um zu vergrößern Version dieser Figur. <p class="jove_content" fo:keep-together.innerhalb-page = "1"> Beibehaltung der deglycosylierten Proteine ​​durch das Molekularfiltergewicht in-line Proteom weite Analyse und Glykosylierungsstelle Identifizierung aktiviert. Mehrere Protokolle zur kombinierten Reinigung von Glycanen und Proteine ​​wurden ohne Deglykosylierung zu einem traditionellen FASP Zubereitung verglichen (Tabelle 5). Unsere typischen 18 Stunden Filter basierend PNGase F-Verdau, gefolgt von FASP Trypsin-Verdau (Std protocol) führte zu signifikanten Mengen an unspezifischer Desamidierung, die mit der Identifizierung von glycosites stören können. Daher ist ein Verfahren mit einer kürzeren Inkubationszeit bei erhöhter Temperatur (50 ° C) und einer PNGase F spike in Schritt (SPI-Protokoll) wurde als Alternative untersucht die Verwendung zusammen mit einem Mikrowellen Verdau Protokoll (MD-Protokoll), zu minimieren nicht spezifische Desamidierung. Die Glykane in den neuen Aufschlussverfahren beobachtet wurden, waren nicht signifikant verschieden in Zusammensetzungen oder Abundanz von der Standard-18 h, 37 ° C Filter PNGase F-Digest ( <strong> Abbildung 5). In Kombination mit einer kurzen Trypsin Inkubation wurde unspezifische Desamidierung deutlich reduziert, mit einem falsch – positiven Rate für glycosites <5% (Tabelle 5). Proteine Peptides deamidiertes Peptides Glycosites Glykoproteine + – + – + – + – + – FASP <td colspan="2"> 249 3083 795 5 5 18hr 217 304 6013 5086 1029 733 257 24 112 18 MD 270 266 5190 5125 465 455 254 8 102 7 SPI 281 288 4729 4482 602 573 232 10 145 8 . Tabelle 5: Vergleich der Proteom – Daten von einem Standard – Trypsin verdaut gegenüber der in-line FANGS-P2GPN Tagging – Verfahren hergestellt wurden Präparationen wurden durchgeführt (+) und ohne (-) PNGase F Hintergrund Raten von unspezifischen Desamidierung und Schätzung zu bestimmen , glycosite falsch positiven Raten. Die Proteine ​​wurden mit 1% falsch Discovery Rate (FDR) identifiziert; Peptide wurden in Proteome Discoverer 1.4 basierend auf "hoch" Peptid Vertrauen gefiltert (q <0,01); glycosites wurden identified basierend auf einzigartige Sequenzen Desamidierung der konservierten Glykosylierungsmotivpeptide (NXS / T) enthält; und Glycoproteine ​​wurden als identifizierte Proteine ​​definiert mindestens einen identifizierten glycosite enthält. Abbildung 5: Verkürztes Protokolle für Glycane wurden Desaminierung in den Proben zu minimieren , entwickelt und im Vergleich zu den 18 h FANGS PNGase F – Verdau. Die mittleren Unterschiede in der Abundanz waren 10% und 5% für die MD (2.2.3) und SPI (2.2.2) -Protokolle, respectively. Von den 48 Glykane identifiziert, angezeigt 90% weniger als das 1,5-fache Variation. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

High-throughput quantitative methods are needed to facilitate routine glycan analysis. For the last thirty years, glycomics analysis has been limited to a subset of research groups, despite its importance in disease, clinical applications, and pharmaceuticals. The FANGS-P2GPN purification and tagging method for glycomics and proteomics performs the same analysis on a single aliquot of sample, reducing the cost of supplies and the amount of material needed (particularly important in human and mouse studies). Furthermore, efforts to minimize variability in preparations are critically important, as every additional step contributes to error, potentially masking important but low-abundant changes in case-control studies. Coupling of FANGS to hydrophobic hydrazide tagging allows protein and glycan samples to be run on the same RPLC column, enhances glycan ionization, provides for relative quantification, and can be quantitatively applied to plasma.

For N-glycan analysis, it is critical to use the suggested level of PNGase F to achieve full de-glycosylation. Though glycans are solvent exposed, denaturation of proteins and excess enzyme help ensure efficient and complete cleavage. For accurate quantitation of the glycans, it is necessary to ensure that they are completely dried after derivatization to quench the reaction and prevent cross-reactions when mixing the NAT and SIL species. Finally, when extending the workflow to glycosite analysis, timing of the steps is critical to minimize non-specific deamidation. The modified protocols provided for combined glycomics and proteomics analysis work consistently when performed accordingly.

The workflow achieves accurate relative quantitation of N-glycans from plasma compared to the gold-standard, SPE method. There is no apparent bias in the types of glycans extracted in terms of molecular weight, hydrophilicity, and compositional structure. Though we have not explored the qualitative analysis of O-linked glycans, we expect that FANGS could accommodate the addition of a β-elimination step post-PNGase F digestion of N-linked glycans. However, procedures would require significant modification for reagent cleanup prior to mass spectrometry, and peptide analysis will be significantly impacted. For proteomics, the same depth of proteome coverage is achieved compared to traditional FASP methods. Importantly, methods achieve a minimal false discovery rate for N-glycan deamidation. While the method is compatible with 18O labeling of Asn during the PNGase digestion step22,23, the low glycosylation site false discovery rate suggests that it may not be necessary, further reducing costs and complexity.

The proteome is not enriched for glycoproteins in this method, which has both advantages and disadvantages. Certain low abundant glycoproteins may not be detected in the analysis. However, the occupancy of glycosylated sites per protein, can be compared between biological samples. Additionally, the error and bias introduced from lectin affinity purification or chemical enrichment is eliminated. In conclusion, coupling of FANGS to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy results in a simplified, quantitative, high-throughput method for the tandem analysis of the glycome and proteome with great potential for application in clinical case-control studies.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was generously funded by the NIH NCI IMAT Program Grant R33 (CA147988-02), the NIH NIGMS Graduate Training in Molecular Biotechnology at NC State Grant (T32GM008776), the US Dept. of Education GAANN Fellowship Program in Molecular Biotechnology at NC State Grant (P200A140020), the W.M. Keck Foundation, and North Carolina State University. Hen plasma was obtained with the assistance of Dr. James N. Petitte and Rebecca Wysocky in the NC State University Dept. of Poultry Science.

Materials

Acetic Acid (50%):  Sigma Aldrich  45754
Acetonitrile, HPLC grade Burdick & Jackson  AH015-4
Ammonium Bicarbonate Sigma Aldrich  A6141
Bradford Reagent Sigma Aldrich  B6916 Alternative: Bicinchoninic acid kit (Sigma Aldrich BCA1)
Calcium chloride Sigma Aldrich  C1016
Centrifuge Eppendorf 5804 R Alternate centrifuges that reach 14,000 x g are suitable
DL-Dithiothreitol, 1M in solution Sigma Aldrich  646563
Easy-nLC 1000 Thermo Scientific LC120 Alternate nano or ultra high pressure LCs will produce similar data, such as: 1. Dionex UltiMateÒ 3000 LC (Thermo Scientific) 2. Acquity UPLC (Waters)
Floating Tube Rack TedPella 20831-20
Fetuin New England Biolabs  P6042S
Fisher Scientific Isotemp Standard Lab Ovens Fisher Scientific 11-690-625F Alternate incubators that reach 56 °C are suitable
Formic Acid Sigma Aldrich  56302
GE Microwave Oven General Electric 57B5 E82904 Any microwave with adjustable power settings is suitable
INLIGHT Glycan Tagging Kit  Cambridge Isotope Laboratories GTK-1000 The INLIGHT kit provides NAT and SIL versions of the P2GPN reagent.
Iodoacetamide Sigma Aldrich  A3221
Kinetix 2.6 mM, 100 Å, C18 bulk stationary phase Phenomenex  Bulk Media Alternative: Any C18 stationary phase £ 5 mM 
Mascot Daemon Software and Server Matrix Science Alternative: Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific)
Methanol, HPLC grade Burdick & Jackson  AH230-4
PicoFrit Self-Pack Column: 360 um, OD 75um ID, 15 um tip, non-coated, 5 per box, 50 cm New Objective 1 5 PF360-75-15-N-5
PNGase F (glycerol-free), 75,000 units/ml New England BioLabs  P0705L
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer Thermo Scientific Alternate high mass accuracy (£ 5 ppm) mass spectrometers will provide similar data
RNase B New England Biolabs  P7817S
Trypsin from Porcine Pancreas Sigma Aldrich  T6567-5X
Urea Sigma Aldrich  51456
Vacuum ConcentratorSavant SPD131DDA SpeedVac Concentrator Thermo Scientific SPD131DDA Alternate vacuum concentrators are suitable
Vivacon 500 30 kDa Filters  Sartorius Stedim Biotech VN01H22 Alternative: Amicon Ultra 0.5 Centrifugal Filter Units with Ultracel-10 kDa Membrane (Millipore UFC501096)
Water, HPLC grade Burdick & Jackson  AH365-4
Water, 18O Cambridge Isotope Laboratories OLM-240-97-1 The addition of 18O in the PNGase F digest step is optional and may not be necessary for deamidation studies completed with 95% confidence
Xcalibur 2.0 Thermo Scientific XCALIBUR20
Zwittergent Test Kit Merck Millipore 693030
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Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy. J. Vis. Exp. (109), e53735, doi:10.3791/53735 (2016).
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