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Chemistry

A Quantitative Glycomics et protéomique Stratégie Purification Combined

Published: March 08, 2016
doi:
10.3791/53735
, ,
1Department of Chemistry,North Carolina State University

Summary

A high-throughput protocol was developed for combined proteomics and glycomics purification and LC-MS/MS quantification in plasma. Deamidation analysis of N-linked glycosylation motifs was specific to deglycosylated sites. Accurate quantitation of N-glycans was achieved by coupling filter aided N-glycan separation to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy.

Abstract

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define pathways, improve treatment, understand disease, and aid biomarker discovery. N-linked glycosylation is one of the most important and robust post-translational modifications on proteins and regulates critical cell functions such as signaling, adhesion, and enzymatic function. Analytical techniques to purify and analyze N-glycans have remained relatively static over the last decade. While accurate and effective, they commonly require significant expertise and resources. Though some high-throughput purification schemes have been developed, they have yet to find widespread adoption and often rely on the enrichment of glycopeptides. One promising method, developed by Thomas-Oates et al., filter aided N-glycan separation (FANGS), was qualitatively demonstrated on tissues. Herein, we adapted FANGS to plasma and coupled it to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy in order to achieve accurate relative quantification by liquid chromatography mass spectrometry and enhanced electrospray ionization. Furthermore, we designed new functionality to the protocol by achieving tandem, shotgun proteomics and glycosylation site analysis on hen plasma. We showed that N-glycans purified on filter and derivatized by hydrophobic hydrazide tags were comparable in terms of abundance and class to those by solid phase extraction (SPE); the latter is considered a gold standard in the field. Importantly, the variability in the two protocols was not statistically different. Proteomic data that was collected in-line with glycomic data had the same depth compared to a standard trypsin digest. Peptide deamidation is minimized in the protocol, limiting non-specific deamidation detected at glycosylation motifs. This allowed for direct glycosylation site analysis, though the protocol can accommodate 18O site labeling as well. Overall, we demonstrated a new in-line high-throughput, unbiased, filter based protocol for quantitative glycomics and proteomics analysis.

Introduction

Dans le domaine de la protéomique, filtre aidé la préparation de l' échantillon (FASP) a été largement adopté pour sa capacité à réduire la quantité de matériau de départ, diminuer l' échantillon des artefacts de préparation, et de maximiser le débit d' échantillons 1. Cependant, une telle méthode n'a pas encore d'émerger et de gagner du terrain pour le domaine de la glycomique. Développement de haut débit, les flux quantitatifs sont nécessaires en raison du rôle essentiel de la glycosylation dans la défense biologique et sa modulation par le cancer ou les maladies 2,3. Chez les mammifères, N -glycans sont composées de motifs répétitifs saccharides (hexoses (Hex), hexosamines (HexNAc), acides sialique (NeuAc), et fucoses (Fuc)), qui décorent une structure de noyau (Hex 3 HexNAc 2) 4 à liaison covalente asparagine. Bien que le glycospace est considérablement élevée lorsque les isomères sont comptés (> 10 12), il est tout à fait petite sur une base de la composition et les poids moléculaires varient généralement de 1,000-8,000 Da 5 </ Sup>. L'homogénéité de la composition de la classe et l'hydrophilie de glycanes posent des défis uniques pour la purification, la séparation et la spectrométrie de masse (MS) workflows 6.

Traditionnellement, N -glycans sont digérées à partir des protéines ou des peptides par le peptide N -glycosidase F (PNGase F), puis enrichi par chromatographie d'affinité sur lectine 7, capturé par des billes 8 hydrazide ou purifiés par extraction en phase solide (SPE) 9,10. Bien que ces méthodes sont très efficaces, ils introduisent des étapes supplémentaires pour le dessalage et de limiter le nombre d'échantillons traités simultanément. Au cours de la dernière décennie, un certain nombre de plates-formes à haut débit pour glycomique ont été proposées. Kim et al. , Publié un procédé semi-automatisé à l' aide, d' une plaque SPE de 96 puits à commande par aspiration 11. Alternativement, une méthode d' affinité-filtre (N -glyco-FASP) a été développé par le groupe Mann, qui a nécessité la dérivation initiale de la filtre avec un composite de lectines 12. Enfin, le groupe Thomas-Oates a proposé une méthode semi-quantitative, le filtre Aided N Séparation -Glycan (FANGS), qui exploitait la taille étroite de composition du glycospace 13. En se fondant sur ​​les filtres coupe-off poids moléculaire, de petits contaminants ont d' abord été lavés à perdre et ensuite les -glycans N ont été digérés et élues. protéines déglycosylée restent sur le filtre dans ce protocole et peuvent être soumis à FASP en ligne.

Identification et quantification des glycanes par ionisation électrospray (ESI) MS exige des séparations hors ligne pour (partielle) la résolution des isomères et dérivatisation pour la détection d'espèces à faible abondance. Marquer l'individualité quand la normalisation avec la stratégie de balises hydrazide glycanes confère une compatibilité avec la chromatographie liquide en phase inverse (RECH) 14,15. Le 4-phénéthyl-benzohydrazide (P2PGN) tag hydrophobe médie l'hydrophilie des glycanes, enhFINANCEZ ionisation par, en moyenne, quatre fois 16. Bien que d' autres techniques, telles que perméthylation ou 17 chimies de marquage amine réactive 18, présentent des avantages similaires hydrazide dans la réaction, on fait réagir glycanes 1: 1 stoechiométriquement dans des conditions faciles. Quantification relative est obtenue par l' analyse en tandem d'échantillons dérivés avec native (NAT) ou 13 C 6 étiquettes stabile isotopiques (SIL).

La méthode suivante évolue FANGS pour les applications de plasma et les couples à l'étiquette hydrophobe P2GPN pour la quantification relative précise. En outre, il a été conçu pour effectuer la protéomique shot-gun, désamidation profilage, et glycomique quantitatives sur une seule aliquote de l'échantillon, sans compromettre l'intégrité des analyses.

Protocol

1. Les protéines et glycoprotéines Dénaturation et Alkylation Pour les préparations standard, charge 2,5 ul d'une / solution ul de 0,1 ug de glycoprotéine (par exemple Fetuin ou RNase B) sur une 30 kDa ou 10 kDa de poids moléculaire (MW) de coupure du filtre. Pour les échantillons de plasma biologiques, vérifier la concentration de protéine par un dosage 20 (BCA) protéine acide de référence Bradford 19 ou bicinchoninique. On dilue le plasma, le cas échéant, avec mM de bicarbonate d'ammonium 100 (NH 4 HCO 3) dans H2O (PNGase Digest tampon) à un pH de ~ 7 à contenir entre 10 à 100 mg / ml de protéine totale. Charge 2,5 pi de plasma (25 à 250 ug de protéine) sur un filtre. Remarque: Ce protocole a été testé sur le plasma à partir d'échantillons de sang prélevés en présence d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Ajouter 2 ul de dithiothreitol 1 M de solution (TNT) à chaque échantillon dans le filtre. Diluer l'échantillon avec 200 ul de tampon de digestion PNGase. Boucher le tube d'échantillon de filtre et légèrement vortex, en faisant attention à ne pas perturber le filtre de son siège. Incuber l'échantillon à 56 ° C pendant 30 min pour dénaturer les protéines et glycoprotéines. Pour alkyler des échantillons, ajouter 50 pi de 1 M iodoacétamide, pour obtenir une concentration finale de ~ 200 mM et on incube à 37 ° C pendant 60 min. NOTE: Si l'analyse protéomique est pas souhaitée, l'étape 1.5 peut être ignorée. Concentrer la glycoprotéine dénaturée sur le filtre par centrifugation des échantillons à 14000 xg pendant 40 min. Jeter circuler à travers. 2. N Glycan lié en digestion enzymatique Laver l'échantillon avec 100 pi PNGase tampon de digestion. Concentrer la glycoprotéine sur le filtre à 14.000 xg pendant 20 minutes et jeter circuler à travers. Répéter l'étape de lavage et concentré deux fois, pour un total de trois fois, ce qui donne un concentré dans le volume mort de filtre (~ 5 pi). Jetez touss'écouler à travers. Jeter collection flacon une fois les lavages sont complets. Collecter toutes les éluants et lavages à venir dans une nouvelle collection flacon. NOTE: PNGase digest tampon dans H 2 18 O peut être utilisé lors de l'étape de digestion PNGase F pour stable marquage isotopique des sites asparagine de-glycosylée, qui deviennent chimiquement désamidée. Ajouter 2 pl de libre glycérol-PNGase F (75.000 x unités / ml) pour filtrer après avoir transféré dans une collection flacon frais. Ajouter 98 pi de PNGase digérer tampon, ce qui porte le volume total à 100 pi, et doucement pipeter de haut en bas sur le filtre pour mélanger. digérer enzymatiquement les glycanes dans les conditions des étapes 2.2.1, 2.2.2, 2.2.3 OU. REMARQUE: Trois méthodes pour la déglycosylation de protéines peuvent être utilisées. Pour l'analyse uniquement des glycomique (pas de protéomique), la longue période d'incubation à l'étape 2.2.1 est recommandée. Pour glycomique et en protéomique, les étapes 2.2.2 et 2.2.3 produira des peptides de haute qualité avec un minimum de non-spdésamidation écifiques. Glycomics-seulement le protocole de digestion (de 18hr): Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 18 heures pour cliver enzymatiquement tous N -glycans. De Spike dans le protocole de digestion (SPI): Incuber les échantillons à 50 ° C pendant 2 heures. En travaillant rapidement, prélever des échantillons et pic dans un 2 pl supplémentaire de libre glycérol-PNGase F (75.000 x unités / ml). vortex légèrement les échantillons pour 1-2 sec pour mélanger. Incuber les échantillons à 50 ° C pendant 2 heures supplémentaires. Micro-ondes protocole de digestion (MD): Placer les échantillons dans un rack tube de microcentrifugation flottant. Des échantillons de flotteur dans un bécher de 1 L remplis de 1 L d'eau désionisée (DI). Placer le bêcher dans le centre d'un four à micro-ondes (950 W) avec une plaque tournante. Micro-ondes à puissance de 60% (570 W) pendant 5 min. Pour refroidir, prélever des échantillons et maintenir à température ambiante pendant 2 min. Ensuite, micro-ondes pendant 5 min de plus à 60% de puissance. REMARQUE: les paramètres d'alimentation à micro-ondes doivent être ajustées en fonction de la puissance de sortie maximale du micro-ondes.Puissance moyenne devrait être maintenue constante entre les modèles. 3. Elution de la N -glycans Eluer glycanes par centrifugation de l'échantillon à 14.000 xg pendant 20 min à 20 ° C. Ajouter 100 pi de PNGase digérer tampon au filtre et centrifuger à 14 000 xg pendant 20 min à 20 ° C. Collecter lavage contenant tout en restant N glycane lié en , dans la même collection flacon comme éluant. Répéter deux fois. Supprimer le filtre et le placer dans la nouvelle collection flacon. Incuber échantillons glycanes dans le -80 ° C congélateur jusqu'à congélation (30-60 min). Sec jusqu'à la fin, à la température ambiante, dans un concentrateur à vide (4-6 heures). NOTE: N -glycans peuvent être conservés à -20 ° C pendant jusqu'à six mois avant dérivatisation. 4. Protein FASP Digestion NOTE: Si la protéomique ou l'analyse du site de désamidation est pas souhaitée, l'article 4 du protocole peut être ignoré. Rincer til filtre, contenant les peptides désamidée, avec 400 pi de tampon 8 M d'urée. Boucher le flacon de collecte et légèrement vortex pour mélanger. Concentrez-vous sur le filtre à 14.000 xg pendant 15 min. Jeter tout écoulement. Répétez l'étape 4.1 deux fois supplémentaires, pour un total de trois lavages de tampon d'urée. Rincez le filtre, contenant les peptides désamidée, avec 400 ul de 2 M d' urée, mM CaCl tampon 10 2 (trypsine tampon de digestion). Boucher le flacon de collecte et légèrement vortex pour mélanger. Concentrez-vous sur le filtre à 14.000 xg pendant 15 min. Jeter tout écoulement. Répétez l'étape 4.1 deux fois supplémentaires, pour un total de trois trypsine digérer lavages de tampon. Jeter collection flacon une fois les lavages sont complets. Collecter toutes les éluants et lavages à venir dans une nouvelle collection flacon. Ajouter 50 ul de trypsine porcine modifiée dans une 1:50 ou 1: 5 trypsine: protéine (p / p), respectivement, le rapport des expériences de découverte ou protéomiques quantitatives.Boucher le flacon de collecte et légèrement vortex pour mélanger. Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 2 heures. En travaillant rapidement, prélever des échantillons et pic dans un 50 pi supplémentaires de trypsine à 1:50 ou 1: taux de protéines: 5 trypsine. vortex légèrement les échantillons pour 1-2 sec pour mélanger. Incuber les échantillons à 50 ° C pendant 2 heures supplémentaires. Éluer les peptides par centrifugation à 14 000 xg pendant 15 min. Rincer les peptides restants du filtre avec de l'acide formique, 400 ul de 1% et 0,001% Zwittergent 3-16 (tampon de trempe). Éluer le filtre par centrifugation à 14 000 xg pendant 15 min. Quantifier la concentration du peptide dans les échantillons par Bradford 19 ou 20 BCA. Incuber les échantillons peptidiques dans le congélateur à -80 ° C jusqu'à congélation (30-60 min). Sec jusqu'à la fin, à la température ambiante, dans un concentrateur à vide (4-6 heures). NOTE: Dried peptides peuvent être conservés à -20 ° C pendant jusqu'à trois mois. Resuspendre protéines tryptiques juste avant Liquid chromatographie-spectrométrie de masse (LC-MS) analyse 2% d' acétonitrile, 98% H 2 O, et de l' acide formique à 0,1% (phase mobile A) à la concentration souhaitée. concentrations de peptides tryptiques de la gamme de plasma de 2,5 ul 100-300 ng / ul. 5. dérivatisation de N lié en glycanes avec Hydrophobes hydrazide Balises Reconstituer lourds (SIL) ou de la lumière (NAT) des réactifs secs P2GPN dans 1 ml de MeOH 75:25: acide acétique (solution de dérivatisation), pour une concentration finale de 0,25 mg / ml. Réactifs vont prendre jusqu'à 10 min pour solubiliser complètement. Intensivement vortex pour garantir une solubilisation complète. Remarque: Dans le cas où ce protocole de dérivatisation est utilisé avec -glycans N standard, par rapport glycanes purifiés, le rapport molaire de P2GPN: glycane doit être d' environ (et non inférieure) à 17: 1. Tag séchée N -glycans avec 200 ul (50 ug) de SIL ou NAT P2GPN réactif. Pipeter haut et bas pour resuspendre glycanes séchées. Vortex samples puis décélèrent échantillons pour ~ 5 sec dans une centrifugeuse de paillasse. Réagir glycanes avec le réactif pendant 3 heures à 56 ° C. Déplacer immédiatement glycanes de l'incubateur au concentrateur à vide. Sec à l'achèvement à 55 ° C (3-5 heures). REMARQUE: Cette étape désaltère la réaction de dérivatisation; l'échantillon doit être complètement sec pour éviter une réactivité croisée dans les étapes suivantes. NOTE: Les échantillons séchés, étiquetés peuvent être conservés à -20 ° C pendant jusqu'à six mois. Remettre en suspension tagged N -glycans dans 25-50 ul de H 2 O juste avant l'analyse LC-MS. Pipeter haut et en bas pour assurer N -glycans sont entièrement solubilisé. NOTE: Le volume pour la remise en suspension dépend de la concentration de départ de la glycoprotéine, qui peut être estimée à partir de la concentration en protéines de départ. Cependant, la gamme va varier selon le type d'échantillon et doit être optimisé individuellement. Centrifuger les échantillons à 14000 xg pendant 5 min. Retirez le Supernatant, en faisant attention de ne pas laisser la pointe de la pipette toucher le fond du tube de centrifugation. Remarque: L'excès de tag peut ne pas être visible à l'oeil, mais sera réduite par centrifugation. Combiner une paire d'échantillons de NAT et SIL, le cas échéant, pour la quantification relative, dans un rapport de 1: 1 pour une analyse en tandem. 6. Ultra-haute pression chromatographie en phase liquide et analyse de spectrométrie de masse NOTE: Le LC et MS conditions décrites pour un Easy NLC-1000 et un haut champ Q Exactive, respectivement, ont été optimisés en interne pour l' analyse protéomique et pour l' analyse des glycanes 21. Ces conditions peuvent être adaptées à d'autres systèmes LC pression ou nano- ultra-haute et d'autres spectromètres de masse à haute résolution de puissance, mais peuvent nécessiter de légères modifications. L'utilisation de la résolution élevée de spectrométrie de masse de puissance est nécessaire pour l' identification et l' analyse des glycanes de désamidation 22,23. REMARQUE: Les étapes 6.1-6.3 peuvent être skipped si une chromatographie en phase inverse appropriée ou une interaction hydrophile piège commercial et de la colonne sont utilisés. Synthétiser une fritte à 100 uM ID capillaire selon l' une Meiring et al. , 24 destiné à être utilisé en tant que piège. Emballez le piège sous pression avec 2,6 uM, 100 Å, C 18 matériau d'emballage et coupé à une longueur de 5 cm. Emballez une colonne ID d'émetteur 75 uM sous pression avec 2,6 uM, 100 Å, C 18 matériau d'emballage et coupé à une longueur de 30 cm. Préparer deux méthodes LC-MS pour les différentes protéomique (6.4.1) et glycomique (6.4.2) workflows. Remarque: Les protéines et les échantillons glycanes peuvent être exécutés sur la même configuration piège / colonne dans un ordre quelconque. Pour l'analyse des protéines, injecter ~ 400 ng de protéine sur la colonne dans la phase mobile A (MPA). Exécuter l'échantillon à 300 Nl / min, selon le tableau 1, avec un pré-équilibrage de la colonne 1 pi (500 bars) et une colonne d' analyse 5 pi équilibration(500 bars). Ioniser protéines dans les conditions de MS fournies dans le tableau 2. Pour l'analyse des glycanes, injecter 5 pi de remise en suspension, P2GPN étiqueté NAT / SIL échantillons équimolaires sur la colonne. Exécuter l'échantillon à 300 Nl / min, selon le tableau 3, avec un pré-équilibrage de la colonne 2 pi (500 bars) et une analyse équilibration de la colonne 5 ul (500 bars). Ioniser glycanes dans les conditions prévues MS dans le tableau 4. Temps % MPA % MPB 0 100 0 5 98 2 105 80 20 135 68 32 136 5 95 151 5 95 152 100 0 167 100 0 Tableau 1. conditions LC pour l' analyse protéomique. Une élution de gradient avec la phase mobile B (MPB, 98% d' acétonitrile, 2% de H 2 O, l' acide formique à 0,1%) a été réalisée pour éluer peptides pour la protéomique shot-gun, dépendant des données d'acquisition , des expériences MS. MS 1 Paramètres Gamme de masse (Th) 375-1500 Résolution 120.000 AGC 1 × 10 6 Max Ionisation Temps 30 S-Lens FR Niveau 55 capillaire Temp (° C) 300 Vaporiser tension 1.75 MS 2 Paramètres type d'acquisition Top20 Résolution 15,000 AGC 1 × 10 5 Max Ionisation Temps 30 Ratio underfill 2% Isolation Fenêtre (Th) 1.4 Exclusion Etat Charge +1 Énergie de collision normalisée 27 Heure (s) d'exclusion 20 Tableau 2: conditions MS pour l' analyse protéomique Les paramètres pour ionisation par électrospray, MS 1 acquisition et MS acquisition 2 dans un instrument de Orbitrap utilisant dissociatio plus haute énergie.n (HCD) sont donnés. Temps % MPA % MPB 0 95 5 1 70 30 41 60 40 46 37 63 47 dix 90 55 dix 90 56 95 5 66 95 5 Tableau 3:. Conditions LC pour l' analyse glycane Un gradient d' élution a été réalisée pour éluer hydrazide tagged N -glycans pour l' analyse MS. <tr> MS 1 Paramètres Gamme de masse (Th) 600-1900 Résolution 60.000 AGC 5 × 10 5 Max Ionisation Temps 64 S-Lens FR Niveau 65 Capillaire Temp (° C) 325 Vaporiser tension 1.75 MS 2 Paramètres type d'acquisition Top12 Résolution 15,000 AGC 5 × 10 4 Max Ionisation Temps 100 Ratio underfill 1% Isolation Fenêtre (Th) 1.4 Première messe fixe </td> 125 Stepped Normalized Collision Energy 10/20/30 Exclusion Temps (s) 15 Tableau 4: conditions MS pour hydrazide tagged N analyse -glycan Les paramètres pour ionisation électrospray, MS 1 acquisition, et MS 2 acquisition dans un instrument de Orbitrap utilisant une dissociation plus haute énergie (HCD) sont donnés.. 7. protéomique et analyse désamidation Identifier les protéines / peptides en utilisant des outils de recherche de bio-informatique standard. Remarque: Le protocole d'analyse qui suit a été conçu en utilisant les bases de données Swiss-Prot / TrEMBL en UniProtKB et la recherche via SEQUEST dans le logiciel Proteome Discoverer 1.4, cependant, le protocole peut être traduit directement à un moteur de recherche de protéines et la notation à l'aide d'un logiciel graphique. Toutes les commandes indiquées ci-dessous sont accessibles dans les interfaces logicielles dans les menus déroulants. <li> Créer ou télécharger une base de données de séquences de protéines de l' organisme approprié à partir de données génomiques ou des bases de données protéomiques disponibles comme décrit par Apweiler et al. 25 Remarque: les bases de données protéomiques communs incluent Swiss-Prot, TrEMBL, et NCBI, mais peuvent être construits à partir de données internes ainsi. Dans le logiciel, choisissez un moteur de recherche de base de données et sélectionner les paramètres en fonction de la qualité des données acquises et la rigueur de la recherche souhaitée, comme décrit par Perkins et al. pour MASCOT 26 ou Eng et al. pour SEQUEST 27. Pour des données de haute masse de précision, définissez les paramètres de la recherche dans le logiciel comme suit: max 2 manquée clivages, 5 ppm précurseur tolérance de masse, et 0,02 Da fragment tolérance de masse (pour la détection optimisée de désamidation précise 22) et inclure les modifications de peptides tryptiques suivants : «carbamidomethyl (C)" modification statique et "désamidation (N / Q)" et "oxidation (M) "des modifications dynamiques. En cas d' utilisation 18 O étiquetage de la digestion, comprennent" désamidation 18 O (1) "comme une modification dynamique supplémentaire. La recherche, à l'aide du moteur sélectionné, les données brutes de peptides contre la base de données de protéines (7.1.1). Remarque: les tolérances de masse doivent être adaptées à l'instrument utilisé et non arbitrairement faible. Remarque: La fonction de recherche est terminée automatiquement par le logiciel en utilisant des algorithmes spécifiques différents moteurs de recherche. L'algorithme de percolateur (MASCOT), SEQUEST, ou d'autres combinaisons d'algorithmes sont utilisés pour identifier des protéines à partir de peptides et de marquer la validité des résultats; plus d' informations sur les outils disponibles sont couverts dans une revue de Gonzalez-Galarza et al. 28,29. Selon le logiciel, il faudra peut être choisi en fonction de la discrétion de l'utilisateur paramètres de recherche supplémentaires. Exporter les peptides identifiés pour curation manuelle et furthanalyse de er. Curate manuellement une liste de peptides contenant une désamidation identifiée sur la asparagine N motif de glycosylation lié en (NX (S / T), où X ≠ P). Cross-valider ces sites avec des motifs de glycosylation connus de la littérature et de créer deux groupes de résultats (validé et théorique). Utiliser le comptage spectrale 30 pour cent pour comparer l'occupation d'un site de glycosylation déterminé en comparant l'abondance des formes désamidée et non désamidée. 8. Glycan Quantification Relative Remarque: L'identification et la quantification suivante a été complétée en utilisant le logiciel XCalibur. Cependant, tout logiciel qui analyse les données brutes et automatiquement intègre des pics chromatographiques peuvent être substitués. Générer une liste théorique des compositions glycanes des combinaisons biologiquement possibles de hexoses, désoxy-hexoses, hexosamines, acide sialique, et d'autres saccharides. A cet effet, une base de données glycane humaine a été publiée par Walker et al. 15 et peut être utilisé tel quel. Pour les bases théoriques, les contraintes biologiques spécifiques à l' espèce doivent être imposées à l'espace combinatoire, et ces règles sont décrites par Kronewitter et al. 31. Calculer les masses monoisotopiques glycanes (M) des masses atomiques pour chaque composition pour la charge de protons états + 1-3. Modifier les masses monoisotopiques pour inclure l'ajout de la NAT (254,14191 g / mol) ou SIL (260,162042 g / mol) P2GPN tag. Ouvrez le programme "Configuration du traitement" de la vue de la feuille de route en XCalibur. Mettre en place un procédé de traitement tel que décrit exactement dans le matériel supplémentaire de Walker et al. 15 en utilisant la liste générée à l' étape 8.2 contenant les masses monoisotopiques théoriques pour le [M + H] 1+, [M + 2H] 2+ et [ M + 3H] 3+ espèces. Remarque: Pour confirmer l'identité glycane au-delà de précisionmasse, pour le NAT / SIL duplexée fonctionne, vérifiez que NAT et SIL N paires -glycan co-éluent avec le même temps de rétention. Qualitativement, la validation croisée de la station mobile avec les identifications 2 spectres qui doit contenir des pics appartenant à la série d'ions oxonium 32. Export de la, chromatogramme ionique extrait intégré (XIC) zones à Excel pour obtenir les abondances SIL et NAT comme décrit exactement dans le matériel supplémentaire de Walker et al. 15 Dans Excel, programmer les cellules dans une nouvelle colonne pour calculer la correction pour le recouvrement de la masse moléculaire en ajustant l'abondance SIL selon l'équation publiée par Walker et al 1 . 5: , où A est le pic d'monoisotopique et le chevauchement isotopique théorique, , Peut être calculé indépendamment par composition. Dans une seconde colonne, les cellules programme pour normaliser les canaux de NAT et SIL en utilisant l'équation pour le facteur de glycane normalisée totale (TGNF), par spectre, comme décrit par Walker et al 1 . 5: , où N est le nombre de N -glycans au- dessus de la limite de quantification. Dans une nouvelle colonne, programmer les cellules à prendre le rapport de SIL: glycanes NAT (ou vice versa) pour calculer le facteur de variation de la concentration entre les deux échantillons.

Representative Results

Figure 1:. Le schéma de la méthode FANGS-P2GPN marquage hydrophobe couplé (méthode A) pour la protéomique et glycomique combinés analyse est donnée étapes qui diffèrent entre glycomique-seulement le traitement et tandem glycomique et analyse protéomique, avec l' identification des sites de glycosylation, sont mis en évidence. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. L'en-ligne protéomique et glycomique, P2GPN méthode de marquage hydrophobe à base de filtre (méthode A) a été validée pour l' identification, la quantification, et le biais de poids moléculaire en utilisant des échantillons de plasma de poule groupée (figure 1). Pour uniquement glycomique expériences, inter-comparaisons dans les abondances de N -glycans extraites par la méthodeA à Carbograph SPE (étalon-or, méthode B) ont été faites (Figure 2). Il n'y avait aucune différence significative dans les abondances de glycanes entre les deux méthodes. La variabilité intra a également été évaluée par la quantification de la SIL: NAT rapport de glycanes obtenus par la même méthode. Le log 2 -distributions des deux méthodes étaient gaussienne, centrée sur zéro, et non significativement différents (figure 3A-B). Le poids moléculaire se situe entre les deux protocoles complètement superposées, ce qui suggère que le filtre ne discriminait pas N -glycans basée sur la gamme de poids moléculaire et hydrophilie (Figure 4). Figure 2: Un mélange équimolaire de NAT et SIL N -glycans extrait par la méthode A ou B a été préparé à partir de 2,5 pi de poule plasma (N = 4) Les échantillons ont été anal.yzed par UPLC-MS selon les paramètres recommandés suggérés dans la section 6. Les abondances pour chaque glycane, dans chaque canal NAT / SIL, ont été calculés en intégrant la zone sous le chromatogramme ionique extrait (MMA = 3 ppm), la correction de la molécule poids de chevauchement, et l'ajustement par le TGNF. Ces ratios sont présentés avec leurs erreurs standard. Les abondances de la Méthode B: Méthode A N -glycans sont pas significativement différentes (p> 0,05). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3: La variabilité intra-en (A) Méthode A (N = 133) ou (B) Méthode B (n = 123) des stratégies ont été comparées. NAT et SIL mélanges équimolaires de N -glycans, du même schéma d'extraction, Ont été analysés sur trois répétitions techniques. Le journal 2 -distributions étaient centrés sur zéro et ne sont pas significativement différents entre les deux flux de travail. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4: Les gammes de poids moléculaires de glycanes à partir de chacune de ces stratégies ont été comparées. Les deux flux de travail ont donné glycanes couvrant la même gamme de poids moléculaire. N -glycans détecté dans un protocole par rapport à l'autre est tombé juste au- dessus de la limite de détection (1 × 10 5 abondance) et ne reflètent pas de biais systématique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre. <p class="jove_content" fo:keep-together.dans les pages = "1"> Rétention des protéines déglycosylées par le filtre de poids moléculaire activé en ligne protéome analyse et site de glycosylation large identification. De nombreux protocoles pour la purification combinée des glycanes et des protéines ont été comparées à une préparation traditionnelle , sans FASP déglycosylation (tableau 5). Notre typique filtre 18 h base PNGase F de digestion, suivie par FASP trypsine digest (protocole Std) a donné lieu à des niveaux significatifs de désamidation non spécifique, ce qui peut interférer avec l'identification des glycosites. Par conséquent, un procédé utilisant un temps d'incubation plus courte à une température élevée (50 ° C) et une étape de pointe dans la PNGase F (protocole SPI) a été étudiée comme une alternative, ainsi qu'un protocole de micro-ondes de digestion (protocole MD), pour réduire au minimum la non- désamidation spécifique. Les glycanes observées dans les nouvelles méthodes de digestion ne sont pas significativement différents dans les compositions ou les abondances de 18 h standard, 37 ° C filtre PNGase F digest ( <strong> La figure 5). Combiné avec une incubation de trypsine courte, désamidation non spécifique a été réduite de manière significative, avec un taux de faux positifs glycosites <5% (tableau 5). Protéines peptides peptides Désaminée Glycosites glycoprotéines + – + – + – + – + – FASP <td colspan="2"> 249 3083 795 5 5 18hr 217 304 6013 5086 1029 733 257 24 112 18 MARYLAND 270 266 5190 5125 465 455 254 8 102 7 SPI 281 288 4729 4482 602 573 232 dix 145 8 . Tableau 5: Comparaison des données protéomiques d'une trypsine norme digérer par rapport à la méthode de marquage en ligne FANGS-P2GPN ont fait des préparatifs ont été effectués avec (+) et sans (-) PNGase F pour déterminer les taux de désamidation et une estimation non spécifique fond glycosite taux de faux positifs. Les protéines ont été identifiées avec 1% le taux de fausses découvertes (FDR); peptides ont été filtrés en fonction de "haut" la confiance des peptides dans Proteome Discoverer 1.4 (q <0,01); glycosites ont été identified sur la base de séquences uniques contenant désamidation du motif de glycosylation conservés (NXS / T); et glycoprotéines ont été définies comme des protéines identifiées contenant au moins une glycosite identifiée. Figure 5: Raccourcissement des protocoles de glycanes ont été mis au point pour minimiser la désamination dans les échantillons et on les compare à la PNGase F 18hr FANGS digestion. Les différences moyennes en abondances étaient de 10% et 5% pour le rapport de gestion (2.2.3) et SPI (2.2.2) protocoles, respectivement. Sur les 48 glycanes identifiés, 90% affiché moins de variation de 1,5 fois. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

High-throughput quantitative methods are needed to facilitate routine glycan analysis. For the last thirty years, glycomics analysis has been limited to a subset of research groups, despite its importance in disease, clinical applications, and pharmaceuticals. The FANGS-P2GPN purification and tagging method for glycomics and proteomics performs the same analysis on a single aliquot of sample, reducing the cost of supplies and the amount of material needed (particularly important in human and mouse studies). Furthermore, efforts to minimize variability in preparations are critically important, as every additional step contributes to error, potentially masking important but low-abundant changes in case-control studies. Coupling of FANGS to hydrophobic hydrazide tagging allows protein and glycan samples to be run on the same RPLC column, enhances glycan ionization, provides for relative quantification, and can be quantitatively applied to plasma.

For N-glycan analysis, it is critical to use the suggested level of PNGase F to achieve full de-glycosylation. Though glycans are solvent exposed, denaturation of proteins and excess enzyme help ensure efficient and complete cleavage. For accurate quantitation of the glycans, it is necessary to ensure that they are completely dried after derivatization to quench the reaction and prevent cross-reactions when mixing the NAT and SIL species. Finally, when extending the workflow to glycosite analysis, timing of the steps is critical to minimize non-specific deamidation. The modified protocols provided for combined glycomics and proteomics analysis work consistently when performed accordingly.

The workflow achieves accurate relative quantitation of N-glycans from plasma compared to the gold-standard, SPE method. There is no apparent bias in the types of glycans extracted in terms of molecular weight, hydrophilicity, and compositional structure. Though we have not explored the qualitative analysis of O-linked glycans, we expect that FANGS could accommodate the addition of a β-elimination step post-PNGase F digestion of N-linked glycans. However, procedures would require significant modification for reagent cleanup prior to mass spectrometry, and peptide analysis will be significantly impacted. For proteomics, the same depth of proteome coverage is achieved compared to traditional FASP methods. Importantly, methods achieve a minimal false discovery rate for N-glycan deamidation. While the method is compatible with 18O labeling of Asn during the PNGase digestion step22,23, the low glycosylation site false discovery rate suggests that it may not be necessary, further reducing costs and complexity.

The proteome is not enriched for glycoproteins in this method, which has both advantages and disadvantages. Certain low abundant glycoproteins may not be detected in the analysis. However, the occupancy of glycosylated sites per protein, can be compared between biological samples. Additionally, the error and bias introduced from lectin affinity purification or chemical enrichment is eliminated. In conclusion, coupling of FANGS to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy results in a simplified, quantitative, high-throughput method for the tandem analysis of the glycome and proteome with great potential for application in clinical case-control studies.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was generously funded by the NIH NCI IMAT Program Grant R33 (CA147988-02), the NIH NIGMS Graduate Training in Molecular Biotechnology at NC State Grant (T32GM008776), the US Dept. of Education GAANN Fellowship Program in Molecular Biotechnology at NC State Grant (P200A140020), the W.M. Keck Foundation, and North Carolina State University. Hen plasma was obtained with the assistance of Dr. James N. Petitte and Rebecca Wysocky in the NC State University Dept. of Poultry Science.

Materials

Acetic Acid (50%):  Sigma Aldrich  45754
Acetonitrile, HPLC grade Burdick & Jackson  AH015-4
Ammonium Bicarbonate Sigma Aldrich  A6141
Bradford Reagent Sigma Aldrich  B6916 Alternative: Bicinchoninic acid kit (Sigma Aldrich BCA1)
Calcium chloride Sigma Aldrich  C1016
Centrifuge Eppendorf 5804 R Alternate centrifuges that reach 14,000 x g are suitable
DL-Dithiothreitol, 1M in solution Sigma Aldrich  646563
Easy-nLC 1000 Thermo Scientific LC120 Alternate nano or ultra high pressure LCs will produce similar data, such as: 1. Dionex UltiMateÒ 3000 LC (Thermo Scientific) 2. Acquity UPLC (Waters)
Floating Tube Rack TedPella 20831-20
Fetuin New England Biolabs  P6042S
Fisher Scientific Isotemp Standard Lab Ovens Fisher Scientific 11-690-625F Alternate incubators that reach 56 °C are suitable
Formic Acid Sigma Aldrich  56302
GE Microwave Oven General Electric 57B5 E82904 Any microwave with adjustable power settings is suitable
INLIGHT Glycan Tagging Kit  Cambridge Isotope Laboratories GTK-1000 The INLIGHT kit provides NAT and SIL versions of the P2GPN reagent.
Iodoacetamide Sigma Aldrich  A3221
Kinetix 2.6 mM, 100 Å, C18 bulk stationary phase Phenomenex  Bulk Media Alternative: Any C18 stationary phase £ 5 mM 
Mascot Daemon Software and Server Matrix Science Alternative: Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific)
Methanol, HPLC grade Burdick & Jackson  AH230-4
PicoFrit Self-Pack Column: 360 um, OD 75um ID, 15 um tip, non-coated, 5 per box, 50 cm New Objective 1 5 PF360-75-15-N-5
PNGase F (glycerol-free), 75,000 units/ml New England BioLabs  P0705L
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer Thermo Scientific Alternate high mass accuracy (£ 5 ppm) mass spectrometers will provide similar data
RNase B New England Biolabs  P7817S
Trypsin from Porcine Pancreas Sigma Aldrich  T6567-5X
Urea Sigma Aldrich  51456
Vacuum ConcentratorSavant SPD131DDA SpeedVac Concentrator Thermo Scientific SPD131DDA Alternate vacuum concentrators are suitable
Vivacon 500 30 kDa Filters  Sartorius Stedim Biotech VN01H22 Alternative: Amicon Ultra 0.5 Centrifugal Filter Units with Ultracel-10 kDa Membrane (Millipore UFC501096)
Water, HPLC grade Burdick & Jackson  AH365-4
Water, 18O Cambridge Isotope Laboratories OLM-240-97-1 The addition of 18O in the PNGase F digest step is optional and may not be necessary for deamidation studies completed with 95% confidence
Xcalibur 2.0 Thermo Scientific XCALIBUR20
Zwittergent Test Kit Merck Millipore 693030
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Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy. J. Vis. Exp. (109), e53735, doi:10.3791/53735 (2016).
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