Deficitária e Abordagem de ganho de função para Investigar celular precoce Destino Determinantes na pré-implantação embriões de camundongos
Summary
O objetivo deste protocolo é para descrever um deficitária e ganhar-de método de função que é aplicável para identificar neogenin como um receptor específico de estágio que leva a trofectoderma e diferenciação massa celular interna de embriões de ratos pré-implantação.
Abstract
Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.
Introduction
Preimplantation o desenvolvimento embrionário pode ser dividido em várias fases distintas, a partir do estádio de uma célula para a mórula e blastocisto. Muito evidência sugere que a polaridade e indicadores de posicionamento desempenhar um papel na determinação do destino da célula precoce no trofectoderma (TE) e a massa celular interna (ICM). No entanto, a natureza dos sinais, como eles são transduzidas em sinais celulares, e os contextos fisiológicos em que tais sinais são capazes de iniciar a diferenciação linhagem de células não são conhecidos. Estas células diferenciadas, em seguida, submetidos a especialização, começando a assumir estruturas características e funções necessárias para a formação de embriões adequada e crescimento da placenta 1-3.
embriões pré-implantação são particularmente propício à manipulação por injecção directa de material genético modificados como siRNA ou de cDNA alvo e, portanto, pode ser utilizada para estudar moléculas alvo específicas. Há uma crescente compreensão de que genéticaA análise de embriões de vertebrados é fundamental para fazer avançar nossa compreensão do desenvolvimento embrionário 4. introdução exacta de um gene de tipo selvagem ou uma sua forma mutante em um embrião num contexto oportuna para realizar gain- ou perda de função do gene tem grandemente facilitado o estudo de genes regulados relativamente ao desenvolvimento. Deficitária e ganhar de função através de microinjecção de materiais genéticos em embriões não-mamíferos e mamíferos primeiros individuais é relativamente simples por causa de seu grande tamanho e grande receptividade 5. A microinjecção é tipicamente realizada usando vectores não virais. vantagem particular foi tomada em consideração a facilidade de utilização de vectores não virais mais de vetores virais e transgenes. A perda-rápido ou sistema de expressão de ganho de função em embriões de camundongos foi desenvolvida que nos permite dissecar e entender as funções dos genes na embriologia dos vertebrados 6,7.
marcação fluorescente de embriões facilitaria enormemente a seleção de microinjected ou geneticamente manipulado embriões e, ao mesmo tempo conceder um meio para quantificar indirectamente o nível de expressão de ADNc ou siRNA microinjectados com base na intensidade de fluorescência 8. Para realizar esta rotulagem, ADNc de proteína fluorescente, GFP ou RFP, são co-injectados quer como construções de fusão ou separadamente. A intensidade da fluorescência da GFP ou RFP revela a extensão de expressão de siRNA ou DNA estranho para assegurar que deficitária ou ganho-de-função tem sido realizado.
Aqui, apresentamos um protocolo de micromanipulação para a técnica função deficitária e ganho-de- que nos permitiu identificar neogenin como um receptor que transmite sinais extracelulares importantes na diferenciação celular no início de embriões de ratos pré-implantação.
Protocol
Representative Results
Discussion
No presente protocolo, demonstramos novos métodos de microinjecção de materiais genéticos, quer cDNA ou shRNA, para os embriões de ratos de 2 PN para explorar o papel da neogenin na diferenciação celular precoce durante a embriogênese mouse. A modificação genética de embriões pré-implantação é uma técnica poderosa para a descoberta de informações importantes sobre os mecanismos subjacentes moleculares para, por exemplo, a primeira determinação linhagem celular. A modificação genética é um dos m?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores também gostaria de reconhecer o grupo do Dr. Xiong na Universidade de Ciências da Saúde da Geórgia para a fabricação e compartilhando as construções para neogenin vetores de cDNA e shRNA. Este estudo foi apoiado por bolsas do Programa Básico de pesquisa da ciência (2013R1A1A4A01012572) financiado pela Fundação coreana Investigação e por uma bolsa de investigação da Universidade Sahmyook.
Materials
| M16 medium, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT# 11A832 | |
| Goat serum, | Dako (Glostrup, Denmark) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holland | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Mineral olie | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin | (Intervet, Holland) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Reverse Transcriptase | lifetechnologies | 18080-044 | |
| PCR pre mixture | (Bioneer, Daejon, S. Korea) | GenDEPOT , A0224-050 | |
| Agarose (molecular grade) | BioRad | 161-3101 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| polyclonal rabbit anti-neogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin | R&D systems | 3720-RG | |
| all plasmid constructs | Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). | the present studies were kindly provided by | |
| Neon® Transfection System | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| Micromainpulation system with Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| MicroInjector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Holder | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfoge | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| grinder | Narishige | EG400 | |
| Puller | Sutter Instrumnet company | P-97 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | lifetechnologies | 4388444 |
References
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