Loss- ونهج كسب من وظيفة إلى التحقيق في خلية المبكر مصير محددات في سابق للانغراس أجنة الفئران
Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو لوصف loss- وكسب من طريقة وظيفة التي تنطبق على تحديد neogenin بمثابة مستقبلات مرحلة معينة أن يؤدي إلى الأديم الظاهر الغاذي والخلايا الداخلية التمايز الشامل في الأجنة قبل الغرس الماوس.
Abstract
Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.
Introduction
سابق للانغراس التطور الجنيني يمكن تقسيمها إلى عدة مراحل متميزة، من مرحلة خلية واحدة إلى تويتة والكيسة. وتشير أدلة كثيرة على أن الاستقطاب والعظة الموضعية تلعب دورا في أوائل تقرير مصير الخلية إلى الأديم الظاهر الغاذي (TE) وكتلة الخلايا الداخلية (ICM). ومع ذلك، فإن طبيعة العظة، وكيف transduced أنها في الإشارات الخلوية، والسياقات الفسيولوجية التي يمكن لهذه الإشارات هي قادرة على الشروع في خلية النسب التمايز ليست معروفة. هذه الخلايا المتمايزة ثم الخضوع التخصص، بدأت تأخذ على هياكل مميزة والوظائف اللازمة للجنين تشكيل السليم ونمو المشيمة 1-3.
الأجنة ما قبل الزرع قابلة جدا للتلاعب عن طريق الحقن المباشر للمواد الجينية المعدلة مثل سيرنا أو كدنا] الهدف، وبالتالي يمكن استخدامها لدراسة الجزيئات المستهدفة المحددة. هناك فهم متزايد بأن الوراثيةتحليل للأجنة الفقاريات أمر بالغ الأهمية لتعزيز فهمنا من التطور الجنيني 4. مقدمة الدقيق للجينات من النوع البري أو شكل متحولة إلى الجنين في سياق الوقت المناسب لإنجاز gain- أو الخسارة من وظيفة الجين قد سهلت كثيرا من دراسة الجينات ينظم تنمويا. Loss- وكسب من وظيفة عبر Microinjection من المواد الوراثية في الأجنة غير الثدييات والثدييات الفردية في وقت مبكر هو بسيط نسبيا بسبب حجمها الكبير والتقبل الكبير 5. وعادة ما يتم إجراء حقن مكروي باستخدام ناقلات غير الفيروسية. وقد اتخذت ميزة خاصة من سهولة استخدام ناقلات غير الفيروسية عبر ناقلات فيروسية والجينات المحورة. وقد وضعت loss- السريع أو تحقيق مكاسب من وظيفة نظام التعبير في أجنة الفئران التي تسمح لنا لتشريح وفهم وظائف الجينات في الأجنة الفقارية 6،7.
أن وضع العلامات الفلورية الأجنة يسهل إلى حد كبير في اختيار ميكرoinjected أو وراثيا التلاعب الأجنة، وفي الوقت نفسه منح وسيلة لقياس غير مباشر على مستوى التعبير سيرنا microinjected أو كدنا] على أساس كثافة الفلورسنت 8. لإنجاز هذه العلامات، فلوري كدنا] بروتين، GFP أو طلب تقديم العروض، هي شارك في حقن إما يبني الانصهار أو على حدة. كثافة مضان من GFP أو طلب تقديم العروض تكشف عن مدى تعبير عن سيرنا أو الحمض النووي الأجانب لضمان أن loss- أو الحصول على وظيفة، وقد تم إنجازه.
هنا، نقدم بروتوكول المجهرية لloss- والكسب وغالبا تقنية وظيفة التي سمحت لنا لتحديد neogenin بمثابة مستقبلات أن التبديلات العظة خارج الخلية مهمة في تمايز الخلايا في وقت مبكر من الأجنة قبل الغرس الماوس.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، ونحن لشرح أساليب جديدة للMicroinjection من المواد الجينية، إما كدنا] أو shRNA، إلى الأجنة 2-PN الماوس لاستكشاف دور neogenin في تمايز الخلايا في وقت مبكر خلال مرحلة التطور الجنيني الماوس. التعديل الوراثي للأجنة قبل الغرس هي تقنية قوية في الكشف عن المعلومات الأساس?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أيضا أن نعترف مجموعة الدكتور شيونغ في جامعة العلوم الصحية جورجيا لتصنيع وتقاسم البنى لneogenin كدنا] وshRNA ناقلات. وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من برنامج العلوم الاساسية بحوث (2013R1A1A4A01012572) بتمويل من مؤسسة أبحاث الكورية ومنحة بحثية من جامعة Sahmyook.
Materials
| M16 medium, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT# 11A832 | |
| Goat serum, | Dako (Glostrup, Denmark) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holland | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Mineral olie | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin | (Intervet, Holland) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Reverse Transcriptase | lifetechnologies | 18080-044 | |
| PCR pre mixture | (Bioneer, Daejon, S. Korea) | GenDEPOT , A0224-050 | |
| Agarose (molecular grade) | BioRad | 161-3101 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| polyclonal rabbit anti-neogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin | R&D systems | 3720-RG | |
| all plasmid constructs | Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). | the present studies were kindly provided by | |
| Neon® Transfection System | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| Micromainpulation system with Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| MicroInjector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Holder | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfoge | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| grinder | Narishige | EG400 | |
| Puller | Sutter Instrumnet company | P-97 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | lifetechnologies | 4388444 |
References
- Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).
- Sasaki, H. Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development. Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).
- Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse. Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).
- Ovitt, C. E., Schöler, H. R. The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo. Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment. J. Vis. Exp. (53), e2851 (2011).
- Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression. Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).
- Khang, I., Sonn, S., Park, J. -. H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction. Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769 (2015).
- Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos. PLoS One. 9 (7), e101989 (2014).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).
