Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר
Summary
מטרת פרוטוקול זה היא לתאר loss- ולהשיג-של שיטת הפונקציה כי הוא ישים לזהות neogenin כמו קולטן בשלב ספציפי שמוביל trophectoderm ותא פנימי בידול המונים עוברי עכברים preimplantation.
Abstract
Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.
Introduction
ההתפתחות העוברית preimplantation ניתן לחלק מספר שלבים ברורים, החל משלב-תא אחד מורולה ואת הבלסטוציסט. עדויות רבות עולה כי הקוטביות רמזים מיקומית לשחק תפקיד בקביעת גורל התא מוקדם לתוך trophectoderm (TE) ואת מסת התאים הפנימית (ICM). עם זאת, האופי של הרמזים, איך הם transduced לאותות הסלולר, וההקשרים הפיסיולוגיים שבו אותות כאלה מסוגלים ליזום בידול שושלת תא אינם ידועות. תאים מובחנים אלה אז עוברים התמחות, החל לקחת על מבנים אופייניים ופונקציות הדרושים להיווצרות נכונה העובר וצמיחה של השליה 1-3.
עוברי אדם במיוחד למניפולציה על ידי הזרקה ישירה של חומרים גנטיים שונים כמו siRNA או cDNA היעד ולכן יכולים להיות מנוצל כדי ללמוד מולקולות מטרה ספציפיות. יש הבנה גוברת כי גנטיניתוח של עוברי החולייתנים הוא קריטי לקידום הבנתנו התפתחות העוברית 4. מבוא מדויק של גן wild-type או צורת מוטציה לעובר בהקשר בזמן להשיג gain- או פסד של פונקציה של הגן מאוד קל בחקר גנים מוסדרים מבחינה התפתחותית. Loss- ולהשיג של פונקציה באמצעות microinjection של חומרים גנטיים לעוברי פרט מוקדמים שאינם יונקים יונקים הוא יחסית פשוט בגלל הגודל שלהם גדול פתיחות רבה 5. Microinjection טיפוסית מבוצעת וקטורים שאינם ויראלי. יתרון מסוים נלקח של קלות השימוש וקטורים שאינם נגיפי מעל וקטורים transgenes ויראלי. Loss- מהירה או רווח של פונקציה במערכת הביטוי עובר עכברים פותחה המאפשרת לנו לנתח ולהבין פונקציות גני אמבריולוגיה חוליות 6,7.
תיוג פלורסנט של עוברי היה מאוד להקל על הבחירה של microinjected או מניפולציות גנטיות עוברים ובאותו זמן להעניק אמצעי לכמת את רמת הביטוי בעקיפין של microinjected siRNA או cDNA מבוסס על עוצמת פלורסנט 8. כדי להשיג תיוג זה, cDNA חלבון פלואורסצנטי, GFP או RFP, הם כמו שיתוף מוזרק או בונה היתוך או בנפרד. עוצמת הקרינה של ה- GFP או RFP החושף את מידת הביטוי של siRNA או דנ"א זר על מנת להבטיח כי loss- או לזכות של פונקציה הושג.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול המיקרומניפולציה עבור טכניקה פונקציה loss- ורווח-של- שאפשרה לנו לזהות neogenin כמו קולטן המעביר אותות תאיים חשובים התמיינות תאים מוקדם עוברי עכברים preimplantation.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים שיטות חדשניות של microinjection של חומרים גנטיים, או cDNA או shRNA, לתוך עוברי עכברים 2-PN כדי לחקור את תפקיד neogenin ב התמיינות תאים מוקדם במהלך העובר העכבר. הנדסה גנטית של עבר preimplantation היא טכניקה רבה עצמה בחשיפת מידע חשוב על מנגנונים מולקולריים שבבסיס ע…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים גם רוצים להכיר החוקרים שיונג ורג 'יה למדעי הבריאות באוניברסיטת לייצור ושיתוף בונה עבור neogenin וקטורים cDNA ו shRNA. מחקר זה נתמך על ידי תרומות של תוכנית המחקר במדע בסיסי (2013R1A1A4A01012572) במימון קרן מחקר קוריאה על ידי מענק מחקר מן Sahmyook האוניברסיטה.
Materials
| M16 medium, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT# 11A832 | |
| Goat serum, | Dako (Glostrup, Denmark) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holland | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Mineral olie | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin | (Intervet, Holland) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Reverse Transcriptase | lifetechnologies | 18080-044 | |
| PCR pre mixture | (Bioneer, Daejon, S. Korea) | GenDEPOT , A0224-050 | |
| Agarose (molecular grade) | BioRad | 161-3101 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| polyclonal rabbit anti-neogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin | R&D systems | 3720-RG | |
| all plasmid constructs | Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). | the present studies were kindly provided by | |
| Neon® Transfection System | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| Micromainpulation system with Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| MicroInjector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Holder | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfoge | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| grinder | Narishige | EG400 | |
| Puller | Sutter Instrumnet company | P-97 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | lifetechnologies | 4388444 |
References
- Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).
- Sasaki, H. Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development. Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).
- Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse. Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).
- Ovitt, C. E., Schöler, H. R. The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo. Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment. J. Vis. Exp. (53), e2851 (2011).
- Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression. Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).
- Khang, I., Sonn, S., Park, J. -. H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction. Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769 (2015).
- Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos. PLoS One. 9 (7), e101989 (2014).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).
