Déficitaires et approche Gain de fonction d'enquêter sur les cellules précoce destin déterminants dans les embryons de souris préimplantatoire
Summary
L'objectif de ce protocole est de décrire un déficitaire et d'acquérir de-méthode de la fonction qui est applicable pour identifier néogénine comme un récepteur spécifique de stade qui mène à trophectoderme et la différenciation cellulaire interne de masse dans des embryons de souris préimplantatoire.
Abstract
Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.
Introduction
Préimplantatoire de développement embryonnaire peut être divisé en plusieurs étapes distinctes, à partir du stade d'une cellule à la morula et blastocyste. Beaucoup de preuves suggère que la polarité et les indices de position jouent un rôle au début de la détermination du destin cellulaire dans le trophectoderme (TE) et la masse cellulaire interne (ICM). Cependant, la nature des indices, la façon dont ils sont transduits en signaux cellulaires et les contextes physiologiques dans lesquels ces signaux sont capables d'initier la différenciation de la lignée cellulaire ne sont pas connues. Ces cellules différenciées sont ensuite soumis à la spécialisation, à commencer à prendre des structures caractéristiques et fonctions nécessaires à l' embryon la formation et à la croissance du placenta 1-3.
embryons de pré-implantation sont particulièrement favorables à la manipulation par injection directe de matériel génétique modifié comme siRNA ou l'ADNc cible et peuvent donc être utilisés pour étudier des molécules cibles spécifiques. Il y a une compréhension croissante que génétiqueanalyse des embryons de vertébrés est essentielle pour faire progresser notre compréhension du développement embryonnaire 4. l'introduction précise d'un gène de type sauvage ou une forme mutante dans un embryon dans un contexte en temps opportun pour accomplir ou intensité forte perte de fonction du gène a grandement facilité l'étude des gènes régulés par le développement. Et déficitaires gain de fonction par microinjection de matériel génétique dans des embryons non mammifères et mammifères début individuels est relativement simple en raison de leur grande taille et de grande réceptivité 5. La micro-injection est typiquement réalisée en utilisant des vecteurs non viraux. Un avantage particulier a été pris de la facilité d'utilisation de vecteurs non viraux sur des vecteurs viraux et des transgènes. Un rapide ou déficitaire système d'expression gain de fonction dans des embryons de souris a été développée qui nous permet de disséquer et de comprendre les fonctions des gènes en embryologie vertébré 6,7.
Le marquage fluorescent des embryons serait grandement faciliter la sélection des microinjected ou génétiquement manipulées et les embryons en même temps , délivrer un moyen pour quantifier indirectement le niveau d'ARNsi ou d' ADNc microinjecté expression basée sur l' intensité de fluorescence 8. Pour ce faire l'étiquetage, l'ADNc de la protéine fluorescente, la GFP ou RFP, sont co-injectées soit des constructions de fusion ou séparément. L'intensité de fluorescence de la GFP ou RFP révèle l'ampleur de l'expression d'ARNsi ou d'ADN étranger à faire en sorte que déficitaire ou gain de fonction a été accomplie.
Ici, nous présentons un protocole de micromanipulation pour la technique de la fonction déficitaire et le gain-of qui nous a permis d'identifier néogénine comme un récepteur qui transmet des signaux extracellulaires importants dans la différenciation cellulaire précoce chez les embryons de souris préimplantatoire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans le présent protocole, nous démontrons de nouvelles méthodes de microinjection du matériel génétique, soit l'ADNc ou shRNA, dans les embryons 2-PN souris pour explorer le rôle de néogénine dans la différenciation cellulaire précoce au cours de l'embryogenèse de la souris. La modification génétique des embryons préimplantatoires est une technique puissante dans la découverte des informations clés sur les mécanismes sous-jacents moléculaires pour, par exemple, la première détermination de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent également remercier le groupe du Dr Xiong à l'Université des sciences de la santé en Géorgie pour la fabrication et le partage des constructions pour néogénine ADNc et shRNA vecteurs. Cette étude a été soutenue par des subventions du programme de base de recherche en sciences (2013R1A1A4A01012572) financé par la Fondation de la recherche coréenne et par une subvention de l'Université Sahmyook de recherche.
Materials
| M16 medium, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT# 11A832 | |
| Goat serum, | Dako (Glostrup, Denmark) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holland | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Mineral olie | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin | (Intervet, Holland) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Reverse Transcriptase | lifetechnologies | 18080-044 | |
| PCR pre mixture | (Bioneer, Daejon, S. Korea) | GenDEPOT , A0224-050 | |
| Agarose (molecular grade) | BioRad | 161-3101 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| polyclonal rabbit anti-neogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin | R&D systems | 3720-RG | |
| all plasmid constructs | Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). | the present studies were kindly provided by | |
| Neon® Transfection System | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| Micromainpulation system with Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| MicroInjector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Holder | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfoge | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| grinder | Narishige | EG400 | |
| Puller | Sutter Instrumnet company | P-97 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | lifetechnologies | 4388444 |
References
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