Loss e approccio guadagno-di-funzione per indagare cellulare precoce Fate Determinanti in preimpianto embrioni di topo
Summary
L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere un in perdita e guadagno-di metodo di funzione che è applicabile per identificare neogenin come un recettore specifico stadio che porta a trophectoderm e la differenziazione massa cellulare interna di embrioni preimpianto mouse.
Abstract
Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.
Introduction
Preimpianto sviluppo embrionale può essere diviso in più fasi distinte, dalla fase unicellulare alla morula e blastocisti. Molte prove suggeriscono che la polarità e spunti di posizione hanno un ruolo nella determinazione presto il destino della cellula nella trophectoderm (TE) e la massa cellulare interna (ICM). Tuttavia, la natura dei segnali, come sono trasdotti in segnali cellulari e contesti fisiologici in cui tali segnali sono in grado di avviare differenziazione linea cellulare non sono noti. Queste cellule differenziate poi subiscono la specializzazione, cominciando ad assumere strutture caratteristiche e le funzioni necessarie per la corretta formazione dell'embrione e la crescita della placenta 1-3.
embrioni pre-impianto sono particolarmente suscettibili di manipolazione da parte di iniezione diretta del materiale genetico modificato come siRNA o cDNA bersaglio e, quindi, possono essere utilizzati per studiare specifiche molecole bersaglio. Vi è una crescente comprensione che geneticaanalisi degli embrioni dei vertebrati è fondamentale per far progredire la nostra comprensione dello sviluppo embrionale 4. introduzione precisa di un gene wild-type o una forma mutante in un embrione in un contesto tempestivo per realizzare GAIN- o la perdita di funzione del gene ha notevolmente facilitato lo studio dei geni evolutivamente regolamentati. In perdita e guadagno-di-funzione tramite microiniezione di materiale genetico in singoli embrioni non-mammiferi e mammiferi primi è relativamente semplice a causa delle loro grandi dimensioni e di grande ricettività 5. Microiniezione viene in genere eseguita utilizzando vettori non virali. Vantaggio particolare è stata presa la facilità di utilizzo di vettori non virali su vettori virali e transgeni. Una rapida in perdita o il guadagno-di-funzione sistema di espressione in embrioni di topo è stato sviluppato che ci permette di sezionare e capire le funzioni del gene in embriologia vertebrati 6,7.
etichettatura fluorescente di embrioni faciliterebbe notevolmente la selezione di MICRoinjected o geneticamente manipolati embrioni e allo stesso tempo garantire un mezzo per quantificare indirettamente il livello di espressione di microiniezione siRNA o cDNA basato su intensità di fluorescenza 8. Per fare questo l'etichettatura, cDNA proteina fluorescente, GFP o RFP, sono co-iniettata sia come costrutti di fusione o separatamente. L'intensità di fluorescenza di GFP o RFP rivela il grado di espressione di siRNA o il DNA estraneo a garantire che in perdita o guadagno-di-funzione è stato compiuto.
Qui, vi presentiamo un protocollo micromanipolazione per la tecnica funzioni in perdita e il guadagno-of che ci ha permesso di identificare neogenin come un recettore che trasmette segnali extracellulari importanti nella differenziazione delle cellule presto embrioni preimpianto mouse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel presente protocollo, dimostriamo nuovi metodi di microiniezione del materiale genetico, sia cDNA o shRNA, nelle embrioni 2-PN mouse per esplorare il ruolo di neogenin nella differenziazione delle cellule precoce durante l'embriogenesi mouse. La modificazione genetica degli embrioni preimpianto è una tecnica potente nello scoprire informazioni chiave su meccanismi di base molecolari per, ad esempio, la prima determinazione linea cellulare. La modificazione genetica è uno dei metodi più comunemente utilizzati p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano inoltre ringraziare il gruppo del Dr. Xiong presso la Georgia Health Sciences University per la produzione e la condivisione dei costrutti per neogenin cDNA e shRNA vettori. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal Science Research Program di base (2013R1A1A4A01012572) finanziato dalla Fondazione coreana di ricerca e da un assegno di ricerca da Sahmyook University.
Materials
| M16 medium, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT# 11A832 | |
| Goat serum, | Dako (Glostrup, Denmark) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holland | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Mineral olie | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin | (Intervet, Holland) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Reverse Transcriptase | lifetechnologies | 18080-044 | |
| PCR pre mixture | (Bioneer, Daejon, S. Korea) | GenDEPOT , A0224-050 | |
| Agarose (molecular grade) | BioRad | 161-3101 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| polyclonal rabbit anti-neogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin | R&D systems | 3720-RG | |
| all plasmid constructs | Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). | the present studies were kindly provided by | |
| Neon® Transfection System | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| Micromainpulation system with Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| MicroInjector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Holder | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfoge | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| grinder | Narishige | EG400 | |
| Puller | Sutter Instrumnet company | P-97 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | lifetechnologies | 4388444 |
References
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