健康と負傷ゼブラフィッシュ脳の大規模な走査型透過電子顕微鏡（Nanotomy）

ゼブラフィッシュの幼虫を持つすべての実験は、国内およびEUのガイドラインに従ってフローニンゲン大学の動物実験委員会によって承認されました。 1.試料の調製 固定と埋め込 ​​み 固定 トリカイン（0.003％）で稚魚をAnaesthetizeを静かに突っついによってE3（5のNaCl、0.17のKCl、0.33mMのCaCl 2を、0.33 mMのMgSO 4を、10mMのHEPES、pHは7.6）、麻酔の深さのためのゼブラフィッシュの水とテストに追加しました解剖顕微鏡下で200μlのピペットチップを用いて動きはもはや（ 図1A）が検出されなくなるまで。 説明したようにアガロース1.8％で共焦点または2光子イメージングを使用してインビボ撮像データに取得した後に相関EMのためにサンプルを処理する場合、アガロースで5,15修正幼虫は、トリトンX-100（0.05％）を含有するPBS中4％PFAを用いました。 アガロースおよびプロセスのための幼虫をカット大規模なEM 5。 プラスチックチューブで、室温で2時間、トリトンX-100を含むPBS中で新鮮な4％パラホルムアルデヒド（0.05％）で幼虫を修正しました。 注：次のステップ（1.1.1.5）で説明したように（ インビトロで ）培養物中で増殖させた細胞は、直接、グルタルアルデヒドで固定することができます。 溶液を除去し、100μlの0.5％PFA、2％グルタルアルデヒド（GA）、および0.1 Mカコジル酸ナトリウム（pH7.4）に追加します。 4℃で一晩保管してください。 0.1 Mカコジル酸ナトリウム中で二回サンプルを洗浄します。 オスミウムの浸透を容易にするために、後脳に吻方幼虫の頭をカットします。細かいシリンジ/鉗子を使用してください。 2時間氷上で0.1Mのカコジル酸ナトリウム中の1％四酸化オスミウム（OsO 4）/1.5%フェロシアン化カリウムの、Postfixの幼虫（K 4 [Fe（CN）6]を）および二重蒸留H 2 Oで3×5分間のすすぎエタノール濃度の増加で20分間のインキュベーション（50％、70％、3回、100％）をエタノール中で脱水します。 埋め込 ​​み EMラボで使用される標準的なレシピに応じて、エポキシ樹脂を準備します。 注：次のように私たちは、エポキシ樹脂を使用する：19.8グラムのglycidエーテル100、磁気撹拌機を用いて、9.6グラムの2-ドデセニルコハク酸無水物及び11.4グラム化メチル無水物を混ぜます。 0.5グラムDMP-30（トリス – （ジメチルアミノメチル）フェノール）を追加し、再び混ぜます。 （RT）を回転させながら（v / v）エタノール中の50％のエポキシ樹脂中に幼虫一晩インキュベートします。 純粋な樹脂で希釈したエポキシ樹脂を交換してください。 、30分間インキュベートし、再度新たな樹脂を添加し、さらに30分間インキュベートします。再び樹脂をリフレッシュした後、58℃で15分間、低圧（200ミリバール）下、室温でさらに1時間、続いて室温で3時間を、インキュベートします。 オリエント針を使用して、解剖顕微鏡の下で市販されているシリコンフラット埋め込み金型で頭や金型の側を向い前方にまたは必要に応じて爪楊枝します （ 図1B）。 エポキシ解像度を重合58℃で一晩インチエポキシ樹脂である場合は、まだ柔らかすぎ別の日が重合し、58℃で硬化することができます。ピンセットを使用して圧力を印加することにより、試験剛性。これは簡単にインデントを残す場合は別の日には重合し、58℃で硬化することができます。試料が完全に硬化されると、トリミングし、切片に進みます。 （ 図1B）かみそりの刃を使用して、スタブから余分な樹脂を切り落とします。 、セクショニング対照的な、および取り付け セクショニング ウルトラミクロトームを用いて、セクションエポキシ樹脂ブロック。 ガラスナイフやトルイジンブルー/塩基性フクシンのための半薄切片（500 nm）をカットするダイヤモンドhistoknifeを使用します（ 図1D）右の位置を検出するために染色します。 その先端火炎中で溶融して閉じられたガラスパスツールピペットでそれらをピックアップして、顕微鏡スライド上の半薄切片を転送します。ホットプレートuの上にドライntilに水が残っていません。ホットプレート上で、そして水ですすいだ後、水に1％トルイジンブルー、1％の四ホウ酸ナトリウムで0.05％塩基性フクシンで10秒間染色で10秒間染色。 40Xに10Xで通常の光学顕微鏡で調べます。 脳内の適切な部位/配向に到達すると、超薄切片を切断するためにダイヤモンドナイフを用いてエポキシ樹脂ブロックを区画続ける（〜70nmで、 図1E） 超薄切片中に関心領域を識別するために、サンプルを傾けると切片の角度を調整するために、嗅覚ピット、目、グレー白質の境界を含め、中および脳の周りに容易に識別できる解剖学的構造を使用してください。 シングルスロットL2×1銅グリッド（ 図1F）、上のマウント部は、格子バーによって中断されることなく、取得を可能にします。セクションをサポートするためにホルムバールコーティングされたグリッドを使用してください。 対照的な グリッド上のステイン超薄切片別の2分16レイノルズクエン酸鉛、続いてメタノール中の2％酢酸ウラニルで2分間秒。 2.画像​​取得 大規模STEM 注：私たちは、STEM検出を用いた高解像度3,5,7,17 ​​で、ビューの複数の大規模なフィールドを取得することができる外部スキャン発生器をスキャンEMを使用しています。典型的に、一つの画像は、この方法はかなりのステッチの量を減少させる、〜100透過型電子顕微鏡（TEM）画像の視野に相当する生成されました。 顕微鏡でサンプルをマウントします 複数のグリッドサンプルホルダ内のセクションにグリッドを配置し、SEMのチャンバーに移します。 STEM検出器のアライメント ビームの下でサンプルとグリッドを入れて、それは約になりますので、それを上に移動。レンズポールから5ミリメートル。使用して20 kVので画像を取得レンズ内検出器。 グリッドのエッジに集中し、4.0ミリメートルに作動距離を調整します。 安全な位置に試料ホルダーを移動し、STEM検出器をもたらします。 インレンズ検出器を用いて、最大速度で撮像しながら調整ネジを回すことで、画像フィールドにSTEM検出器の穴を中央に配置します。 慎重にちょうどレンズの極と検出器との間に収まるように試料ホルダーを戻します。 断面積になるようにしてくださいするには、レンズ検出器を用いて画像を取得します。 スイッチは検出（利得媒質と「マイナス」に設定されているすべての象限）をSTEMと画像を取得し、スキャンする領域を選択します。 21 kVのに加速電圧を上げて（再び安定した画像）ビームの安定化を待ってから、2 kVのステップで29 kVのに行きます。 画像を取得します サンプルを予め照射ズーミングによって、（電子ビームによる輝度の変化を防止するため）スキャンする完全な領域ので、外画像ウィンドウにフィットします。 （検出器利得が1ステップを小さくする必要があり、適切なダイナミックレンジを維持するために）120μmの開口部を変更します。 デフォーカス画像がぼやけるようにします。 小面積のスキャンオプションを使用して、可能な限りタイトな走査領域を作成します。 フレームは、約に走査されるように設定されたスキャン速度。 1から2秒。 注意：サイズや組織に応じこれは、一般的に取る½時間（100×100μmのFOV）を最大3時間（千×500ミクロン）に。 少なくとも100Xでのズームと10秒間小さな領域をスキャンします。 注：この領域は、その周囲の、照射前に比べて明るさを変更しない場合には、十分なものです。 30μmの開口部を連れ戻す（とメディア益をSTEM） サンプルを集中します。 ワブラー（〜40,000Xの倍率で）を使用して、開口部の位置を合わせます。 焦点で最も明るいエリア/機能を選択しながら、スキャン速度を設定するような詳細こと表示されています。 顕微鏡ソフトウェアで慎重にダイナミックレンジ内のすべてのピクセルを維持するためにヒストグラムを見ながら明るさとコントラストを調整します。最も暗いエリア/機能についても同じ操作を行います。 明るい領域に戻り、もう一度確認してください。ヒストグラムの両側にいくつかのスペースがあるので、安全側にあります。 スキャンする完全な領域が撮像窓に合うようにズームアウト、および大面積取得プログラムを起動します。 画面からエリアを選択して、モザイクを設定するためのウィザードオプションを使用します。詳細は必要であるかに応じて、5 nmの – ピクセルサイズ2を使用してください。 STEMのための滞留時間を3マイクロ秒を使用してください。 オプションを選択 "前のタイル上のオートフォーカス」、「実行前に設定を確認します」とどこにデータを保存するために定義する]チェックボックスをオンにし、デフォルトの会社の設定で大規模な収集ソフトウェアのオートフォーカスを使用しています。 押して、顕微鏡の設定を確認するために「最適化」。 注：今必要な時間は、SHになります自分の。これは、1×0.5ミリメートルの領域の場合は最大72時間であるかもしれません。 ウィンドウ「最大タイル解像度」タイプ20,000ので、個々のタイルは鈍いエッジ効果を防止することで、x 20K 20Kよりも大きくなりません。押して「実行」。 フォーカス、明るさ/コントラスト（B / C）をチェックするように求められたときは、外部スキャン発電機のスイッチをオフにし、慎重に顕微鏡ソフトウェアにフォーカスし、非点収差を調整します。 B / Cを変更しないでください。 注：ステージを移動することができ、倍率が変更されたが、倍率はバック所望の画素サイズに設定する必要があります。 再び外部スキャン発生器のスイッチを押し、「継続」。 3.データ解析大規模EMファイルビューアプログラムを開き、ファイル "モザイク情報」を開きます。これは、すべてのタイル張りのTIF-ファイルを開きます。これは、好ましくは、新たな取得を妨げないように、別のワークステーション上で実行されます。 オプション 'AUを選択してください（パラメータは、ズーム、場合ステッチ基準は満たすことができない。閾値0.90、自動ノイズリダクションをステッチ、半分にモードをオーバーラップし、手動位置にタイルを配置し、「そのまま続ける」をクリックしてください）​​全体モザイクをステッチします。 htmlファイルとして書き出すか、あるいは単一TIFなど。 TIFのための縮小が必要となる可能性があるエクスポートすることに注意してください。後で測定を可能にする、ファイル名の最後のピクセルサイズを含めます。 画像編集プログラムでそれを開くことにより、TIFファイルに注釈を実行します。並行して、最適な分解能観察用のWebブラウザでズーム可能なhtmlファイルを開きます。