Grootschalige Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) van gezonde en beschadigde hersenen zebravis
Summary
Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury.
Abstract
Grootschalige 2D-elektronenmicroscopie (EM), of nanotomy, is het weefsel-brede toepassing van nanoschaal resolutie elektronenmicroscopie. Anderen en we eerder toegepast op grote schaal EM op de menselijke huid pancreaseilandjes, weefselkweek en hele zebravis larven 1-7. Hier beschrijven we een universeel toepasbare methode voor het weefsel schaal scanning EM voor onpartijdige detectie van sub-cellulaire en moleculaire kenmerken. Nanotomy werd op de gezonde en neurodegeneratieve hersenen zebravis onderzoeken. Onze werkwijze is gebaseerd op de gestandaardiseerde EM monstervoorbereiding protocollen: fixatie met glutaraldehyde en osmium, gevolgd door epoxy hars inbedding, ultradunne snijden en monteren van ultradunne secties in-één-hole netten, gevolgd door na kleuring met uranyl en lood. Grootschalige 2D EM mozaïek beelden werden met behulp van een scanning EM aangesloten op een externe grote oppervlakte scan generator middels scanning transmissie EM (STEM). Grootschalige EM beelden zijn meestal ~ 5-50 G pixels in de grootte en het best bekeken met behulp van zoomable HTML-bestanden, die kunnen worden geopend in een webbrowser, vergelijkbaar met online geografische HTML kaarten. Deze methode kan worden toegepast (humaan) weefsel, doorsneden van hele dieren en weefselkweek 1-5. Hier werden zebravis hersenen geanalyseerd op een niet-invasieve neuronaal ablatie model. We visualiseren binnen een enkele dataset weefsel, cellulaire en subcellulaire veranderingen die kunnen worden gekwantificeerd in verschillende celtypes, waaronder neuronen en de microglia, macrofagen de hersenen. Bovendien nanotomy maakt de correlatie van EM met lichtmicroscopie (CLEM) 8 op hetzelfde weefsel als grote oppervlakken eerder afgebeeld met behulp van fluorescentiemicroscopie vervolgens kan worden onderworpen aan een groot gebied EM, resulterend in de nano-anatomie (nanotomy) van weefsels. In totaal nanotomy maakt onpartijdige detectie van faciliteiten in EM niveau in een weefsel-brede kwantificeerbare wijze.
Introduction
Recente technische ontwikkelingen hebben de veelzijdigheid, toepasbaarheid en kwantitatieve aard van EM verbeterd, wat leidt tot een opleving van ultrastructurele analyse. Voorschotten omvatten 3D EM, grootschalige 2D EM en verbeterde methoden en reagentia voor gecorreleerde lichtmicroscopie en elektronenmicroscopie (CLEM) naar andere vormen van microscopische analyse te vergelijken rechtstreeks naar de EM-niveau 8-10. Grootschalige 2D EM is bijzonder geschikt te kwantificeren of te identificeren (roman) ziekte functies voor humane pathologie, studeren diermodellen voor de ziekte en weefselkweek modellen. Vanwege de gewoonlijk kleine gezichtsveld moeilijk om veranderingen bij een sterke vergroting te correleren aan een weefsel niveau, alsmede unbiasedly en kwantitatief analyseren ultrastructurele kenmerken.
Voor pathologische analyse van menselijk weefsel of de beoordeling van de pathologie in diermodellen, hematoxyline en eosine (H & E) gekleurde delen van formaldehyde gefixeerd paraffine ingebedde (FFPE) tisSue is de norm. Naast eenvoudige H & E kleuring immunokleuring wordt ook uitgevoerd pathologische afwijkingen te identificeren. Als dergelijke weefsels kunnen worden geanalyseerd op het niveau EM specifieke celtypen, en subcellulaire veranderingen kunnen worden geïdentificeerd. De onpartijdige aard van grootschalige EM maakt het vinden van onverwachte en nieuwe kenmerken van de ziekte. Door grootschalige EM gebieden tot vierkante millimeter kunnen worden gevisualiseerd. Wij en anderen eerder toegepaste nanotomy om pancreaseilandjes 4 rat, celkweek 2, rattenhersenen 3, huid en slijmvliezen 7 en hele zebravis larven 1,5 (www.nanotomy.org). Zebravis zijn zeer geschikt voor in vivo beeldvorming, in het bijzonder op celtypen die moeilijk toegankelijk zijn in zoogdierlijke weefsels zoals hersenen immuuncellen 11 visualiseren. Hier nanotomy de procedure wordt in detail beschreven, toegepast op coronale secties van zebravis heads ondergaan voorwaardelijke neuronale ablatie door omzetting van metronidazol door neuronaleuitgedrukt nitroreductase (www.nanotomy.org) 5,12-14. Alle ruwe data wordt gepresenteerd als zoomable HTML-bestanden, het visualiseren van moleculaire tot weefsel schaal verandert. De presentatie van de ruwe data maakt onpartijdige analyses van de datasets vanuit andere invalshoeken door experts over de hele wereld.
Protocol
Representative Results
Discussion
EM maakt analyse van de cellulaire context met hoge resolutie beeldvorming van macromoleculen in biologische context. Nochtans beperkt dit typisch het gezichtsveld. Grotere schaal 3D EM is in het bijzonder geschikt voor het in kaart brengen van neuronale verbindingen door het creëren nanoschaal resolutie 3-dimensionale reconstructies, vereisen complexe gegevensverwerking 10. Daarentegen 2D grootschalige EM vereist slechts één sectie en stikken van de beeldgegevens, en evaluatie van de gegevens kan door iedereen met toegang tot een internetbrowser. Wij en anderen voorheen grootschalige EM weefsels en gehele dieren analyseren. Zoals voor de meeste benaderingen, TEM en SEM-gebaseerde stitching hebben hun eigen voordelen. Hier, scanning transmissie EM (STEM) werd gebruikt die generatie van een groot gezichtsveld maakt het mogelijk met een hoge resolutie. Kenmerkend beeld een STEM is gelijk aan het gezichtsveld van ongeveer 100 TEM beelden aanzienlijk verminderen van de hoeveelheid stiksel bij beeldvorming grote fields gezien met een hoge resolutie. Als hogere resolutie vereist is, kunnen TEM voordelig zijn. STEM heeft het voordeel boven TEM dat niet-contrast monsters kunnen worden gebruikt met goede ultrastructurele contrast 6.
Daarnaast kan de hier beschreven werkwijze eenvoudig worden aangepast voor gebruik met terugverstrooide elektronen detectie (BSD) op gedeelten aangebracht op silica wafers, bredere inzet van meerdere microscoopsystemen. HTML-zoomable weefsel EM-bestanden zijn zeer nuttig voor het kwantificeren, het delen van gegevens die niet zijn geanalyseerd om de volledige inhoud, een combinatie van LM en EM data (CLEM) 8, presentatie doeleinden in het wetenschappelijk onderzoek naar de patiënt te analyseren en voor het onderwijs. Als alternatief, in grootschalige EM in een SEM, maar niet in een TEM, silica wafers kunnen worden gebruikt, waarbij twee voordelen heeft: BSD kan worden gebruikt, die meer in het algemeen op rasterelektronenmicroscoop dan STEM detectie. Ten tweede, de montage van grote delen (> 1 mm 2 gebieden vanrente) is eenvoudig. Montage op enkele sleuven grids is arbeidsintensief en technisch uitdagend. Gedetailleerde vergelijking tussen TEM, SEM en STEM wordt elders 6 gedetailleerd. Een nadeel van BSD beeldvorming is dat, in vergelijking met STEM, afbeeldingen zijn toegenomen lawaai. Dit kan ten dele worden gecompenseerd door verhoging van de pixel verblijftijd resulteert in veel langere opnametijden.
Hoewel voor de monstervoorbereiding relatief standaard EM verwerking (fixatie, inbedden en snijden) nodig 5-7 is het technisch moeilijk om grote ultradunne coupes totaal geen artefacten gesneden. Secties zijn erg kwetsbaar, gemakkelijk breken, vouwen of worden vernietigd tijdens de beeldvorming, die doorgaans duurt meerdere uren per dataset. Vanwege het online delen van de ruwe onpartijdige data, zou het mogelijk worden om gemakkelijker te vergelijken met gepubliceerde gegevens en gebruik dataset gepubliceerd in het open domein als controles. Op dit moment, enkele EM-apparaten in staat laRGE-schaal analyse in gebruik zijn, en dus de toegankelijkheid van deze techniek is enigszins beperkt, hoewel de meeste imaging centra gezamenlijke inspanningen van harte welkom.
Voor grootschalige luiken bevat weefsel door het monster goed zijn bevestigd. Daarom is een mengsel van de snelle maar matige PFA fixatief wordt gebruikt in combinatie met de langzame maar sterk fixeermiddel GA. Snijden en het oppakken van grote delen zonder artefacten is moeilijk. Werken met wafels in combinatie met BSD is eenvoudiger in vergelijking met het verzamelen van hoofdstukken over een gat grids. Heavy metal na kleuring is kritischer ten opzichte van de klassieke EM. Omdat de hele sectie wordt afgebeeld zullen elke artefact zichtbaar. TEM gebruikers vinden meestal moeilijk om naar een SEM, vanwege het verschil in werking microscoop.
Kwantificering en delen van gegevens – Het kwantificeren van subcellulaire kenmerken is moeilijk in enkele EM beelden. De mogelijkheid om in en uit te zoomen op grote schaalbeelden maakt gemakkelijk identificatie van cellen van belang, dat kan worden gevolgd door nanoschaal metingen in de cellen. Deze datasets geven aan dat specifieke celtypen kunnen snel worden geïdentificeerd en gekwantificeerd onpartijdige wijze in deze grote weefselcoupes, gebaseerd op kenmerken detecteerbaar verschillende schalen. Bijvoorbeeld microglia kunnen worden geïdentificeerd op basis van hun morfologie en dichte cytoplasma. Vervolgens, na het inzoomen op de afzonderlijke cellen, nanoschaal subcellulaire en moleculaire kenmerken van deze cellen kan worden gemeten in dezelfde dataset, zoals we eerder toonden voor ER breedte binnen een grootschalig EM weefselkweek dataset 2. Een bijkomend voordeel van nanotomy is dat de hosting van grootschalige datasets online zal toestaan dat anderen de gegevens, misschien voor andere functies te inspecteren, en hun conclusies te trekken over nieuwe hypothese.
CLEM – Naast het faciliteren van kwantitatieve EM, grootschalige EM maakt het makkelijker om het licht Micr correlerenpic etikettering EM level 8. In het onderhavige voorbeeld de aanwezigheid van fagocyterende microglia in een zebravis ablatie model weergegeven. Een belangrijke vraag in de neurowetenschappen is wat de afzonderlijke functies en de bijdragen van microglia en mogelijke andere bronnen van fagocytische en immuuncellen. Vroege EM studies hebben aangetoond subcellulaire onderscheidende kenmerken van microglia ziekte 18. Helaas is het moeilijk om selectief labelen microglia met name in een pathologische omgeving, omdat zij grote overlap met andere immuuncellen in genexpressie, morfologie en functie vertonen. Daarom is het onduidelijk of en wanneer microglia op het ultrastructurele niveau verschillen van immuuncellen uit andere bronnen, waaronder monocyten afgeleide infiltrerende macrofagen. Begrijpen of er ultrastructurele verschillen tussen deze cellen uitgangspunt voor analyse van functionele verschillen toe. De combinatie van selectieve transgene of expressie merkers en CLEM maakt detectie van ultrastructurele functies selectief aan specifieke bevolkingsgroepen.
Diagnose & presentatie en onderwijs – Door het visualiseren van nanoschaal tot microschaal binnen één dataset EM data wordt aanzienlijk vergemakkelijkt voor een breed publiek. Met de toegenomen mogelijkheden en instrumenten voor correlatieve en grootschalige EM verwachten we een herleving van EM in fundamenteel en medisch onderzoek. Onze methode hier voorgesteld wordt toegevoerd aan een zebravis hersentraumamodel 5, maar is gebruikt op menselijk weefsel 7, rattenhersenen 3, in een diermodel voor diabetes 4 en in celkweek 2, en kan ook worden gebruikt in combinatie met een TEM gebaseerde benadering 1 toont de veelzijdigheid van deze methode. De microscoop operator is niet meer de opname sterk geselecteerd, en dus bevooroordeeld beelden, maar al talrijke ultrastructurele functies worden geregistreerd en geopend voor de wereldwijde analyse.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De meerderheid van het werk is uitgevoerd op het UMCG Microscopie en Imaging Center (UMIC), die wordt gesponsord door NWO en ZonMW 175-010-2009-023 91.111.006; STW "Microscopie Valley 12718" naar BNGG. Dit werk werd gesponsord door een ZonMW VENI-subsidie, een Marie Curie carrière integratie subsidie (besparing stervende neuronen) en een Alzheimer Nederland fellowship aan TJvH
Materials
| Chemicals | |||
| Low melting point agarose | VWR | 444152G | |
| tricaine | Sigma | E10521 | |
| Triton- X-100 | Sigma | X100 | |
| glutaraldehyde | Polysciences | 1909 | |
| Sodium cacodylate | Sigma | C0250 | |
| osmiumtetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19114 | |
| potassiumferrocyanide (K4[Fe(CN)]6) | Merck | 4984 | |
| ethanol | VWR | 20821.365 | |
| uranyl acetate | Merck | 8473 | |
| sodiumtetraborate | Merck | 1063808 | |
| Tolduidene blue | Merck | 1273 | |
| Basic Fuchsin | BDH | 340324 | |
| Lead citrate | BDH | discontinued | |
| EPON | |||
| 2-dodecenylsuccinicacid anhydride | Serva | 20755 | |
| methylnadic anhydride | Serva | 29452 | |
| glycid ether 100 | Serva | 21045 | |
| DMP-30 | Polysciences | 553 | |
| Standard flat embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70901 | |
| diamond knife | Diatome Inc. | ||
| copper grids | Electron Microscopy Sciences | ||
| double sided carbon tape | Electron Microscopy Sciences | ||
| Scanning EM Zeiss Supra55 | Zeiss | ||
| ultramicrotome Leica EM UC7 | Leica | ||
| Atlas external scan generator | Fibics |
References
- Faas, F. G., et al. Virtual nanoscopy: generation of ultra-large high resolution electron microscopy maps. J Cell Biol. 198, 457-469 (2012).
- Kuipers, J., et al. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Res. 360, 61-70 (2015).
- Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Lindsey, L. F., Harris, K. M. Automated transmission-mode scanning electron microscopy (tSEM) for large volume analysis at nanoscale resolution. PLoS One. 8, e59573 (2013).
- Ravelli, R. B., et al. Destruction of tissue, cells and organelles in type 1 diabetic rats presented at macromolecular resolution. Sci Rep. 3, 1804 (2013).
- van Ham, T. J., et al. Intravital correlated microscopy reveals differential macrophage and microglial dynamics during resolution of neuroinflammation. Dis Model Mech. 7, 857-869 (2014).
- Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 15477, 202-207 (2015).
- Sokol, E., et al. Large-Scale Electron Microscopy Maps of Patient Skin and Mucosa Provide Insight into Pathogenesis of Blistering Diseases. J Invest Dermatol. 135, 1763-1770 (2015).
- de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: Ultrastructure lights up! Nat Methods. Nat Methods. 12, 503-513 (2015).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12, 51-54 (2015).
- Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500, 168-174 (2013).
- Oosterhof, N., Boddeke, E., van Ham, T. J. Immune cell dynamics in the CNS: Learning from the zebrafish. Glia. 63, 719-735 (2015).
- van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment. Curr Biol. 22, 830-836 (2012).
- Davison, J. M., et al. Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish. Dev Biol. 304, 811-824 (2007).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 13365-13370 (2009).
- van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB J. 24, 4336-4342 (2010).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J Cell Biol. 17, 208-212 (1963).
- Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Harris, K. M. Large-volume reconstruction of brain tissue from high-resolution serial section images acquired by SEM-based scanning transmission electron microscopy. Methods Mol Biol. 950, 253-273 (2013).
- Stensaas, L. J., Reichert, W. H. Round and amoeboid microglial cells in the neonatal rabbit brain. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 119, 147-163 (1971).
- Mori, S., Leblond, C. P. Identification of microglia in light and electron microscopy. J Comp Neurol. 135, 57-80 (1969).
