Numérisation Transmission à grande échelle Electron Microscopy (Nanotomy) de santé et de blessés Zebrafish cerveau

Toutes les expériences avec les larves de poisson zèbre ont été approuvées par le Comité l'expérimentation animale de l'Université de Groningen selon les directives nationales et européennes. Préparation 1. Echantillon Fixation and Embedding Fixation Les larves de poissons dans tricaïne (0,003%) anesthésier ajouté au (NaCl 5 mM , KCl 0,17, 0,33 mM de CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 10 mM HEPES, pH 7,6) E3 de l' eau du poisson zèbre et un test pour la profondeur de l' anesthésie en poussant doucement avec une pointe de pipette 200 pi sous dissection microscope jusqu'à ce que le mouvement ne soit plus détecté (figure 1A). Lors du traitement des échantillons pour EM corrélative après l' acquisition de données d'imagerie in vivo en utilisant confocal ou d' imagerie 2 photons dans 1,8% d' agarose comme décrit, 5,15 fix larves d' agarose en utilisant 4% de PFA dans du PBS contenant du Triton-X-100 (0,05%). Couper les larves d'agarose et le processus deEM à grande échelle 5. Fixer des larves dans du paraformaldehyde frais à 4% dans du PBS contenant du Triton-X-100 (0,05%) pendant 2 heures à la température ambiante dans des tubes en plastique. Note: Les cellules cultivées en culture (in vitro) peut être directement fixé dans du glutaraldéhyde, comme décrit dans l'étape suivante (1.1.1.5). Enlever la solution et ajouter 100 ul de 0,5% de PFA, 2% de glutaraldéhyde (GA), et 0,1 M de cacodylate de sodium (pH 7,4). Conserver une nuit à 4 ° C. échantillons Rincer deux fois dans cacodylate de sodium 0,1 M. Couper les têtes des larves rostrale du cerveau postérieur pour faciliter la pénétration de l'osmium. Utilisez fines seringues / forceps. Postfix larves dans 1% de tétroxyde d' osmium (OSO 4) /1.5% ferrocyanure de potassium (K 4 [Fe (CN) 6]) dans 0,1 M de cacodylate de sodium sur la glace pendant 2 heures et rincer 3 x 5 min dans le double H distillée 2 O. Déshydrater dans l'éthanol par 20 min d'incubation dans des concentrations croissantes d'éthanol (50%, 70%, 3 fois par 100%). Incorporation Préparer une résine époxy selon les recettes standard utilisés dans les laboratoires de EM. Remarque: Nous utilisons une résine époxy comme suit: mélanger 19,8 g glycid éther 100, 9,6 g d'anhydride d'acide 2-dodécénylsuccinique et 11,4 g d'anhydride méthylnadique utilisant un agitateur magnétique. Ajouter 0,5 g DMP-30 (tris- (diméthylaminométhyl) phénol) et mélanger à nouveau. Incuber les larves pendant une nuit dans une résine époxy à 50% dans de l'éthanol (v / v) pendant la rotation (RT). Remplacer dilué résine époxy avec de la résine pure. Incuber pendant 30 min, ajouter résine fraîche à nouveau et incuber pendant 30 min. Encore une fois rafraîchir la résine puis incuber 3 heures à température ambiante, puis 15 min à 58 ° C et un autre 1 heure à température ambiante sous basse pression (200 mbar). Orienter les têtes dans disponibles dans le commerce silicium plat moules d'encastrement sous un microscope de dissection à l'aide d'une aiguille ou d'un cure-dent avec la face antérieure faisant face au côté du moule, ou au besoin (Figure 1B). Polymériser res époxydans la nuit à 58 ° C. Si la résine époxy est encore trop mou permettre un autre jour pour polymériser et durcir à 58 ° C. raideur de test en appliquant une pression en utilisant une pince. Si cela laisse facilement une indentation permettre un autre jour pour polymériser et durcir à 58 ° C. Lorsque l'échantillon est entièrement durci procéder à la coupe et la coupe. Coupez l' excédent de résine des stub en utilisant des lames de rasoir (figure 1B). Sectionnement, contrastante et montage Sectionnement bloc de résine Section époxy en utilisant un ultramicrotome. Utilisez un couteau de verre ou un histoknife de diamant pour couper des sections semithin (500 nm) pour le bleu de toluidine / fuchsine basique (figure 1D) coloration pour détecter le bon positionnement. Transfert semi-minces sections sur des lames microscopiques en les ramasser avec une pipette Pasteur en verre dont la pointe a été fermée par fusion dans une flamme. Sec sur une plaque chauffante uusqu'à pas d'eau est laissé. La coloration pendant 10 secondes avec 1% de bleu de toluidine dans l'eau sur une plaque chaude et, après rinçage à l'eau, aux taches pendant 10 s avec 0,05% de fuchsine basique dans le tétraborate de sodium à 1%. Examiner avec un microscope optique normal à 10X à 40X. Lorsque le site / l' orientation correcte dans le cerveau est atteinte, continuer sectionner le bloc de résine époxy avec un couteau de diamant pour couper des sections ultra – minces (~ 70 nm; figure 1E) Utilisez les structures anatomiques facilement identifiables dans et autour du cerveau, y compris les fosses olfactives, les yeux, les limites de la matière grise-blanche, pour identifier la région d'intérêt pendant ultraminces sectionner et d'ajuster l'angle de coupe lors de l'échantillon est incliné. Section mont sur ​​simple fente grilles L2 x 1 de cuivre (figure 1F), afin de permettre l' acquisition non interrompu par des barres de grille. Utilisez Formvar grilles revêtues pour soutenir les sections. Contrastant coupes ultrafines Tache sur la grilles pendant 2 minutes à 2% d' acétate d'uranyle dans du methanol suivi par Reynolds du citrate de plomb pendant 2 min 16. 2. Image Acquisition Large Scale STEM Remarque: Nous utilisons l' analyse EM avec un générateur de balayage externe capable d'acquérir plusieurs grands champs de vision à haute résolution 3,5,7,17 ​​utilisant la détection de STEM. Typiquement, une image générée de cette manière est équivalente aux champs de vision de 100 ~ microscope électronique à transmission (TEM) images, ce qui réduit considérablement la quantité de couture. Exemple de montage dans Microscope Placer la grille à l'article dans le porte-échantillon de grille multiples et transférer dans la chambre de la SEM. Alignement du détecteur STEM Mettez la grille avec l'échantillon sous le faisceau et le déplacer jusqu'à sorte qu'il sera environ. 5 mm par rapport au pôle de la lentille. Acquérir une image à 20 kV en utilisantle détecteur à lentille. Concentrez sur le bord de la grille et régler la distance de travail à 4,0 mm. Déplacez le porte-échantillon à une position de sécurité et apporter le détecteur STEM. Centrez le trou du détecteur STEM dans le champ de l'image en tournant les ajustements vis en imagerie à vitesse maximale avec le détecteur en verre. Ramener ensuite avec précaution en arrière le porte-échantillon qui vient se loger entre le pôle de lentille et le détecteur. Acquérir une image avec le détecteur en verre pour être sûr d'être sur la zone de section. Passer en STEM détection (milieu de gain et de tous les quadrants fixés sur «moins») et d'acquérir une image et sélectionner la zone à numériser. Augmenter la tension d'accélération de 21 kV et d'attendre la stabilisation du faisceau (image stable à nouveau), puis aller à 29 kV par paliers de 2 kV. Acquisition d' images Pré-irradier l'échantillon (pour éviter les changements de luminosité causés par le e-beam) en zoomantde manière complète la zone à numériser est compatible avec la fenêtre d'image. Changer l'ouverture à 120 um (pour garder la plage dynamique appropriée les gains de détection doivent être réduit une seule étape). De-focus pour que l'image est floue. Faire de la zone balayée aussi serrée que possible en utilisant l'option de balayage de zone réduite. Réglez la vitesse de balayage de telle sorte qu'une image est balayée env. 1 – 2 sec. Remarque: En fonction de la taille et du tissu cela prend généralement ½ h (100 x 100 um FOV) à un maximum de 3 heures (1000 x 500 um). Zoom dans au moins 100X et balayer une petite surface pendant 10 secondes. Remarque: Lorsque cette zone ne change pas la luminosité par rapport à sa pré-irradiation environnante est suffisante. Ramener l'ouverture de 30 pm (et STEM gain sur support) Concentrez l'échantillon. Alignez ouverture à l'aide du wobbler (à ~ 40,000X grossissement). Alors que la mise au point de sélectionner le plus léger zone / fonction, régler la vitesse de balayage de telle sorte que les détailssont visibles. Dans le logiciel de microscope régler la luminosité et le contraste en regardant attentivement l'histogramme de garder tous les pixels dans la plage dynamique. Faites de même pour les plus sombres zone / caractéristiques. Retour à la zone lumineuse et vérifier à nouveau. Soyez sur le côté sécuritaire donc il y a un peu d'espace sur les deux côtés de l'histogramme. Zoom arrière de sorte que la surface à analyser correspond à la fenêtre d'imagerie, et commencer le grand programme d'acquisition de la zone. Utilisez l'option de l'assistant pour configurer une mosaïque en sélectionnant une zone de l'écran. Utiliser la taille du pixel 2-5 nm en fonction de ce que les détails sont nécessaires. Utilisez le temps de séjour de 3 ms pour STEM. Sélectionnez l'option "mise au point automatique sur la tuile précédente", utilisez la grande mise au point automatique du logiciel d'acquisition à grande échelle avec les paramètres de l'entreprise par défaut, la case à cocher "vérifier la mise en avant l'exécution" et définir où enregistrer les données. Appuyez sur "optimiser" pour vérifier les réglages du microscope. Remarque: Maintenant, le temps nécessaire sera shposséder. Cela pourrait être jusqu'à 72 h pour 1 x 0,5 mm zones. Dans la fenêtre de type "résolution de tuiles maximale" 20.000 carreaux de sorte individuels ne seront pas plus grand que 20k x 20k, ce qui empêche les effets de bord contondants. Appuyez sur "exécuter". Lorsqu'on lui a demandé de vérifier focus et Luminosité / Contraste (B / C), éteindre le générateur de balayage externe et ajuster le focus et l'astigmatisme dans le logiciel de microscope avec soin. Ne pas changer B / C. Remarque: L'étape peut être déplacé et le grossissement changé, mais le grossissement doit être en retrait à la taille de pixel souhaitée. Allumez le générateur de balayage externe à nouveau et appuyez sur "continuer". Analyse 3. Données Ouvrez programme de visualisation fichier EM à grande échelle et ouvrez le fichier "info mosaïque". Cela permettra d'ouvrir tous les fichiers TIF-carrelées. Ceci est de préférence réalisé sur un autre poste de travail pour ne pas gêner les nouvelles acquisitions. Choisissez l'option "aupour assembler toute la mosaïque (paramètres chevauchent le mode sur la moitié, couture seuil de 0,90, la réduction automatique du bruit. Dans le cas des critères de couture ne peuvent pas être remplies, zoom et placez manuellement la tuile en position et cliquez sur "Continuer comme cela est '). Exporter sous forme de fichier html, ou encore comme un seul TIF. Notez que pour les TIF exporter un downscaling pourrait être nécessaire. Inclure la taille de pixel finale dans le nom de fichier permettant des mesures plus tard. Effectuer des annotations dans le fichier TIF en l'ouvrant dans un programme de retouche d'image. En parallèle, ouvrez le fichier html zoomable dans un navigateur web pour l'observation de la résolution optimale.