סריקה הילוכים בקנה מידה גדול מיקרוסקופית אלקטרונים (Nanotomy) של בריאה ונפצעו דג הזברה המוח
Summary
Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury.
Abstract
במיקרוסקופ אלקטרונים 2D בקנה מידה גדול (EM), או nanotomy, הוא יישום רחב-רקמה במיקרוסקופ אלקטרונים ברזולוציה של ננו. אחרים ואנחנו בעבר להחיל EM בקנה מידה הגדול כדי איי לבלב עור אנושיים, תרבות רקמות 1-7 זחלי דג זברה כולה. כאן אנו מתארים שיטה ישימה אוניוורסלי עבור EM סריקה בקנה מידת רקמות לגילוי משוחד של תכונות תת-תאיות ומולקולריות. Nanotomy יושמה לחקור את בריא מוח דג זברה ניווניות. השיטה שלנו מבוססת על פרוטוקולי הכנת מדגם סטנדרטיים EM: קיבוע עם glutaraldehyde ו אוסמיום, ואחריו הטבעה אפוקסי-שרף, Ultrathin חתך הרכבת סעיפי Ultrathin על רשתות אחד גומות, ואחריו פוסט מכתים עם uranyl ועופרת. תמונות פסיפס בקנה מידה גדולה 2D EM נרכשות באמצעות סריקה EM מחובר גנרטור סריקת שטח גדול חיצוני באמצעות EM שידור סריקה (STEM). תמונות EM בקנה מידה גדולה הן בדרך כלל ~ 5 – 50 פיקסלים G iגודל n, ו נראה במיטבו באמצעות קבצי HTML zoomable, אשר ניתן לפתוח בכל דפדפן אינטרנט, בדומה מפות HTML גיאוגרפיות באינטרנט. שיטה זו יכולה להיות מיושמת (אדם) רקמה, חתכים של חיות שלמות כמו גם בתרבית רקמת 1-5. כאן, מוח דג זברה נותח מודל אבלציה עצבי לא פולשנית. אנו לדמיין בתוך רקמה במערך יחידה, סלולרית, שינויי subcellular אשר ניתן לכמת בסוגי תאים שונים, כוללים נוירונים microglia, מקרופאגים של המוח. בנוסף, nanotomy הופך לפשוט את המתאם של EM עם מיקרוסקופ אור (קלם) 8 באותו רקמות, כמו שטח פנים גדול צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעבר, יכול להיות כפופים להם ובהמשך EM שטח גדול, וכתוצאה מכך את האנטומיה ננו (nanotomy) של רקמות. בסך הכל, nanotomy מאפשר זיהוי משוחדת ב- רמת EM באופן לכימות-רחב רקמות.
Introduction
התפתחויות טכניות אחרונות שפרו את צדדיות, תחולת טבע כמותי של EM, שמובילה התעוררות של ניתוח ultrastructural. התקדמות כוללת 3D EM, EM 2D בקנה מידה גדול שיטות משופרות ריאגנטים עבור במיקרוסקופ אלקטרוני מיקרוסקופיה אור בקורלציה (קלם) כדי להשוות מצבים אחרים של ניתוח מיקרוסקופי ישר לרמת EM 8-10. 2D EM בקנה מידה גדולה מתאים במיוחד לכמת או לזהות (רומן) תכונות מחלת לפתולוגיה אדם, ללמוד במודלים של בעלי חיים עבור מודלי תרבות מחלה ורקמות. בשל השדה בדרך כלל קטן מבט קשה להתאים את השינויים בהגדלה גבוהה בקנה מידה רחב רקמות, כמו גם unbiasedly וכמותית לנתח תכונות ultrastructural.
לקבלת ניתוח פתולוגי של רקמה אנושית או הערכת פתולוגיה במודלים של בעלי חיים, haematoxylin ו eosin (H & E) בצבע קטעי פרפין פורמלין קבוע מוטבע (FFPE) tisסו היא התקן. חוץ מזה פשוט immunolabeling צביעת H & E מבוצע גם לזהות חריגויות פתולוגי. אם רקמות כזה יכול להיות מנותח ברמה EM, סוגי תאים מסוימים, ושינויים subcellular ניתן היה לזהות. האופי המוטה של EM בקנה מידה הגדול מאפשר מציאת תכונות צפויות רומן של מחלה. חלקי פנים בקנה מידה גדולה באזורי EM עד מילימטרים רבועים ניתן דמיינו. אנחנו ואחרים בעבר להחיל nanotomy להלשין איי לבלב 4, תרבות 2 תאים, עכברוש מוח 3, עור ובריריות 7 וזחלי דג זברה שלמים 1,5 (www.nanotomy.org). דג הזברה מתאימה מאוד עבור in vivo הדמיה, ב במיוחד לדמיין סוגי תאים אשר קשה גישה ברקמות יונקות כולל תאי חיסון מוח 11. הנה הליך nanotomy מתואר בפירוט, להחיל סעיפי עטרה של ראשי דג זברה שעברו אבלציה עצבית ממותנת על ידי מרה של metronidazole ידי עצביnitroreductase הביע (www.nanotomy.org) 5,12-14. כל הנתונים הגולמיים מוצג כקבצי HTML zoomable, הדמיה מולקולרית לשינויים בהיקף רקמות. הצגת הנתונים הגולמיים מאפשרת ניתוחים משוחדים של מערכי נתונים מזוויות אחרות על ידי מומחים ברחבי העולם.
Protocol
Representative Results
Discussion
EM מאפשר ניתוח של קשר הסלולר עם הדמיה ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולות בהקשר ביולוגי. עם זאת, זה בדרך כלל מגביל את שדה הראייה. גדולה בקנה המידה 3D EM מתאימה במיוחד קישוריות עצבית מיפוי ידי יצירה ברזולוציה של ננו 3 שחזורים ממדיים, המחייבות עיבוד נתונים מורכבים 10. לעומת זאת, EM בקנה מידה גדול 2D דורש סעיף ורקמה אחת בלבד של הנתונים הדמיה, והערכה של נתונים ניתן על ידי מי שיש לו גישה אל דפדפן אינטרנט. אנו ואחרים השתמשו בעבר EM בקנה מידה הגדול כדי לנתח רקמות חיות שלמות. באשר ביותר תפרי הגישות, TEM ו- SEM מבוססים יש יתרונות משלהם. הנה, סריקת השידור EM (STEM) שמש המאפשר דור של שדה גדול של השקפה ברזולוציה גבוהה. בדרך כלל, תמונת STEM אחד שווה בתחומים לאור כ -100 תמונות TEM, צמצום משמעותי את כמות התפרים כאשר הדמית fiel הגדולds מבט ברזולוציה גבוהה. אם ברזולוציה גבוהה יותר יש צורך, TEM עשוי להיות יתרון. STEM יש יתרון על פני TEM כי דגימות הלא בניגוד ניתן להשתמש עם ניגודיות ultrastructural טוב 6.
בנוסף, השיטה המתוארת כאן יכולה להיות מותאמת פשוט לשימוש עם זיהוי אלקטרוני גב מפוזר (BSD) על חלקים רכובים על פרוסות סיליקה, הרחבת השימוש במערכות מיקרוסקופ מרובות. קבצי HTML-zoomable רקמות EM הם מאוד שימושיים עבור כימות, שיתוף נתונים שעשויים לא נותחו לתוכן המלא שלה, שילוב LM ונתוני EM (קלם) 8, לצרכי הצגה במחקר מדעי, לנתח נתונים מטופלים, ושל חינוך. לחלופין, ב EM בקנה מידה גדולה בתוך SEM, אך לא TEM, ופלי סיליקה יכולים לשמש, אשר יש שני יתרונות עיקריים: BSD ניתן להשתמש, וזה יותר זמין בדרך כלל על מיקרוסקופי אלקטרוני סורק אבחון גזע. שנית, הרכבה של חלקים גדולים (> 1 מ"מ 2 תחומיםהריבית) היא פשוטה. הרכבה על רשתות יחידות מחוררות היא עבודה אינטנסיביות מאתגרת מבחינה טכנית. השוואה מפורטת בין TEM, SEM ו STEM מפורטת במקומות אחרים 6. חסרון של הדמית BSD הוא, לעומת הגזע, תמונות גדלו רעש. זה יכול להיות מתוגמל באופן חלקי על ידי הגדלת זמן להתעכב פיקסל, וכתוצאה מכך פעמים הרכישה עוד זמן רב.
למרות להכנת מדגם עיבוד EM סטנדרטי יחסית (קיבעון, הטבעה ו חתך) נדרש 5-7, זה מאתגר מבחינה טכנית כדי לחתוך חלקים ultrathin גדול נטול לחלוטין של חפצים. מדורים הם שבירים מאוד, בקלות לשבור, לקפל או נהרסים במהלך ההדמיה, אשר בדרך כלל לוקח שעות מרובות בכל מערך נתונים. עם זאת, בגלל השיתוף המקוון של הנתונים המשוחדים הגלם, זה צריך להיות אפשרי להשוות ביתר קלות נתונים שפורסמו, ולהשתמש במערך שפורסם התחום הפתוח כקבוצת ביקורת. נכון לעכשיו, כמה מכשירי EM מסוגל להrge בקנה מידה ניתוח נמצאים בשימוש, ולכן הנגישות טכניקה זו היא מוגבלת במידה מסוימת, אם כי מרכזי הדמיה ביותר בברכה שיתופי פעולה.
עבור חלקים גדולים הרקמה צריכה להיות קבועה כראוי ברחבי המדגם. זו הסיבה תערובת של מקבע מהר אבל מתונה PFA משמש בשילוב עם מקבע איטי אבל חזק GA. חיתוך להרים חלקים גדולים בלי לכלוכים קשה. עבודה עם פרוסות בשילוב עם BSD קל לעומת איסוף חלקים על רשתות חור אחד. מכתים פוסט רוק כבד יותר קריטי לעומת EM קלאסית. מאז הקטע השלם הוא צלם כל חפץ יהיה גלוי. משתמשים TEM בדרך כלל מתקשים לעבור SEM, בגלל השוני במבצע מיקרוסקופ.
כימות ושיתוף נתונים – כימות תכונות subcellular קשה בתמונות יחידות EM. האפשרות להתקרב ולהתרחק של בקנה מידה גדולתמונות בקלות מאפשרות זיהוי של תאים בעלי עניין, אשר יכול להיות מלווה מדידות ננו בתוך התאים. מערכי נתונים אלו מעידים כי סוגי תאים מסוימים ניתן לזהות במהירות לכמת בצורה משוחדת לחלקים גדולים של הרקמה אלה בהתבסס על תכונות לזיהוי בקני מידה שונים. לדוגמה microglia ניתן לזהות המבוססת על המורפולוגיה שלהם הציטופלסמה צפופה. בהמשך לכך, על התקרבות על תאים בודדים, תכונות subcellular ומולקולרית ננומטריים של תאים אלה ניתן למדוד בתוך אותו בסיס הנתונים, כפי שהראנו קודם לכן עבור רוחב ER בתוך בסיס הנתונים בתרבית רקמה EM בקנה מידה גדול 2. יתרון נוסף של nanotomy הוא כי האירוח של מערכי נתונים בקנה מידה גדולים באינטרנט יאפשר לאחרים לבדוק את הנתונים, אולי עבור תכונות אחרות, ולהסיק המסקנות שלהם על השערה חדשה.
קלם – בנוסף להקל EM כמותי, EM בקנה מידה גדול מקל לתאם microsco אורתיוג תמונות כדי EM ברמה 8. בדוגמא הנוכחית בנוכחות microglia phagocytic במודל אבלציה דג זברה מוצגת. שאלה מרכזית במדעי המוח היא מה פונקציות פרט התרומות הן של המיקרוגליה ממקורות אחרים פוטנציאל של phagocytic ותאי חיסון. מחקרי EM מוקדמים הראו תכונות subcellular ייחודיות של microglia במחלה 18. למרבה הצער, קשה לתייג microglia סלקטיבי ובמיוחד אם זה יעשה פתולוגי, כפי שהם מציגים חפיפה גדולה עם תאים חיסוניים אחרים ביטוי גנים, מורפולוגיה ותפקוד. לכן, לא ברור אם ומתי microglia ברמת ultrastructural נבדל תאים חיסוניים ממקורות אחרים כולל מונוציטים הנגזרים שחדר מקרופאגים. הבנה אם קיימים הבדלי ultrastructural בין תאים אלה יספקו נקודת התחלה עבור ניתוח של הבדלים תפקודיים. שילוב סמנים מהונדס או ביטוי סלקטיבי קלם מאפשר detשיקוף של תכונות ultrastructural סלקטיבית לאוכלוסיות ספציפיות.
אבחון & מצגת וחינוך – עצם העובדה שאנו רואים ננומטריים כדי microscale בתוך נתונים EM במערך יחיד הוא הקל מאוד לקהל הרחב. עם מגוון אפשרויות וכלים המוגברים EM גומל בקנה מידה גדול אנו צופים התעוררות של EM במחקר בסיסי רפואי. השיטה שלנו מיוצג כאן מוחל מודל פגיעה מוחית דג הזברה 5, אבל נעשה שימוש על רקמה אנושית 7, עכברוש המוח 3, במודל חולדה לסוכרת 4 וב תרבית תאים 2, והוא יכול לשמש גם בשילוב עם TEM גישה מבוססת 1 מראה את הרבגוניות של שיטה זו. מפעיל מיקרוסקופ כבר לא הקלטה שנבחר מאוד, ולכן תמונות מוטות, אבל כל תכונות ultrastructural הרבות נרשמות ופתוחות לניתוח ברחבי עולם.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
רוב העבודה שבוצע במרכז המיקרוסקופי והדמית UMCG (UMIC), אשר ממומן על ידי NWO 175-010-2009-023 ו ZonMW 91,111,006; STW "עמק מיקרוסקופי 12718" כדי BNGG. עבודה זו מומנה על ידי מענק ZonMW Veni, מענק אינטגרציה הקריירה מארי קירי (חיסכון למות נוירונים) ו המילגה אלצהיימר Nederland כדי TJvH
Materials
| Chemicals | |||
| Low melting point agarose | VWR | 444152G | |
| tricaine | Sigma | E10521 | |
| Triton- X-100 | Sigma | X100 | |
| glutaraldehyde | Polysciences | 1909 | |
| Sodium cacodylate | Sigma | C0250 | |
| osmiumtetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19114 | |
| potassiumferrocyanide (K4[Fe(CN)]6) | Merck | 4984 | |
| ethanol | VWR | 20821.365 | |
| uranyl acetate | Merck | 8473 | |
| sodiumtetraborate | Merck | 1063808 | |
| Tolduidene blue | Merck | 1273 | |
| Basic Fuchsin | BDH | 340324 | |
| Lead citrate | BDH | discontinued | |
| EPON | |||
| 2-dodecenylsuccinicacid anhydride | Serva | 20755 | |
| methylnadic anhydride | Serva | 29452 | |
| glycid ether 100 | Serva | 21045 | |
| DMP-30 | Polysciences | 553 | |
| Standard flat embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70901 | |
| diamond knife | Diatome Inc. | ||
| copper grids | Electron Microscopy Sciences | ||
| double sided carbon tape | Electron Microscopy Sciences | ||
| Scanning EM Zeiss Supra55 | Zeiss | ||
| ultramicrotome Leica EM UC7 | Leica | ||
| Atlas external scan generator | Fibics |
References
- Faas, F. G., et al. Virtual nanoscopy: generation of ultra-large high resolution electron microscopy maps. J Cell Biol. 198, 457-469 (2012).
- Kuipers, J., et al. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Res. 360, 61-70 (2015).
- Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Lindsey, L. F., Harris, K. M. Automated transmission-mode scanning electron microscopy (tSEM) for large volume analysis at nanoscale resolution. PLoS One. 8, e59573 (2013).
- Ravelli, R. B., et al. Destruction of tissue, cells and organelles in type 1 diabetic rats presented at macromolecular resolution. Sci Rep. 3, 1804 (2013).
- van Ham, T. J., et al. Intravital correlated microscopy reveals differential macrophage and microglial dynamics during resolution of neuroinflammation. Dis Model Mech. 7, 857-869 (2014).
- Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 15477, 202-207 (2015).
- Sokol, E., et al. Large-Scale Electron Microscopy Maps of Patient Skin and Mucosa Provide Insight into Pathogenesis of Blistering Diseases. J Invest Dermatol. 135, 1763-1770 (2015).
- de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: Ultrastructure lights up! Nat Methods. Nat Methods. 12, 503-513 (2015).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12, 51-54 (2015).
- Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500, 168-174 (2013).
- Oosterhof, N., Boddeke, E., van Ham, T. J. Immune cell dynamics in the CNS: Learning from the zebrafish. Glia. 63, 719-735 (2015).
- van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment. Curr Biol. 22, 830-836 (2012).
- Davison, J. M., et al. Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish. Dev Biol. 304, 811-824 (2007).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 13365-13370 (2009).
- van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB J. 24, 4336-4342 (2010).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J Cell Biol. 17, 208-212 (1963).
- Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Harris, K. M. Large-volume reconstruction of brain tissue from high-resolution serial section images acquired by SEM-based scanning transmission electron microscopy. Methods Mol Biol. 950, 253-273 (2013).
- Stensaas, L. J., Reichert, W. H. Round and amoeboid microglial cells in the neonatal rabbit brain. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 119, 147-163 (1971).
- Mori, S., Leblond, C. P. Identification of microglia in light and electron microscopy. J Comp Neurol. 135, 57-80 (1969).
