Крупномасштабное Сканирование просвечивающей электронной микроскопии (Nanotomy) здоровых и оскорбленные данио мозга

Все эксперименты с данио личинок были одобрены экспериментирования животных комитета Университета Гронингена в соответствии с национальными и европейскими руководящими принципами. 1. Подготовка образцов Закрепление и встраивание фиксация Анестезировать личинок рыб в Tricaine (0,003%) добавляется к E3 (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl 2, 0,33 мМ MgSO 4, 10 мМ HEPES, рН 7,6) данио воды и испытание для глубины анестезии тыкая осторожно не с 200 мкл кончика пипетки под микроскопом рассечение , пока движение больше не обнаруживается (рис 1А). При обработке образцов для корреляционного EM после получения в данных естественных изображений с помощью конфокальной или изображений 2 фотона в 1,8% агарозном , как описано, 5,15 личинки фикс в агарозе с использованием 4% PFA в ФБР , содержащем Triton-X-100 (0,05%). Вырезать личинок из агарозы и процессакрупномасштабная EM 5. Закрепить личинок в свежем 4% параформальдегида в PBS, содержащем Triton-X-100 (0,05%) в течение 2 ч при комнатной температуре в пластиковых пробирках. Примечание: Клетки , выращенные в культуре (in vitro) может быть непосредственно закреплен в глутаровый альдегид, как описано на следующей стадии (1.1.1.5). Удалить раствор и добавляют 100 мкл 0,5% PFA, 2% глутаральдегида (GA) и 0,1 М какодилате натрия (рН 7,4). Хранить в течение ночи при температуре 4 ° С. Полоскание образцы дважды в какодилате 0,1 М натрия. Обрежьте личиночной головы ростральным в мозге для облегчения проникновения осмия. Используйте тонкие шприцы / пинцета. Личинки Postfix в 1% осмия (OsO 4) /1.5% ферроцианида калия (K 4 [Fe (CN) 6]) в 0,1 М какодилате натрия на льду в течение 2 ч и сполоснуть 3 х 5 мин в бидистиллированной H 2 O. Высушить в этаноле при 20 мин инкубирования в возрастающих концентрациях этанола (50%, 70%, 3 раза в 100%). Вложение Подготовка эпоксидной смолы в соответствии со стандартными рецептами, используемых в лабораториях EM. Примечание: Мы используем эпоксидной смолы следующим образом: смешивают 19,8 г glycid эфир 100, 9,6 г ангидрида 2-додеценилянтарная кислоты и 11,4 г methylnadic ангидрида с использованием магнитной мешалки. Добавьте 0,5 г DMP-30 (трис- (диметиламинометил) фенол) и снова перемешать. Выдержите личинок в течение ночи в 50% эпоксидной смолы в этаноле (об / об) при вращении (RT). Заменить разбавленный эпоксидных смол с чистой смолой. Инкубировать в течение 30 мин, добавить свежую смолу снова и инкубировать в течение еще 30 мин. Опять же обновить смолу, а затем инкубируют 3 ч при комнатной температуре, а затем 15 мин при 58 ° C и еще в течение 1 ч при комнатной температуре при низком давлении (200 мбар). Сориентируйте головы в коммерчески доступных кремниевых встраиванию плоские формы под микроскопом рассечение с помощью иглы или зубочистки с передней обращенной к стороне формы или по мере необходимости (Фигура 1В). Полимеризуется эпоксидные Резв течение ночи при 58 ° C. Если эпоксидная смола еще слишком мягкая позволяют еще один день полимеризуется и затвердевает при 58 ° C. Испытание жесткости, применяя давление с помощью щипцов. Если это легко оставляет отступы позволяют другой день полимеризуется и затвердевает при 58 ° C. Когда образец полностью отвержденного приступить к подрезки и секционирования. Срежьте лишнюю смолу из заглушек с помощью лезвия бритвы (рис 1B). Секционирование, Контрастные и монтирование секционирование Блок смолы Раздел эпоксидной смолы с использованием ультрамикротомом. Используйте стеклянную нож или алмазный histoknife сократить полутонких секции (500 нм) для толуидиновым синий / основного фуксина (рис 1D) окрашивания для обнаружения правильного позиционирования. Передача полу-тонкие срезы на микроскопических слайдов, выбирая их с стеклянной Пастера пипеткой наконечник которого был закрыт путем плавления в пламени. Сушить на горячей плите ˙Until воды не осталось. Окрашивают в течение 10 сек с 1% толуидиновым синим в воде на горячей плите, и после промывки водой, морилку в течение 10 сек с помощью 0,05% основного фуксина в 1% тетраборат натрия. Осмотрите с нормальным световым микроскопом при 10х до 40х. Когда надлежащее место / ориентации в головном мозге достигается, по- прежнему секционирования блок эпоксидной смолы с помощью алмазного ножа вырезать ультратонких срезов (~ 70 нм; рис 1E) Используйте легко идентифицируемых анатомических структур внутри и вокруг головного мозга, в том числе обонятельных ямок, глаз, границы серо-белого вещества, чтобы определить область интереса во время ультратонкие секционирования и для регулировки угла секционирования, когда образец наклонен. Крепление секции на однослотовых L2 х 1 медные сетки (рис 1F), чтобы обеспечить бесперебойное приобретение сетевыми баров. Используйте формвар сетки с покрытием для поддержки секций. Контрастные Пятно ультратонкие срезы на сеткеs в течение 2 мин в 2% ацетата уранила в метаноле с последующим Рейнольдс цитратом свинца в течение еще ​​2 мин 16. 2. Получение изображения Крупномасштабная STEM Примечание: Мы используем EM сканирования с генератором внешнего сканирования , способного приобрести несколько больших полей зрения при высоком разрешении 3,5,7,17 ​​с помощью функции обнаружения STEM. Как правило, одно изображение генерируется таким образом эквивалентно полях зрения ~ 100 просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) изображений, значительно уменьшая количество стежков. Пример монтажа в микроскоп Поместите сетку с сечением в множественным держателе образца сетки и передать в камеру РЭМ. Выравнивание детектора STEM Поместите сетку с образцом под балкой и переместить его вверх так будет ок. 5 мм от полюса объектива. Приобретать изображение при 20 кВ с использованиемв-линзе детектора. Фокус на сетке края и настроить рабочее расстояние до 4,0 мм. Переместите держатель образца в безопасное положение и принести в детекторе STEM. Сосредоточьте отверстие детектора STEM в изображении поля, поворачивая Регулировки винты во время формирования изображения на максимальной скорости с детектором в-объективом. Осторожно вернуть держатель образца, который будет соответствовать только между объективом полюса и детектором. Приобретать изображение с помощью детектора в линзы, чтобы быть уверенным, что на площади сечения. Переключение в режим обнаружения (STEM усиливающую среду и все квадранты, установленные на "минус") и получить изображение и выберите область для сканирования. Повышение ускоряющего напряжения до 21 кВ и ждать стабилизации луча (стабильного изображения снова), а затем перейдите к 29 кВ с шагом 2 кВ. Получение изображений Предварительно облучать образец (для предотвращения изменения яркости, вызванные электронным пучком) путем увеличения масштабатак, в полной области для сканирования соответствует окно изображения. Изменение диафрагмы до 120 мкм (для поддержания надлежащего динамического диапазона коэффициенты усиления детектора должен быть уменьшен на один шаг). Де-фокус, чтобы изображение размыто. Сделайте область сканирования как можно туго с помощью опции сканирования уменьшенной площади. Заданная скорость сканирования таким образом, что кадр сканируется в прибл. 1 – 2 сек. Примечание: В зависимости от размера и ткани это, как правило, занимает ½ ч (FOV мкм 100 х 100), чтобы до 3 ч (1000 х 500 мкм). Увеличение по крайней мере, 100х и отсканировать небольшую область в течение 10 сек. Примечание: Если эта область не изменяется яркость по сравнению с его окрестности, дорадиационного достаточно. Верните диафрагму в 30 мкм (и STEM прибыль от среды) Фокус образца. Совместите отверстие с помощью воблера (при ~ 40,000X увеличении). В то время как в фокусе выбрать легкий область / функцию, установите скорость сканирования таким образом, что деталивидны. В программном обеспечении микроскопа регулировать яркость и контрастность, внимательно наблюдая за гистограмму, чтобы сохранить все пиксели в динамическом диапазоне. Сделайте то же самое для темной области / функций. Вернитесь к яркой области и проверьте еще раз. На всякий стороне, таким образом есть некоторое пространство на обеих сторонах гистограммы. Уменьшить поэтому полная область сканирования подходит окно изображения, и запустить большую программу приобретения площадь. С помощью опции мастера, чтобы создать мозаику, выбрав область с экрана. Используйте размер пикселя 2 – 5 нм в зависимости от того, какие детали необходимы. Используйте Выдержка времени 3 мкс для щупов. Выберите опцию "автофокусировка на предыдущей плитки", использовать большие масштабы приобретения программного обеспечения автофокусировку с настройками по умолчанию компании, установите флажок "проверить настройки перед выполнением" и определить, где для сохранения данных. Нажмите кнопку "оптимизации" для проверки параметров микроскопа. Примечание: Теперь время, необходимое будет шсвоя. Это может быть до 72 ч в течение 1 х 0,5 мм областях. В окне типа "максимальное разрешение плитки" 20000 так что отдельные плитки не будет больше, чем 20k 20k х, предотвращая тупых краевых эффектов. Нажмите кнопку "выполнить". Когда его спросили, для проверки фокусировки и яркости / контрастности (B / C), выключите генератор внешнего сканирования и тщательно настроить фокус и астигматизма в программном обеспечении микроскопа. Не следует изменять B / C. Примечание: Ступень может быть перемещен и увеличение изменилось, но увеличение должно быть установлено обратно до нужного размера пикселя. Включите генератор внешнего сканирования еще раз и нажмите "Продолжить". 3. Анализ данных Открыть крупномасштабную EM файл программы просмотра и откройте файл "мозаичную данные". Это позволит открыть все плиточные TIF-файлы. Это предпочтительно выполняется на другой рабочей станции, чтобы не перекрывать новые приобретения. Выберите опцию 'а.е.сшить всю мозаику (параметры режима перекрытия на половину, сшивая порог 0,90, снижение уровня шума автоматически. В случае, если критерии сшивание не может быть выполнено, увеличивать и уменьшать масштаб вручную поместить плитку в нужном положении и нажмите кнопку "Продолжить как есть"). Экспорт как HTML-файл, или в качестве альтернативы в качестве единого TIF. Обратите внимание, что для TIF экспортировать разукрупнение может понадобиться. Включите окончательный размер пикселя в имени файла позволяя производить измерения позже. Выполните аннотации в TIF файл, открыв его в программе редактирования изображений. Параллельно с этим, откройте файл масштабируемой HTML в веб-браузере для оптимального наблюдения разрешения.