Su larga scala scansione microscopia elettronica a trasmissione (Nanotomy) di sana e feriti Zebrafish Cervello
Summary
Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury.
Abstract
Su larga scala di elettroni 2D microscopia (EM), o nanotomy, è l'applicazione a livello dei tessuti della microscopia elettronica risoluzione nanometrica. Altri e abbiamo precedentemente applicati EM su larga scala a pelle umana isole pancreatiche, coltura di tessuti e tutta larve di zebrafish 1-7. Qui si descrive un metodo universalmente applicabile per la scansione dei tessuti scala EM per la rilevazione imparziale delle caratteristiche sub-cellulari e molecolari. Nanotomy è stata applicata per indagare il sano e un cervello zebrafish neurodegenerativa. Il nostro metodo si basa su protocolli di preparazione del campione standardizzati EM: Fixation con glutaraldeide e osmio, seguita da embedding resina epossidica, ultrasottile sezionamento e montaggio di ultrasottili-sezioni di griglie di un foro, seguita da colorazione con posta uranile e piombo. Su larga scala le immagini 2D EM mosaico vengono acquisite utilizzando una scansione EM collegato ad un generatore di un'ampia area di scansione esterna usando EM trasmissione scansione (STEM). Su larga scala le immagini EM sono in genere ~ 5 – 50 G pixel Idimensione n, e ottimizzato per l'utilizzo di file HTML zoomabile, che possono essere aperti in qualsiasi browser web, simili a carte geografiche HTML on-line. Questo metodo può essere applicato al tessuto (umano), sezioni trasversali di animali interi nonché coltura tissutale 1-5. Qui, cervelli zebrafish sono stati analizzati in un modello di ablazione neuronale non invasivo. Visualizziamo all'interno di un unico tessuto set di dati, cellulare e subcellulare cambiamenti che può essere quantificato in vari tipi di cellule, tra cui i neuroni e microglia, i macrofagi del cervello. Inoltre, nanotomy facilita la correlazione di EM con microscopia ottica (CLEM) 8 sul tessuto stesso, come grandi superfici precedentemente ripreso con microscopia a fluorescenza, può essere successivamente sottoposto a grande area EM, conseguente nano-anatomia (nanotomy) di tessuti. In tutto, nanotomy permette la rilevazione imparziale di funzioni a livello EM in maniera quantificabile a livello dei tessuti.
Introduction
Recenti sviluppi tecnici hanno migliorato la versatilità, l'applicabilità e la natura quantitativa di EM, che porta a una rinascita di analisi ultrastrutturale. I progressi includono 3D EM, su larga scala 2D EM e metodi migliorati e reagenti per correlato luce microscopia e microscopia elettronica (CLEM) per confrontare altre modalità di analisi microscopica direttamente al livello EM 8-10. Su larga scala 2D EM è particolarmente adatto per quantificare o identificare (romanzo) caratteristiche della malattia di patologia umana, lo studio di modelli animali per i modelli di malattia e di coltura dei tessuti. A causa tipicamente piccolo campo di vista è difficile correlare i cambiamenti ad alto ingrandimento ad una vasta scala di tessuto, nonché unbiasedly e quantitativamente analizzare caratteristiche ultrastrutturali.
Per l'analisi patologica di tessuto umano o la valutazione della patologia in modelli animali, ematossilina e eosina (H & E) colorato sezioni di formaldeide paraffina fisso incorporato (FFPE) tisSue è lo standard. Oltre semplice colorazione H & E immunomarcatura viene eseguita anche per identificare le anomalie patologiche. Se tali tessuti possono essere analizzate a livello EM, specifici tipi cellulari, e potrebbero essere identificati modifiche subcellulari. La natura imparziale della EM larga scala permette di trovare caratteristiche inaspettate e nuove di malattia. In larga scala aree em up a millimetri quadrati possono essere visualizzati. Noi e gli altri in precedenza nanotomy di ratto isole pancreatiche 4, coltura cellulare 2, cervello di ratto 3, della pelle e delle mucose 7 e tutto larve di pesce zebra 1,5 (www.nanotomy.org) applicato. Zebrafish sono molto adatto per l'imaging in vivo, in particolare per visualizzare tipi di cellule che sono di difficile accesso nei tessuti dei mammiferi compreso cerebrali cellule immunitarie 11. Qui la procedura nanotomy è descritta in dettaglio, applicato a sezioni coronali di teste zebrafish sottoposti condizionale ablazione neuronale mediante conversione di metronidazolo da neuronaleespresso nitroreduttasi (www.nanotomy.org) 5,12-14. Tutti i dati grezzi si presenta come file HTML zoomabile, la visualizzazione molecolare per cambiamenti di scala dei tessuti. La presentazione dei dati grezzi permette analisi imparziali di set di dati provenienti da altre angolazioni da parte di esperti di tutto il mondo.
Protocol
Representative Results
Discussion
EM permette l'analisi del contesto cellulare con imaging ad alta risoluzione delle macromolecole in contesto biologico. Tuttavia, questo limita tipicamente il campo visivo. Scala più ampia 3D EM è particolarmente adatto per la connettività mappatura neuronale con la creazione di risoluzione nanometrica 3 ricostruzioni tridimensionali, che richiedono un trattamento di dati complessi 10. Al contrario, 2D su larga scala EM richiede solo una singola sezione e cucitura dei dati di imaging, e la valutazione dei dati è possibile da chiunque abbia accesso ad un browser Internet. Noi e gli altri utilizzati in precedenza EM su larga scala per analizzare i tessuti e animali interi. Per quanto riguarda la maggior parte degli approcci, TEM e cuciture SEM-based non hanno i loro vantaggi. Qui, la trasmissione scansione EM (STEM) è stato utilizzato che consente la generazione di un ampio campo visivo ad alta risoluzione. In genere, una sola immagine STEM è equivalente ai campi di vista di circa 100 immagini TEM, riducendo in modo significativo la quantità di cucitura quando l'imaging grande fields di vista ad alta risoluzione. Se è necessaria una maggiore risoluzione, TEM può essere vantaggioso. STEM ha il vantaggio rispetto TEM che i campioni non contrastata possono essere utilizzati con un buon contrasto ultrastrutturale 6.
Inoltre, il metodo descritto qui può essere regolato semplicemente per l'uso con il rilevamento elettronico ridiffusa (BSD) su sezioni montate su wafer di silicio, ampliando l'uso di più sistemi microscopio. Tessuti HTML-stradale file EM sono molto utili per la quantificazione, la condivisione di dati che non possono essere stati analizzati per il contenuto completo, che unisce LM e dati EM (CLEM) 8, scopo di presentazione nella ricerca scientifica, per analizzare i dati dei pazienti, e per l'istruzione. In alternativa, in EM larga scala in un SEM, ma non in un TEM, wafer silice può essere usato, che ha due vantaggi principali: BSD può essere utilizzato, più generalmente disponibile sui microscopi a scansione elettronica di STEM rilevamento. In secondo luogo, il montaggio di grandi sezioni (> 1 mm 2 aree diinteressi) è semplice. Montaggio su griglie a fessura singoli è laborioso e tecnicamente impegnativo. Confronto dettagliato tra TEM, SEM e STEM è dettagliato altrove 6. Uno svantaggio di immagini BSD è che, rispetto al gambo, le immagini sono aumentati del rumore. Questo può essere in parte compensato aumentando il tempo di permanenza del pixel, con conseguente tempi di acquisizione più lunghi.
Anche se per la preparazione dei campioni di elaborazione relativamente standard EM (fissazione, inclusione e sezionamento) è necessaria 5-7, è tecnicamente impegnativo per tagliare grandi sezioni ultrasottili completamente priva di artefatti. Le sezioni sono molto fragili, si rompono facilmente, piegare o vengono distrutti durante l'imaging, che richiede in genere più ore al set di dati. Tuttavia, a causa della condivisione online dei dati grezzi imparziali, dovrebbe diventare possibile confrontare più facilmente i dati pubblicati, e utilizzare set di dati pubblicati nel dominio aperta come controlli. Attualmente, pochi dispositivi in grado di EM laanalisi RGE scala sono in uso, e quindi l'accessibilità a questa tecnica è piuttosto limitata, anche se la maggior parte dei centri di imaging accolgono gli sforzi di collaborazione.
Per le sezioni larga scala il tessuto deve essere fissata correttamente in tutto il campione. Ecco perché una miscela di veloce ma moderata fissativo PFA è usato in combinazione con la lenta ma forte fissativo GA. Taglio e raccogliendo grandi sezioni senza artefatti è difficile. Lavorare con le cialde in combinazione con BSD è più facile rispetto alla raccolta sezioni su griglie singole buche. Heavy post di metallo colorazione è più critica rispetto a EM classica. Poiché l'intera sezione viene esposta ogni manufatto sarà visibile. utenti TEM tipicamente trovano difficoltà a passare ad un SEM, a causa della differenza di funzionamento microscopio.
La quantificazione e la condivisione dei dati – Quantificare caratteristiche subcellulari è difficile in singole immagini EM. La possibilità di ingrandire e rimpicciolire su larga scalaimmagini permette facilmente l'identificazione delle cellule di interesse, che possono essere seguiti da misurazioni su scala nanometrica all'interno delle cellule. Questi set di dati indicano che specifici tipi di cellule possono essere rapidamente identificati e quantificati in modo imparziale in questi grandi sezioni di tessuto, sulla base di caratteristiche rilevabili a scale diverse. Per esempio microglia possono essere identificati in base alla loro morfologia e citoplasma denso. Successivamente, dopo lo zoom sulle singole cellule, su scala nanometrica caratteristiche subcellulari e molecolari di queste cellule possono essere misurati all'interno dello stesso insieme di dati, come abbiamo dimostrato in precedenza per la larghezza ER all'interno di una grande scala del tessuto EM cultura dataset 2. Un ulteriore vantaggio del nanotomy è quello di hosting di set di dati di grandi dimensioni in linea permetterà ad altri di esaminare i dati, forse per altre funzioni, e trarre le conclusioni sulla nuova ipotesi.
CLEM – Oltre a facilitare EM quantitativa, EM larga scala rende più facile da correlare microsco luceetichettatura pic a livello EM 8. Nel presente esempio è mostrato la presenza di microglia fagocitiche in un modello di ablazione zebrafish. Una questione importante nel campo delle neuroscienze è quello che le singole funzioni e contributi sono di microglia e potenziali altre fonti di fagocitosi e di cellule immunitarie. I primi studi EM hanno dimostrato caratteristiche distintive subcellulare di microglia nella malattia 18. Purtroppo, è difficile etichettare selettivamente microglia in particolare in un ambiente patologico, in quanto presentano un'ampia sovrapposizione con altre cellule immunitarie nella espressione genica, la morfologia e la funzione. Pertanto, non è chiaro se e quando microglia a livello ultrastrutturale differiscono dalle cellule immunitarie da altre fonti, monociti infiltranti derivato macrofagi. Capire se ci sono differenze ultrastrutturali tra queste cellule forniranno un punto di partenza per l'analisi delle differenze funzionali. La combinazione di marcatori transgenici o l'espressione selettiva e CLEM permette detezione di caratteristiche ultrastrutturali selettive per specifiche popolazioni.
Diagnosi e la presentazione e l'educazione – Visualizzando nanoscala a microscala all'interno di un unico set di dati di dati EM è notevolmente facilitato ad un vasto pubblico. Con l'aumento delle possibilità e gli strumenti per EM correlativa e su larga scala ci aspettiamo una ripresa di EM nella ricerca di base e medica. Il nostro metodo qui rappresentata viene applicato ad un modello di lesione cerebrale zebrafish 5, ma è stato usato il tessuto umano 7, cervello di ratto 3, in un modello di ratto per il diabete 4 e in coltura cellulare 2, e può essere utilizzato anche in combinazione con un TEM approccio basato il 1 mostra la versatilità di questo metodo. L'operatore al microscopio non è più la registrazione altamente selezionati, e le immagini, quindi, di parte, ma tutte le numerose caratteristiche ultrastrutturali sono registrati e aperto per l'analisi di tutto il mondo.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La maggior parte del lavoro è stata eseguita presso la all'UMCG Microscopia e Imaging Center (UMIC), che è sponsorizzato da NWO 175-010-2009-023 e ZonMw 91.111.006; STW "Microscopia Valley 12718" per BNGG. Questo lavoro è stato sponsorizzato da una sovvenzione ZonMw VENI, una borsa di studio di integrazione carriera Marie Curie (risparmio morendo neuroni) e una borsa di Alzheimer Nederland a TJvH
Materials
| Chemicals | |||
| Low melting point agarose | VWR | 444152G | |
| tricaine | Sigma | E10521 | |
| Triton- X-100 | Sigma | X100 | |
| glutaraldehyde | Polysciences | 1909 | |
| Sodium cacodylate | Sigma | C0250 | |
| osmiumtetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19114 | |
| potassiumferrocyanide (K4[Fe(CN)]6) | Merck | 4984 | |
| ethanol | VWR | 20821.365 | |
| uranyl acetate | Merck | 8473 | |
| sodiumtetraborate | Merck | 1063808 | |
| Tolduidene blue | Merck | 1273 | |
| Basic Fuchsin | BDH | 340324 | |
| Lead citrate | BDH | discontinued | |
| EPON | |||
| 2-dodecenylsuccinicacid anhydride | Serva | 20755 | |
| methylnadic anhydride | Serva | 29452 | |
| glycid ether 100 | Serva | 21045 | |
| DMP-30 | Polysciences | 553 | |
| Standard flat embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70901 | |
| diamond knife | Diatome Inc. | ||
| copper grids | Electron Microscopy Sciences | ||
| double sided carbon tape | Electron Microscopy Sciences | ||
| Scanning EM Zeiss Supra55 | Zeiss | ||
| ultramicrotome Leica EM UC7 | Leica | ||
| Atlas external scan generator | Fibics |
References
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