Sağlıklı ve Yaralı Zebra balığı Beyin büyük ölçekli Tarama Transmisyon Elektron Mikroskobu (Nanotomy)
Summary
Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury.
Abstract
Büyük ölçekli 2D elektron mikroskobu (EM), ya da nanotomy, nano ölçekli çözünürlük elektron mikroskobu doku çapında bir uygulamadır. Diğer ve daha önce insan derisi pankreatik adacıklar, doku kültürü ve bütün zebra balığı larvası 1-7 büyük ölçekli EM uygulanır. Burada alt-hücresel ve moleküler özelliklerinin tarafsız tespiti için doku ölçekli tarama EM için evrensel olarak uygulanabilir bir yöntem açıklanmaktadır. Nanotomy sağlıklı ve nörodejeneratif zebra balığı beyin araştırmak için uygulanmıştır. Bizim yöntemi standart EM numune hazırlama protokolleri dayanmaktadır: Fiksasyon gluteraldehit ve osmiyum ile, epoksi reçine gömme ardından kesit ve uranil ve kurşun post boyanması ve ardından tek delikli ızgaralar üzerinde ultra ince kesitlerin, montaj ultra ince. Büyük ölçekli 2D EM mozaik görüntüleri EM tarama iletim EM (STEM) kullanarak harici bir geniş alan tarama jeneratöre bağlı bir tarama kullanılarak elde edilir. 50 G piksel i – Büyük ölçekli EM görüntülerin genellikle ~ 5 vardırn boyutu ve en iyi online coğrafi HTML haritalarına benzer herhangi bir web tarayıcısında açılabilir yakınlaştırılabilen HTML dosyaları, kullanarak inceledi. Bu yöntem, (insan), doku, çapraz Bütün hayvanlar bölümleri hem de doku kültürü 1-5'e uygulanabilir. Burada, zebrafish beyinler non-invaziv nöronal ablasyon modelinde analiz edildi. Biz nöronlar ve mikroglia, beynin makrofajlar dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde ölçülebilir bir hücresel tek veri kümesi doku ve hücre içi değişiklikler içinde görselleştirmek. Büyük yüzey alanı, daha önce görüntülü Buna ek olarak, nanotomy floresan mikroskopi kullanılarak, aynı doku ışık mikroskobu (Clem) EM korelasyonunu 8 kolaylaştıran, daha sonra nano anatomisi (nanotomy) arasında ortaya çıkan, geniş bir alan EM tabi tutulabilir dokular. Toplamda, nanotomy bir doku çapında ölçülebilir bir şekilde EM düzeyinde özelliklerin tarafsız algılanmasını sağlar.
Introduction
Son teknik gelişmeler ultrastrüktürel analiz canlanma lider, EM çok yönlülük, uygulanabilirliğini ve nicel doğa düzeldi. Gelişmeler doğrudan EM seviyesine 8-10 mikroskobik analiz diğer modları karşılaştırmak için 3D EM, büyük ölçekli 2D EM ve ilişkili ışık mikroskobu ve elektron mikroskobu (CLEM) için geliştirilmiş yöntemler ve belirteçler bulunmaktadır. Büyük ölçekli 2D EM ölçmek ve insan patoloji (yeni) hastalığı özelliklerini belirlemek, hastalık ve doku kültürü modelleri için hayvan modelleri çalışma özellikle uygundur. Nedeniyle görünüm genellikle küçük alanı ile bir doku, geniş ölçekli yüksek büyütme değişiklikleri ilişkilendirmek için, hem de tarafsız bir ve kantitatif ultrastrüktürel özellikleri analiz etmek zordur.
İnsan doku ya da hayvan modellerinde, patoloji değerlendirmesi, hematoksilin ve eozin (H & E) renkli gömülü formaldehid sabit parafin kesitleri (FFPE) tis patolojik analizi içinsue standarttır. Basit yanı sıra H & E boyama immün da patolojik anormallikleri tespit etmek için yapılır. Bu dokular EM DÜZEYİ, özel hücre tipleri de analiz edildi ve edilebilseydi hücre içi değişiklik tespit edilememiştir. Büyük ölçekli EM tarafsız doğa hastalığın beklenmedik ve yeni özellikler bulmak sağlar. Büyük ölçekli tarafından milimetre karelik EM alanlar kadar görülebilir. Biz ve diğerleri, daha önce pankreas adacık 4 sıçan nanotomy, hücre kültürü 2, sıçan beyin 3, deri ve mukoza 7 ve tüm Zebra balığı larvaları 1,5 (www.nanotomy.org) uygulanır. Balığı, beyin bağışıklık hücreleri 11 de dahil olmak üzere, memeli dokularında erişilmesi zor olan hücre tipleri görselleştirmek için, özellikle de, in vivo görüntüleme için son derece uygundur. Burada nanotomy prosedürü nöronal ile metronidazol dönüştürülmesiyle koşullu nöronal ablasyon uygulanan zebra balığı kafaları koronal bölümlerine uygulanan ayrıntılı olarak tarif edilmiştirifade nitroredüktaz (www.nanotomy.org) 5,12-14. Tüm ham veri doku ölçekli değişikliklere moleküler görselleştirme, yakınlaştırılabilen HTML dosyaları olarak sunulmaktadır. Ham verilerin sunumu, dünya çapında uzmanlar tarafından diğer açılardan veri setleri tarafsız analizler sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
EM biyolojik bağlamda makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile hücresel bağlam analizi sağlar. Bununla birlikte, bu tipik olarak görüş alanını sınırlar. Büyük ölçekli 3D EM karmaşık veri işleme 10 gerektiren, nano ölçekli çözünürlüğü 3 boyutlu rekonstrüksiyon oluşturarak haritalama nöronal bağlantısı için uygundur. Buna karşılık, 2D büyük ölçekli EM görüntüleme verileri tek bir bölümü ve dikiş gerektirir ve verilerin değerlendirilmesi, bir internet tarayıcısına erişimi olan herkes tarafından mümkündür. Biz ve diğerleri, daha önce dokuları ve bütün hayvanların analiz etmek büyük ölçekli EM kullanılır. En yaklaşımlar, TEM ve SEM-tabanlı dikiş gelince kendi avantajları var. Burada, tarama iletim EM (STEM) yüksek çözünürlükte geniş bir görüş alanının oluşturulmasına imkan olduğu kullanılmıştır. Büyük Yıkıldığı görüntüleme, genellikle, tek bir KÖK görüntü yaklaşık olarak 100 TEM görüntüleri, önemli ölçüde dikiş miktarının azaltılması bakış alanları eşdeğerdiryüksek çözünürlükte bakış DS. Daha yüksek çözünürlük gerekli ise, TEM avantajlı olabilir. KÖK olmayan kontrast örnekler iyi bir ince yapı kontrast 6 kullanılabileceğini TEM üzerinde bir avantaja sahiptir.
Buna ek olarak, burada açıklanan yöntem basitçe bölümler birden mikroskop sistemleri kullanımının yaygınlaştırılmasının, silis gofret üzerine monte geri saçılan elektron algılama (BSD) ile kullanılmak üzere ayarlanabilir. HTML yakınlaştırılabilen doku EM dosyaları hasta verilerini analiz etmek için, bilimsel araştırma LM ve EM verileri (CLEM) 8, sunum amaçlı birleştirerek, tam içeriği analiz edilmemiş olabilir veri paylaşımı ve eğitim, ölçümü için çok yararlıdır. BSD kullanılabilir, daha genel olarak algılama gövdesinden tarama elektron mikroskobu geçerli olan: Seçenek olarak ise, bir SEM büyük ölçekli EM, ancak bir TEM silis gofret iki ana avantajı olan, kullanılabilir. İkincisi, büyük bölümünün (> 1 mm 2 alanlarda montajıfaiz) basittir. Tek yarıklı ızgaraları montaj emek yoğun ve teknik açıdan zor. TEM, SEM ve KÖK arasında ayrıntılı bir karşılaştırma başka bir yerde 6 ayrıntılı. BSD görüntüleme bir dezavantajı, resim gürültü artmıştır, KÖK göre olmasıdır. Bu, kısmen daha uzun alıcı zamanlarda elde edilen piksel kalma süresini arttırmak sureti ile telafi edilebilir.
Numune hazırlama, nispeten standart EM işleme (fiksasyon, gömme ve kesit) için 5-7 ihtiyaç olmasına rağmen, eserleri tamamen yoksun büyük ultra ince bölümleri kesmek için teknik olarak zordur. Bölümler, kolay kırılabilir, çok kırılgan olan kat veya tipik veri kümesi başına birden fazla saat sürer görüntüleme sırasında yok edilir. Ancak, ham tarafsız verilerin çevrimiçi paylaşımı, bu yayınladığı verilere daha kolay karşılaştırmak ve kontrol grubu olarak açık alanda yayınlanan veri kümesi kullanmak mümkün hale gelmelidir. Şu anda, yetenekli la birkaç EM cihazlarırge ölçekli analiz kullanılmakta olan ve çoğu görüntüleme merkezleri işbirlikçi çabaları takdirle karşılıyoruz ama bu nedenle bu tekniği erişilebilirlik, biraz sınırlı.
Büyük ölçekli bölümler için doku doğru, numune boyunca sabit olması gerekmektedir. Bu hızlı ama ılımlı fiksatif PFA bir karışımı yavaş ama güçlü fiksatif GA ile birlikte kullanılır nedeni budur. Kesme ve eserler olmadan büyük bölümleri toplayıp zordur. BSD ile birlikte gofret ile çalışma tek delikli ızgaralar ilgili bölümler toplama kıyasla daha kolaydır. Ağır metal sonrası boyama klasik EM göre daha önemlidir. Bütün bölüm görüntülü beri her obje görünür olacaktır. TEM kullanıcılar genellikle zor, çünkü mikroskop operasyonda farkı, bir SEM geçmek için bulabilirsiniz.
Sayısallaştırılması ve veri paylaşımı – hücre içi özellikleri miktarının tek EM görüntüler zordur. olasılık ve büyük ölçekli uzaklaştırmak içinÇıkan kolaylıkla hücreler içinde nano ölçümü ile takip edilebilir ilgi hücreleri, belirlenmesini sağlar. Bu veri kümeleri belirli hücre tipleri hızla farklı ölçeklerde saptanabilir özelliklere dayalı tespit ve bu büyük doku kesitlerinde tarafsız bir şekilde ölçülebilir olduğunu göstermektedir. Örneğin mikroglia kendi morfolojisi ve yoğun sitoplazmaya dayalı tespit edilebilir. Daha önce büyük ölçekli EM doku kültürü veri kümesi 2 içinde ER genişliği gösterdi Daha sonra, tek tek hücrelerin üzerinde yakınlaştırma üzerine, bu hücrelerin nano ölçekli hücre içi ve moleküler özellikleri, aynı veri kümesi içinde ölçülebilir. nanotomy bir başka avantajı çevrimiçi büyük ölçekli veri setleri barındırma diğerleri belki diğer özellikler için veri incelemek için izin ve yeni hipotez kendi sonuçlara ulaşmak olacaktır.
CLEM – kantitatif EM kolaylaştırılması yanı sıra, büyük ölçekli EM kolay ışık mikroskobik ilişkilendirmek için yaparEM seviyeye 8 pic etiketleme. Bu örnekte, bir zebrabalıkları ablasyon modelinde fagositik mikroglia varlığı gösterilmiştir. nörobilim önemli bir soru, bireysel fonksiyonları ve katkıları mikroglia ve fagositik ve bağışıklık hücrelerinin potansiyel diğer kaynaklardan budur. Erken EM çalışmalar hastalığın 18 mikroglia ayırt edici hücre içi özelliklerini göstermiştir. bu gen ifadesi, morfoloji ve işlev olarak, diğer bağışıklık hücreleri büyük örtüşmeyi sergileyen Ne yazık ki, seçici bir şekilde patolojik bir ortamda, özellikle mikroglia etiket zordur. Bu nedenle, belli olup olmadığı ve ultrastrüktürel düzeyde mikroglia makrofajlar infiltre türetilmiş monosit dahil olmak üzere diğer kaynaklardan bağışıklık hücrelerinin farklı zaman. İşlevsel farklar analizi için bir başlangıç noktası sağlayacaktır bu hücreler arasındaki ultrastrüktürel farklılıklar anlama olup olmadığını. seçici transgenik ya da ifade işaretlerini birleştiren ve CLEM det veriyorultrastrüktürel özellikleri ection belirli nüfusa seçici.
Tanı ve sunum ve eğitim – tek bir veri kümesi EM verileri içinde microscale için nano ölçekli görselleştirme ile büyük ölçüde geniş bir kitleye kolaylaştırılır. bağıntılı ve büyük ölçekli EM artan imkanları ve araçları ile temel ve tıbbi araştırmalarda EM'nin bir canlanma öngörüyoruz. Burada temsil edilen Yöntem A zebrabalıkları beyin yaralanması modeli 5'e uygulanır, ancak diyabet 4 ve hücre kültüründe 2 bir fare modelinde, insan dokusu 7, fare beyni 3 kullanılmaktadır ve aynı zamanda, bir TEM ile kombinasyon halinde de kullanılabilir Bu yöntemin çok yönlülük gösteren tabanlı bir yaklaşım 1. mikroskop operatörü artık çok seçilmiş ve dolayısıyla yanlı görüntüler, ancak tüm sayısız ultrastrüktürel özellikleri kaydedildi ve dünya çapında analiz için açık olan kaydediyor.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
işin çoğunluğu NWO 175-010-2009-023 ve ZonMW 91111006 tarafından desteklenen UMCG Mikroskopi ve Görüntüleme Merkezi (UMIC), en yapılmıştır; BNGG için STW "Mikroskopi Valley 12718". Bu eser, Marie Curie Kariyer entegrasyon hibe (nöronlar ölüyor tasarruf) Bir ZonMW VENI hibe ve TJvH bir Alzheimer Nederland burs sponsor oldu
Materials
| Chemicals | |||
| Low melting point agarose | VWR | 444152G | |
| tricaine | Sigma | E10521 | |
| Triton- X-100 | Sigma | X100 | |
| glutaraldehyde | Polysciences | 1909 | |
| Sodium cacodylate | Sigma | C0250 | |
| osmiumtetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19114 | |
| potassiumferrocyanide (K4[Fe(CN)]6) | Merck | 4984 | |
| ethanol | VWR | 20821.365 | |
| uranyl acetate | Merck | 8473 | |
| sodiumtetraborate | Merck | 1063808 | |
| Tolduidene blue | Merck | 1273 | |
| Basic Fuchsin | BDH | 340324 | |
| Lead citrate | BDH | discontinued | |
| EPON | |||
| 2-dodecenylsuccinicacid anhydride | Serva | 20755 | |
| methylnadic anhydride | Serva | 29452 | |
| glycid ether 100 | Serva | 21045 | |
| DMP-30 | Polysciences | 553 | |
| Standard flat embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70901 | |
| diamond knife | Diatome Inc. | ||
| copper grids | Electron Microscopy Sciences | ||
| double sided carbon tape | Electron Microscopy Sciences | ||
| Scanning EM Zeiss Supra55 | Zeiss | ||
| ultramicrotome Leica EM UC7 | Leica | ||
| Atlas external scan generator | Fibics |
References
- Faas, F. G., et al. Virtual nanoscopy: generation of ultra-large high resolution electron microscopy maps. J Cell Biol. 198, 457-469 (2012).
- Kuipers, J., et al. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Res. 360, 61-70 (2015).
- Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Lindsey, L. F., Harris, K. M. Automated transmission-mode scanning electron microscopy (tSEM) for large volume analysis at nanoscale resolution. PLoS One. 8, e59573 (2013).
- Ravelli, R. B., et al. Destruction of tissue, cells and organelles in type 1 diabetic rats presented at macromolecular resolution. Sci Rep. 3, 1804 (2013).
- van Ham, T. J., et al. Intravital correlated microscopy reveals differential macrophage and microglial dynamics during resolution of neuroinflammation. Dis Model Mech. 7, 857-869 (2014).
- Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 15477, 202-207 (2015).
- Sokol, E., et al. Large-Scale Electron Microscopy Maps of Patient Skin and Mucosa Provide Insight into Pathogenesis of Blistering Diseases. J Invest Dermatol. 135, 1763-1770 (2015).
- de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: Ultrastructure lights up! Nat Methods. Nat Methods. 12, 503-513 (2015).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12, 51-54 (2015).
- Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500, 168-174 (2013).
- Oosterhof, N., Boddeke, E., van Ham, T. J. Immune cell dynamics in the CNS: Learning from the zebrafish. Glia. 63, 719-735 (2015).
- van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment. Curr Biol. 22, 830-836 (2012).
- Davison, J. M., et al. Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish. Dev Biol. 304, 811-824 (2007).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 13365-13370 (2009).
- van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB J. 24, 4336-4342 (2010).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J Cell Biol. 17, 208-212 (1963).
- Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Harris, K. M. Large-volume reconstruction of brain tissue from high-resolution serial section images acquired by SEM-based scanning transmission electron microscopy. Methods Mol Biol. 950, 253-273 (2013).
- Stensaas, L. J., Reichert, W. H. Round and amoeboid microglial cells in the neonatal rabbit brain. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 119, 147-163 (1971).
- Mori, S., Leblond, C. P. Identification of microglia in light and electron microscopy. J Comp Neurol. 135, 57-80 (1969).
