בידוד והתרבות של דג זברה למבוגרי מוח נגזר Neurospheres
Summary
כאן אנו מספקים שיטה לשחזור לבחון neurogenesis למבוגרים באמצעות assay neurosphere נגזר מתוך הכלל המוח או מאחד את telencephalic, tectal או אזורים של המוח הקטן של המוח דג הזברה מבוגר. בנוסף, אנו מתארים את ההליך כדי לתפעל ביטוי גני neurospheres דג הזברה.
Abstract
The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.
Introduction
תאי גזע עצביים יונקים (NSCs) מתאפיינים במבחנה על ידי היכולת שלהם לגדול בתרבויות "פנויות" כאשכולות של חלוקת תאים כינה 1 neurospheres. בנוכחות גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) ו גורם גדילה פיברובלסטים (FGF), NSCs לחלק משני סימטרי ליצור NSCs עצמית חידוש, או סימטרית ליצירת שני תאים בת אחרת, כלומר., תא אב הבחנה ואת רומן המל"ל. תרבויות neurosphere ולכן הם תערובת של תאי גזע / אב עצביים תאים עצביים בדיל יותר 2-4 NSCs עם זאת, ניתן להבחין בין תאים מסוגי neurosphere אחרים על ידי שני מאפיינים ספציפיים:. הם מציגים התחדשות עצמית לטווח ארוך חופשי צף תרבויות והם יכולים להתמיין לכל שושלות תאים עצביים (כלומר, הנוירונים, האסטרוציטים, ו oligodendrocytes) לאחר נסיגת גורמי גדילה הידבקות מצעים תאי מטריקס. בשנת mammals, מערכת תרבות neurosphere הייתה המערכת הראשונה במבחנה משמשת כדי להדגים את הנוכחות של NSCs במוח הבוגר ונשארה הכלי הנפוץ ביותר לנתח התפשטות, התחדשות עצמית קיבולת multipotency של ובתאים ו גזע עצביים. לכן, אף על פי מבחני יוצרים בתחום סובלים מכמה חסרונות ומגבלות 4, מערכת התרבות הזאת היא בעל ערך עבור בהערכת הפוטנציאל של תא להתנהג כתא גזע כאשר ייוסר vivo ב שלה הנישה 4 ו כבר סייע בזיהוי רגולטורים מרכזיים של המל"ל עצמית התחדשות התא גורל קביעת 5-7.
בניגוד ליונקים שהזמינו מוגבל neurogenesis למבוגרים, דג הזברה לייצר נוירונים חדשים constitutively לאורך ציר המוח כולו לאורך כל החיים שלהם. המוח המבוגר דג הזברה מציג מספר נישות נוירוגנית מחסה גזע עצבי / ובתאים עושים דג הזברה אורגניזם מודל עצמה להבנת tהוא גזע פעילות תא במוח כמו גם תוכניות המולקולריות הדרושים לרגנרציה מערכת עצבים מרכזית. במהלך 17 השנים האחרונות, מספר קבוצות מחקר פיתחו מתודולוגיות עבור בידוד culturing תאים עצביים דג הזברה 8,9. מחקרים אלו נועדו לייצר נוירונים עובריים ותאי גלייה במבחנה, אך לא שמירה NSCs ולחקור את תכונותיהם. למרות neurospheres נוצר ב leptorhynchus המבוגר Apteronotus (Knifefish Ghost בראון) 10, assay יוצרי neurosphere של דג הזברה נשאר שיוקם.
כאן אנו מתארים assay יוצרי neurosphere להפגין את התפקיד של miR-107 במהלך הנוירוגנזה דג הזברה 11. הפרוטוקול מאפשר: 1) איסוף תאי גזע / אב עצביים למבוגרים או ממוח דג זברה כולה או מכמה אזורים במוח גזורים כגון telencephalon, את tectum, ואת המוח הקטן; 2) דור floating ו neurospheres עצמית חידוש מתאי גזע / אב מבוגר עצביים; 3) ולמטה ומעלה-רגולציה של ביטוי גנים המקודדים או RNAs ללא קידוד קטן 11 ב neurospheres, על מנת לחקור את תפקידם התפשטות והבחנה של תאי גזע / אב עצביים.
Protocol
Representative Results
Discussion
המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לבודד neurospheres שמופק מהמוח דג הזברה תרבות למבוגרים ללימוד התכונות תאית ומולקולרית של תאי גזע / אב עצביים. כאן אנו מדווחים כיצד לבחור תאים עצביים מולטיפוטנטיים וליצור שלושה סוגי התאים העצביים, כלומר, האסטרוציטים, נוירונים oligodendrocytes,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Guillermina Hill-Teran and Marie-Elise Schwartz for assistance. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (5R00HL105791 to S.N.) and from the Alzheimer (NIRP 12-259162). This work was also supported by Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (CFC and JLT), Agence Nationale de la Recherche (13-BSV4-0002-01 (JLT), NIH (1R01EB016629-01A1 (JLT), Connecticut Stem Cell Research Fund (13-SCA-Yale-04 (JLT).
Materials
| DPBS 1X | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM/F12 1X | Life Technologies | 11330-032 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C6852-25g | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N-2 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 supplement (100x) liquid |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | 1M |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Insulin | Sigma | I5500-50 mg | |
| DNAse | Sigma | DN25-10mg | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| PFA | TCI | P0018 | |
| PBS | AmericanBio | AB11072-04000 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma | A5040 | stock solution of 4 mg/ml. |
| Trycold gel | Sigma | TGP8 | gel pack |
| Amaxa Basic Nucleofector Kit | Lonza | VPI-1004 | |
| Trypan blue stain | Life Technologies | 15250061 |
References
- Rietze, R. L., Reynolds, B. A. Neural stem cell isolation and characterization. Methods Enzymol. 419, 3-23 (2006).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2, 1490-1498 (2007).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 7, 2005-2012 (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8, 486-498 (2011).
- Winter, M., et al. Vertebrate neural stem cell segmentation, tracking and lineaging with validation and editing. Nat Protoc. 6, 1942-1952 (2011).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Ghosh, C., Liu, Y., Ma, C., Collodi, P. Cell cultures derived from early zebrafish embryos differentiate in vitro into neurons and astrocytes. Cytotechnology. 23, 221-230 (1997).
- Chen, Z., et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in zebrafish (Danio rerio). PloS one. 8, e57539 (2013).
- Hinsch, K., Zupanc, G. K. Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis. Neuroscience. 146, 679-696 (2007).
- Ristori, E., et al. A dicer-miR-107 interaction regulates biogenesis of specific miRNAs crucial for neurogenesis. Dev Cell. 32, 546-560 (2015).
- Louis, S. K., SIegel, A. C. Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and Automated Methods. Methods Mol Bio. 740, (2011).
- Harrison, M. M., Jenkins, B. V., O’Connor-Giles, K. M., Wildonger, J. A CRISPR view of development. Genes dev. 28, 1859-1872 (2014).
- Marz, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58, 870-888 (2010).
