Isolierung und Kultur von Adult Zebrafisch brain-derived Neurosphären

Mammalian neurale Stammzellen (NSC) wurden in freischwimmenden Kulturen als Cluster von sich teilende Zellen genannt Neurospheres ¹ in vitro durch ihre Fähigkeit , zu wachsen charakterisiert. In Gegenwart von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), NSC dividieren entweder symmetrisch selbst erneuernden NSC zu erzeugen, oder asymmetrisch zwei verschiedenen Tochterzellen zu erzeugen, dh., Eine differenzierende Vorläuferzelle und eine neuartige NSC. Neurosphere Kulturen sind daher eine Mischung aus neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen und differenzierten neuralen Zellen ^2-4 NSC kann jedoch aus anderen Neurosphäre Zelltypen von zwei spezifischen Eigenschaften unterscheiden:. Sie in Freilangfristigen Selbsterneuerungs anzuzeigen Floating – Kulturen und sie können in allen neuralen Zelllinien (dh Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten) nach Entzug der Wachstumsfaktoren und Adhäsion an extrazelluläre Matrixsubstraten unterscheiden. in mammals die Neurosphärenkultur – System war das erste in – vitro – System verwendet , um die Anwesenheit von NSC im erwachsenen Gehirn zu zeigen , und ist die am häufigsten verwendeten Werkzeug Proliferation, Selbsterneuerungskapazität und Multipotenz von neuralen Stamm- und Vorläuferzellen zu analysieren. Deshalb, auch wenn Kugel bildenden Tests von einigen Nachteilen und Einschränkungen ⁴ ist dieses Kultursystem ist wertvoll für das Potential einer Zelle Auswertung als Stammzelle zu verhalten , wenn sie ⁴ aus seiner in vivo Nische entfernt und hat bei der Identifizierung von Schlüsselregulatoren instrumental von NSC Selbsterneuerung und Zellschicksal Bestimmung ^5-7.

Im Gegensatz zu den Säugetieren, die adulte Neurogenese beschränkt haben, Zebrabärbling produzieren konstitutiv neue Neuronen entlang der gesamten Gehirns Achse während ihrer gesamten Lebensdauer. Der Zebrabärbling erwachsenen Gehirn zeigt mehrere neurogenen Nischen neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen beherbergen ein leistungsfähiges Modellorganismus machen Zebrabärbling t für das Verständniser Stammzellaktivität im Gehirn sowie die molekularen Programme für das zentrale Nervensystem die Regeneration erforderlich. In den letzten 17 Jahren entwickelte sich mehrere Arbeitsgruppen Methoden zur Isolierung und Kultivierung von Zebrabärbling neuralen Zellen ^8,9. Diese Studien wurden bei der Herstellung embryonalen neuronalen und Glia – Zellen , in vitro gerichtet, aber nicht auf NSC Aufrechterhaltung und Untersuchung ihrer Eigenschaften. Obwohl Neurosphären haben im erwachsenen Apteronotus leptorhynchus (Brown – Geist Messerfisch) ^10, ein Neurosphären-Bildungstest in der Zebrabärbling blieb etabliert werden generiert.

Hier beschreiben wir eine Neurosphere-Bildungstest die Rolle der miR-107 während der Zebrabärbling Neurogenese ¹¹ zu demonstrieren. Das Protokoll ermöglicht: 1) die Sammlung von adulten neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen entweder von Zebrabärbling gesamte Gehirn oder aus mehreren seziert Hirnregionen wie das Telencephalon, Tectum und Cerebellum; 2) die Erzeugung von flFlie und selbst erneuernden Neurosphären von adulten neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen; 3) die Down- und Hochregulation der Expression von kodierenden Genen oder kleine nicht-kodierenden RNAs ¹¹ in Neurosphären, um ihre Rollen bei der Proliferation und Differenzierung von neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen zu untersuchen.