العزلة وثقافة Neurospheres المستمدة الدماغ الكبار الزرد
Summary
هنا نقدم طريقة استنساخه لدراسة الخلايا العصبية الكبار باستخدام الفحص neurosphere المستمدة من الدماغ كله أو إما من الدماغ الانتهائي، سقفي أو المناطق المخيخ من الكبار الدماغ الزرد. بالإضافة إلى ذلك، نحن تصف الإجراء لمعالجة التعبير الجيني في neurospheres الزرد.
Abstract
The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.
Introduction
تم التعرف على الثدييات الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) في المختبر عن طريق قدرتها على النمو في الثقافات التعويم الحر كعناقيد تقسيم خلايا تسمى neurospheres 1. في وجود عامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الخلايا الليفية (جمعية جيل المستقبل)، NSCs تنقسم إما بشكل متناظر لتوليد NSCs تجديد الذات، أو غير متماثلة لتوليد خليتين ابنة مختلفة، مثلا، بسبب التمييز خلية سلفية ومجلس الأمن القومي الرواية. لذا الثقافات Neurosphere هي خليط من الخلايا الجذعية / السلف العصبية والخلايا العصبية أكثر متباينة 2-4 NSCs يمكن، مع ذلك، يمكن تمييزها عن غيرها من neurosphere الخلايا أنواع من قبل اثنين من خصائص محددة: لأنها تكشف المدى الطويل التجديد الذاتي في احلرية العائمة الثقافات وأنها يمكن أن تفرق في كل الأنساب الخلية العصبية (أي الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، و oligodendrocytes) بعد الانسحاب من عوامل النمو والانضمام إلى ركائز المصفوفة خارج الخلية. في mammاعتلال الأعصاب الحركية، وكان نظام الثقافة neurosphere أول نظام في المختبر تستخدم للتدليل على وجود NSCs في الدماغ الكبار ويبقى أداة الأكثر استخداما لتحليل الانتشار، والقدرة على التجديد الذاتي وmultipotency الخلايا الجذعية والسلف العصبية. لذلك، على الرغم من المقايسات تشكيل المجال تعاني من بعض العيوب والقصور 4، وهذا النظام الثقافة هو قيمة لتقييم احتمال وجود خلية لتتصرف كما الخلايا الجذعية عند إزالتها من في الجسم الحي المتخصصة (4) وقامت بدور فعال في تحديد الجهات التنظيمية الرئيسية مجلس الأمن القومي التجديد الذاتي ومصير خلية تقرير 5-7.
وعلى النقيض من الثدييات الذين تقتصر تكوين الخلايا العصبية الكبار، الزرد إنتاج خلايا عصبية جديدة بشكل جوهري على طول محور الدماغ كاملة طوال حياتهم. يعرض الدماغ الزرد الكبار متعددة المنافذ العصبية إيواء الجذعية العصبية خلية / السلف جعل الزرد قوية نموذج حي لفهم روقال انه وقف نشاط الخلايا في الدماغ وكذلك برامج الجزيئية المطلوبة لتجديد الجهاز العصبي المركزي. على مدى السنوات ال 17 الماضية، وضعت عدة مجموعات بحثية منهجيات لعزل وزراعة الخلايا العصبية الزرد 8،9. وتهدف هذه الدراسات إلى إنتاج الخلايا العصبية الجنينية والخلايا الدبقية في المختبر، ولكن ليس على الحفاظ على NSCs والتحقيق ممتلكاتهم. على الرغم من neurospheres تم توليدها في Apteronotus leptorhynchus الكبار (براون شبح Knifefish) 10، بقي مقايسة تشكيل neurosphere في الزرد التي سيتم إنشاؤها.
نحن هنا وصف مقايسة تشكيل neurosphere للتدليل على دور مير-107 خلال تكوين الخلايا العصبية الزرد 11. يتيح البروتوكول: 1) مجموعة من الخلايا الجذعية / السلف العصبية الكبار إما من الدماغ كله الزرد أو من عدة مناطق الدماغ تشريح مثل الدماغ الانتهائي، والسقف، والمخيخ. 2) جيل من فلوريداoating وneurospheres تجديد الذات من الخلايا الجذعية / السلف العصبية الكبار. 3) لأسفل ويصل تنظيم التعبير عن الجينات الترميز أو الرنا غير الترميز الصغيرة 11 في neurospheres، من أجل تحقيق دورهم في انتشار وتمايز الخلايا الجذعية / السلف العصبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو عزل وثقافة الكبار neurospheres الزرد المستمدة من الدماغ لدراسة الخصائص الخلوية والجزيئية للخلايا الجذعية / السلف العصبية. هنا، ونحن التقرير كيفية اختيار الخلايا العصبية متعددة القدرات وتوليد أنواع الخلايا العصبية ثلاثة، أي الخلاي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Guillermina Hill-Teran and Marie-Elise Schwartz for assistance. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (5R00HL105791 to S.N.) and from the Alzheimer (NIRP 12-259162). This work was also supported by Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (CFC and JLT), Agence Nationale de la Recherche (13-BSV4-0002-01 (JLT), NIH (1R01EB016629-01A1 (JLT), Connecticut Stem Cell Research Fund (13-SCA-Yale-04 (JLT).
Materials
| DPBS 1X | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM/F12 1X | Life Technologies | 11330-032 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C6852-25g | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N-2 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 supplement (100x) liquid |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | 1M |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Insulin | Sigma | I5500-50 mg | |
| DNAse | Sigma | DN25-10mg | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| PFA | TCI | P0018 | |
| PBS | AmericanBio | AB11072-04000 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma | A5040 | stock solution of 4 mg/ml. |
| Trycold gel | Sigma | TGP8 | gel pack |
| Amaxa Basic Nucleofector Kit | Lonza | VPI-1004 | |
| Trypan blue stain | Life Technologies | 15250061 |
References
- Rietze, R. L., Reynolds, B. A. Neural stem cell isolation and characterization. Methods Enzymol. 419, 3-23 (2006).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2, 1490-1498 (2007).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 7, 2005-2012 (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8, 486-498 (2011).
- Winter, M., et al. Vertebrate neural stem cell segmentation, tracking and lineaging with validation and editing. Nat Protoc. 6, 1942-1952 (2011).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Ghosh, C., Liu, Y., Ma, C., Collodi, P. Cell cultures derived from early zebrafish embryos differentiate in vitro into neurons and astrocytes. Cytotechnology. 23, 221-230 (1997).
- Chen, Z., et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in zebrafish (Danio rerio). PloS one. 8, e57539 (2013).
- Hinsch, K., Zupanc, G. K. Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis. Neuroscience. 146, 679-696 (2007).
- Ristori, E., et al. A dicer-miR-107 interaction regulates biogenesis of specific miRNAs crucial for neurogenesis. Dev Cell. 32, 546-560 (2015).
- Louis, S. K., SIegel, A. C. Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and Automated Methods. Methods Mol Bio. 740, (2011).
- Harrison, M. M., Jenkins, B. V., O’Connor-Giles, K. M., Wildonger, J. A CRISPR view of development. Genes dev. 28, 1859-1872 (2014).
- Marz, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58, 870-888 (2010).
