Aislamiento y cultivo de neuroesferas derivada de cerebro de adultos de pez cebra

Las células madre neuronales de mamíferos (NSC) se han caracterizado in vitro por su capacidad para crecer en cultivos de libre flotación como grupos de células que se dividen neuroesferas ¹ denominados. En presencia de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), NSCs dividen, ya sea de forma simétrica para generar NSCs auto-renovación, o asimétrica para generar dos células hijas diferentes, es decir., Una célula progenitora la diferenciación y una novela NSC. Por lo tanto, los cultivos de neuroesferas son una mezcla de células madre / progenitoras neurales y células neuronales más diferenciados ^2-4 NSC pueden, sin embargo, se distinguen de otros tipos de células de neuroesferas por dos propiedades específicas:. Que muestran a largo plazo auto-renovación en tad culturas flotante y pueden diferenciarse en todos los linajes de células neuronales (es decir, neuronas, astrocitos y oligodendrocitos) tras la retirada de factores de crecimiento y adhesión a los sustratos de la matriz extracelular. en mammALS, el sistema de cultivo neurosphere fue el primer sistema in vitro utilizado para demostrar la presencia de células madre neurales en el cerebro adulto y sigue siendo la herramienta más utilizada para analizar la proliferación, la capacidad de auto-renovación múltiple y capacidad de las células madre y progenitoras neuronales. Por lo tanto, a pesar de que los ensayos de formación de esferas sufren de algunas desventajas y limitaciones ^4, este sistema de cultivo es valiosa para evaluar el potencial de una célula a comportarse como una célula madre cuando se extraen de su nicho en vivo ⁴ y ha sido decisivo en la identificación de los principales reguladores NSC de auto-renovación y la determinación del destino celular ^5-7.

En contraste con los mamíferos que han limitado la neurogénesis adulta, el pez cebra producen constitutivamente nuevas neuronas a lo largo de todo el eje del cerebro a lo largo de su vida. El cerebro del pez cebra adulto muestra varios nichos neurogénicos que alberga las células madre neurales progenitoras / pez cebra haciendo un poderoso organismo modelo para la comprensión de tél vástago actividad de las células en el cerebro, así como los programas moleculares necesarios para la regeneración del sistema nervioso central. Durante los últimos 17 años, varios grupos de investigación desarrollado metodologías para aislar y cultivar células neuronales de pez cebra ^8,9. Estos estudios fueron dirigidos a la producción de neuronas embrionarias y células gliales in vitro, pero no en el mantenimiento de células madre neurales y la investigación de sus propiedades. Aunque neuroesferas se han generado en el adulto Apteronotus leptorhynchus (Brown Santo knifefish) ^10, un ensayo de formación de neuroesferas en el pez cebra se mantuvo por establecer.

Aquí se describe un ensayo de formación de neuroesferas-para demostrar el papel de miR-107 durante la neurogénesis pez cebra ^11. El protocolo permite: 1) la recogida de las células madre / progenitoras neurales adultas, ya sea de toda pez cebra cerebro o de varias regiones del cerebro diseccionadas como el telencéfalo, el tectum, y el cerebelo; 2) la generación de flflotante y neuroesferas auto-renovación de células madre / progenitoras neurales adultas; 3) el abajo y sobre regulación de la expresión de genes que codifican o pequeños ARN no codificantes en neuroesferas ^11, con el fin de investigar su papel en la proliferación y diferenciación de células madre / progenitoras neurales.