Isolement et culture de neurosphères Adult Zebrafish Brain-dérivés

Les cellules souches neurales de mammifère (NNC) ont été caractérisées in vitro par leur aptitude à croître dans des cultures flottantes comme des amas de cellules en division appelées neurosphères ^1. En présence du facteur de croissance épidermique (EGF) et le facteur de croissance des fibroblastes (FGF), le NNC se divisent de manière symétrique pour générer NNC d'auto-renouvellement, ou asymétriquement pour produire deux cellules filles différentes, à savoir., Une cellule progénitrice de différenciation et un nouveau CNS. Cultures neurosphères sont donc un mélange de cellules souches / progénitrices neurales et des cellules neurales plus différenciées ^2-4 NSCs peuvent cependant être distinguées des neurosphères autres types de cellules par deux propriétés spécifiques:. Ils affichent à long terme d' auto-renouvellement Free- les cultures flottantes et elles peuvent se différencier en toutes les lignées cellulaires de neurones ( par exemple, les neurones, les astrocytes et les oligodendrocytes) après le retrait des facteurs de croissance et de l' adhérence à des substrats de la matrice extracellulaire. Dans mammals, le système de culture de neurosphères a été le premier système in vitro utilisé pour démontrer la présence de NNC dans le cerveau adulte et reste l'outil le plus couramment utilisé pour analyser la prolifération, la capacité d' auto-renouvellement et multipotence des cellules souches et progénitrices neurales. Par conséquent, même si les essais de sphère formant souffrent de certains inconvénients et limitations ^4, ce système de culture est utile pour évaluer le potentiel d'une cellule à se comporter comme une cellule souche lorsqu'elle est retirée de sa niche in vivo ⁴ et a joué un rôle dans l' identification des régulateurs clés de NSC auto-renouvellement et le destin des cellules détermination ^5-7.

Contrairement aux mammifères qui ont limité la neurogenèse adulte, le poisson zèbre produisent constitutivement nouveaux neurones le long de l'axe du cerveau entier tout au long de leur vie. Le cerveau du poisson zèbre adulte affiche plusieurs niches neurogène hébergeant souches neurales / cellules progénitrices rendant zebrafish un organisme modèle puissant pour comprendre til endiguer l'activité des cellules dans le cerveau, ainsi que les programmes moléculaires nécessaires à la centrale régénération du système nerveux. Au cours des 17 dernières années, plusieurs groupes de recherche ont développé des méthodologies pour l' isolement et la culture de cellules neuronales ^8,9 poisson zèbre. Ces études visaient à produire des neurones embryonnaires et les cellules gliales in vitro, mais pas au maintien de NNC et enquêter sur leurs propriétés. Bien que neurosphères ont été générés chez l'adulte Apteronotus leptorhynchus (Brown fantôme knifefish) ^10, un dosage de neurosphères formant chez le poisson zèbre reste à établir.

Nous décrivons ici un essai de Neurosphère formation à démontrer le rôle de miR-107 au cours de la neurogenèse zebrafish ^11. Le protocole permet: 1) la collecte des adultes cellules souches / progénitrices neurales soit de zebrafish ensemble du cerveau ou de plusieurs régions du cerveau disséqués comme le télencéphale, tectum, et le cervelet; 2) la production de flottant et neurosphères d'auto-renouvellement de cellules souches / progénitrices neurales adultes; 3) l'aval et la régulation de l'expression des gènes codant ou petits ARN non codantes ¹¹ en neurosphères, afin d'enquêter sur leur rôle dans la prolifération et la différenciation des cellules souches / progénitrices neurales.