Isolamento e la coltura di Neurosfere Zebrafish adulti Brain-derived
Summary
Qui forniamo un metodo riproducibile per esaminare neurogenesi adulta usando un test neurosfere derivato dal cervello intero o sia dal telencefalica, tectal o nelle regioni del cervelletto del cervello zebrafish adulto. Inoltre, si descrive la procedura per manipolare l'espressione genica in neurosfere zebrafish.
Abstract
The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.
Introduction
Le cellule staminali neurali (NSC) di mammiferi sono stati caratterizzati in vitro per la loro capacità di crescere in colture libero di fluttuare come gruppi di cellule in divisione neurosfere 1 chiamati. In presenza di fattore di crescita epidermico (EGF) e del fattore di crescita dei fibroblasti (FGF), NSC dividono sia simmetricamente per generare NSCs auto-rinnovamento, o asimmetrico per generare due differenti cellule figlie, vale a dire., Una differenziazione delle cellule progenitrici e un romanzo NSC. Culture neurosfere sono quindi una miscela di cellule staminali / progenitrici neurali e cellule neurali più differenziati 2-4 NSC possono, tuttavia, essere distinti da altri tipi di cellule neurosfere da due proprietà specifiche:. Visualizzano a lungo termine di auto-rinnovamento free- culture galleggiante e possono differenziarsi in tutte le linee cellulari neuronali (ad esempio, neuroni, astrociti, oligodendrociti e) dopo il ritiro di fattori di crescita e di adesione a substrati della matrice extracellulare. in Mammals, il sistema di coltura neurosfere è stato il primo sistema in vitro utilizzato per dimostrare la presenza di cellule staminali neurali nel cervello adulto e rimane lo strumento più comunemente usato per analizzare la proliferazione, la capacità di auto-rinnovamento e multipotenza delle cellule staminali e progenitrici neurali. Pertanto, anche se saggi sfera formante soffrono di alcuni inconvenienti e limitazioni 4, questo sistema di coltura è utile per valutare il potenziale di una cella a comportarsi come una cellula staminale quando viene rimosso dalla sua nicchia in vivo 4 ed è stato determinante nell'identificare regolatori chiave di NSC auto-rinnovamento e il destino delle cellule determinazione 5-7.
A differenza di mammiferi che hanno limitato neurogenesi adulta, zebrafish costitutivamente produrre nuovi neuroni lungo l'asse del cervello intero per tutta la loro vita. Il cervello zebrafish adulti visualizza più nicchie neurogena ospitare staminali neurali / cellule progenitrici rendendo zebrafish un potente organismo modello per la comprensione tegli staminali attività delle cellule del cervello e dei programmi molecolari necessari per la rigenerazione del sistema nervoso centrale. Nel corso degli ultimi 17 anni, diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato metodologie per l'isolamento e la coltura di cellule neurali zebrafish 8,9. Questi studi avevano lo scopo di produrre neuroni embrionali e le cellule gliali in vitro, ma non a mantenere le cellule staminali neurali e lo studio delle loro proprietà. Anche se neurosfere sono stati generati nell'adulto apteronotus Leptorhynchus (Brown fantasma Knifefish) 10, un saggio neurosfere di formazione nel zebrafish è rimasto da stabilire.
Qui si descrive un saggio neurosfere di formazione per dimostrare il ruolo di miR-107 durante la neurogenesi zebrafish 11. Il protocollo consente: 1) la raccolta di cellule staminali / progenitrici neurali adulte sia da zebrafish intero cervello o provenienti da diverse regioni del cervello sezionati come il telencefalo, il tectum, e il cervelletto; 2) la generazione di flottante e neurosfere di auto-rinnovamento da cellule staminali / progenitrici neurali adulte; 3) il down e up-regolazione dell'espressione dei geni codificanti o piccoli RNA non codificanti 11 in neurosfere, al fine di indagare il loro ruolo nella proliferazione e differenziazione delle cellule staminali / progenitrici neurali.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di isolare e cultura Zebrafish adulti neurosfere cervello-derivato per studiare le caratteristiche cellulari e molecolari delle cellule staminali / progenitrici neurali. Qui, si segnala come selezionare le cellule neurali multipotenti e generare tre tipi di cellule neurali, cioè, astrociti, oligodendrociti e neuroni, dal cervello zebrafish adulto. Il protocollo è altamente significativo dal momento che un saggio neurosfere di formazione riproducibile n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Guillermina Hill-Teran and Marie-Elise Schwartz for assistance. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (5R00HL105791 to S.N.) and from the Alzheimer (NIRP 12-259162). This work was also supported by Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (CFC and JLT), Agence Nationale de la Recherche (13-BSV4-0002-01 (JLT), NIH (1R01EB016629-01A1 (JLT), Connecticut Stem Cell Research Fund (13-SCA-Yale-04 (JLT).
Materials
| DPBS 1X | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM/F12 1X | Life Technologies | 11330-032 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C6852-25g | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N-2 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 supplement (100x) liquid |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | 1M |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Insulin | Sigma | I5500-50 mg | |
| DNAse | Sigma | DN25-10mg | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| PFA | TCI | P0018 | |
| PBS | AmericanBio | AB11072-04000 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma | A5040 | stock solution of 4 mg/ml. |
| Trycold gel | Sigma | TGP8 | gel pack |
| Amaxa Basic Nucleofector Kit | Lonza | VPI-1004 | |
| Trypan blue stain | Life Technologies | 15250061 |
References
- Rietze, R. L., Reynolds, B. A. Neural stem cell isolation and characterization. Methods Enzymol. 419, 3-23 (2006).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2, 1490-1498 (2007).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 7, 2005-2012 (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8, 486-498 (2011).
- Winter, M., et al. Vertebrate neural stem cell segmentation, tracking and lineaging with validation and editing. Nat Protoc. 6, 1942-1952 (2011).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Ghosh, C., Liu, Y., Ma, C., Collodi, P. Cell cultures derived from early zebrafish embryos differentiate in vitro into neurons and astrocytes. Cytotechnology. 23, 221-230 (1997).
- Chen, Z., et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in zebrafish (Danio rerio). PloS one. 8, e57539 (2013).
- Hinsch, K., Zupanc, G. K. Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis. Neuroscience. 146, 679-696 (2007).
- Ristori, E., et al. A dicer-miR-107 interaction regulates biogenesis of specific miRNAs crucial for neurogenesis. Dev Cell. 32, 546-560 (2015).
- Louis, S. K., SIegel, A. C. Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and Automated Methods. Methods Mol Bio. 740, (2011).
- Harrison, M. M., Jenkins, B. V., O’Connor-Giles, K. M., Wildonger, J. A CRISPR view of development. Genes dev. 28, 1859-1872 (2014).
- Marz, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58, 870-888 (2010).
