Hücre Yetişkin Fare subventricular Bölgesinden Nöral Kök ve Progenitör Hücreler Sıralama ve Hücre Döngüsü Dynamics Canlı görüntüleme

Bu protokol 24 Kasım Avrupa Toplulukları Konseyi direktifine uygun olarak dizayn edilmiştir, 1986 (86/609 / EEC) ve hayvan refahı kurumsal komitesi (CETEA-CEA DSV IdF) tarafından onaylanmıştır. Kültür ve videomikroskopi 1. Temel Kurulum Önceki Konfokal görüntü mikroskopi için cam alt kültür plakaları veya μ-Plakaları kullanın. 1 için – / gözenek 5 x 10 3 hücre / göz fazla 5 x 10 3 hücreleri için 96-yuvalı plakalar ve 24-kuyucuklu plakalar kullanılmıştır. En az bir gün önce deney başlamadan yapışık tek tabakalı kültürler steril Poly-D-lisin (PDL) kaplanmış plakalar hazırlar. De kaplamak için her bir alt yeterli PDL (dH2O 10 ug / ml) ilave edilir ve 37 ° C 'de O / N inkübe edin. PDL çözeltisini çıkarın ve plaka, bir laminer akış altında en az 2 saat boyunca başlık kurumaya izin vermeden önce dH 2 O ile üç kez yıkayın. Derhal kullanılmadığı takdirde en kaplanmış plaka saklayın-20 ° C. 9 at NSC bazal ortam ve NSC çoğalma Supplement karıştırılarak kültür ortamı hazırlayın: 1 oranında 2 ug / ml heparin, 20 ng / ml saflaştırılmış insan rekombinan epidermal büyüme faktörü (EGF) ve 10 ng / ml ile (Malzeme tabloya bakınız) İnsan yeniden birleştirici fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF-2). Kullanımdan önce bir su banyosu içerisinde 37 ° C'ye kadar bir kültür ortamı ısıtın. SVZ ayrışma için, papain çözeltisi hazırlayın: 1 mg / ml papain 0.2 mg / ml L-sistein, 0,2 mg / ml EDTA ve 0.01 mg / ml DNase I içeren Earl Denge Tuz Çözeltisi (EBSS) 'de (15 UI / ml) PBS içinde. 0.2 um'lik bir filtreden geçirilerek çözelti sterilize edin. Kullanımdan önce 37 ° C 'de çözüm dengelenmesi. DMEM: F12 ortamı 0,7 mg / ml tripsin inhibitörü Tip II ihtiva eden enzimatik reaksiyonu durdurmak için, bir proteaz inhibitörü çözeltisi (ovomukoid) hazırlar. 0.2 mikron filtre kullanarak çözüm Filtre. Beyinleri ve PBS% 0.15 BSA s toplamak için glükoz solüsyonu PBS% 0.6 hazırlayınyıkama adımları ve antikor boyama için ların çözüme. Diseksiyon ve neşter forseps bağlama, makas: diseksiyon araçları hazırlayın. % 70 etanol içinde bekletin. 2. Hasat Yetişkin Mouse Brain ve SVZ Microdissections Uygun kurumsal kurallarına uygun olarak servikal dislokasyon gerçekleştiren Kurban yetişkin Fucci fareler 23 (2-3 aylık ve / veya çalışmaları yaşlanma için 12 aylık). % 70 etanol kullanılarak fare püskürtün ve keskin bir makas kullanarak kafasını kesti. Kafatası ortaya çıkarmak için kafa derisi boyunca bir kesi yapmak. Makas küçük bir çifti kullanarak koku ampuller karşı kafatası tabanında başlayan uzunlamasına orta hat kesme gerçekleştirin. Makas bıçakları ile yatan beyin zarar vermemek için emin olun. Beyin ortaya çıkarmak için kavisli bir forseps ile kafatası üst açık kısmını çıkarın. PBS içinde% 0.6 glükoz ihtiva eden bir 15 mm petri kabı beyin toplayın. Dkoku ampuller uzakta issect. Dorsal yüzeyinde beyin yerleştirin ve bir neşter kullanılarak kiazmada yoluyla koronal bölümü yapmak. Bir mikroskop altında, deneyci doğru yukarı bakacak kesim koronal yüzeyi ile beyin bölümünün rostral kısmını yerleştirin. , SVZ teşrih ince kavisli bir forseps ile septum kaldırmak için daha sonra ventrikül hemen bitişiğinde striatum içine ince forseps bir ucunu yerleştirin ve çevredeki doku SVZ ayırın. Ek ayrıntılar için, Azari ve ark., 24 bakın. PBS-% 0.6 glükoz 1 ml ihtiva eden bir petri çanağı parçalandığı SVZ'unda yerleştirin. 3. SVZ Doku Ayrılma Hiçbir büyük parçalar kalmayıncaya kadar petri disseke SVZ kıyma. 5 dakika boyunca 200 x g'de 15 ml tüp ve santrifüj PBS% 0.6 glukoz ile birlikte kıyılmış doku aktarın. (1 Süpernatantı atın ve önceden ısıtılmış papain 1 ml ekleyinmg / ml, 37 ° C'de bir su banyosu içinde 10 dakika için 0.01 mg / ml DNase I inkübe ile takviye edilmiş) aşama 1,4 hazırlandı. Fare başına papain 1 ml kullanın. 5 dakika boyunca 200 xg'de Santrifüj ve supernatant atın. 1 ml ekleyin ovomukoid önceden ısıtılmış (0,7 mg / ml, 1.5 adım hazırlandı) papain etkinliğini durdurmak için. Mekanik hafifçe P1000 mikropipet ucu aşağı 20 kere yukarı pipetleme ve tek bir hücre süspansiyonu içine daha fazla kıyılmış doku ayırmak. Hava kabarcıkları kaçının. Yeni 15 ml'lik bir tüp içinde bir steril 20 um filtre üzerinden bir hücre süspansiyonu geçirin. Hücreleri kaybetmemek için PBS% 0.15 BSA ile hücre filtreyi yıkayın emin olun. 10 dakika boyunca 200 xg'de Santrifüj ve supernatant atın. % 0.15 BSA içeren PBS 100 ul hücreleri yeniden askıya. Hücre Sıralama için 4. Immunofluorescent Boyama Hücre için Fucci-Kırmızı fareler (Şekil 2A), aşağıdakileri kullanın kullanarak sıralamaantikorları: CD24 fikoeritrin-eşleniği cyanine7 [PY7]; CD15 / Lex floresin izotiyosiyanat [FITC] konjüge edilmiş ve Ax647 konjüge EGF ligand. Not: Lex + EGFR + hücreleri ve EGFR + hücreleri yetişkin SVZ'unda bol değildir: ≈ 600 ve 1500 hücre / fare sırasıyla 9. Biz yeterli malzeme var 2 ila 3 farelerin SVZ hücrelerin havuzu öneririz. Hücre sıralama süresi 3 saat geçmemesi için, aynı günde birden 12 fareler ile çalışma. Aynı gün çok sayıda fare ile çalışan bir artış hücre sıralama süresinin muhtemelen artan hücre ölümü ve / veya hücre farklılaşmasında sonuçlanan yol açacağı göz önünde bulundurun. Fare başına (ya da uygun boyama 2 farenin 3 arasında bir grup için 200 ul) PBS% 0.15 BSA, 100 ul FACS boyaması gerçekleştirin. Kontrol tüpleri hazırlayın. Üreticiye göre tek renk kontrolü tüpler hazırlamak için tazminat boncuk kullanın9'un; s protokolü. Hücrelerin bir fraksiyonu (bir fare yeterlidir çıkarılan hücre 1/10) seçip 1 negatif kontrol tüpü (işaretlenmemiş hücreleri) ve 3 floresan eksi bir (FMO) kontrol tüpleri hazırlanması için 4 tüplerde ayırın. Tüp başına PBS% 0.15 BSA, 200 ul tekrar süspansiyon hücreleri. Tavsiye: Lex-FITC FMO kontrolü için, CD24-PC7 (01:50) ile Ax647-konjüge EGF ligand ile hücreler (1: 200) etiket; ve Ax647-konjuge EGF ligand FMO kontrolü için CD15 / LeX- olan hücreleri etiketlemek: CD24-PY7 FMO kontrolü için, CD15 / Lex-FITC (01:50) ile Ax647-konjüge EGF ligandı (200 1) ile hücreleri etiketlemek FITC (01:50) ve CD24-PY7 (01:50). Hücre sıralama için kullanılan borular için, PBS içinde gösterilen seyreltme,% 0.15 BSA, aşağıdaki antikorların kullanımı: CD24-PY7 (01:50), CD15 / Lex-FITC (01:50) ile Ax647-konjüge EGF ligandı (1: 200). Karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin. 10 dakika boyunca 200 x g'de 1 ml PBS% 0,15 BSA ve santrifüj ile yıkanır. 200 hücrelerin yeniden süspanse81; beyin başına PBS% 0.15 BSA l. Buz üzerinde hücre sıralama tüpleri tutun ve hücre sıralama hemen geçin. Fucci-Yeşil fareler kullanıyorsanız, hücre Lex-FITC antikor hisse gibi Fucci-yeşil floresan daha aynı emisyon dalga boyu sıralamadan önce ayırma kolonları kullanılarak ayrı Lex-pozitif ve Lex negatif fraksiyonlar (Şekil 3A, B). İlk olarak, PBS% 0,15 BSA, 100 ul karanlıkta 4 ° C'de 15 dakika süre ile, bir fare anti-insan Lex-antikoru (01:50) ile hücrelerin etiketlenmesi. Daha sonra, karanlıkta 4 ° C'de 15 dakika süre ile anti-fare IgM mikro-(01:10) ile hücrelerin etiketlenmesi, 10 dakika boyunca 200 x g'de 1 ml PBS% 0,15 BSA, santrifüj ile hücreler yıkanır. 10 dakika boyunca 200 x g'de 1 ml PBS% 0,15 BSA, santrifüj ile hücreler yıkanır. 500 ul PBS% 0.15 BSA içinde hücrelerin tekrar Şekil 3 C şematize olarak manyetik alan ayırma kolonu boyunca hücrelerin dökün. 1 ml PBS% 0,15 B ile kolon yıkayınSA Lex negatif kısmın elde edilmesi için. Lex pozitif kısmını elde etmek için, manyetik alandan ayırma sütunu kaldırmak ve 2 ml PBS% 0.15 BSA ile hücreleri Zehir. 4.2 belirtildiği gibi CD24-PC7 ve Ax647-konjuge EGF ligand boyama devam edin. 5. Hücre Sıralama Not: Hücreler 86 mikron noozle 40 Psi bir FACS sıralayıcı üzerinde dizildi. 520 / 35nm (FITC), 575 / 26nm (PE), 670/20 nm (Ax647) ve 740LP (PY7): Flüoresans Aşağıdaki filtre seti kullanılarak toplanmıştır. Bir örtüşme Fucci-kırmızı floresan emisyon spektrumları ve PC7 boya arasında bulunan olarak Tazminat yanlış pozitif sinyaller önlemek için gereklidir. Sıralama hücre hemen önce, ölü hücrelerin canlı ayırmak için bir vital boya ekleyin. Biz 2 ug / ml nihai konsantrasyonda HO (malzeme tabloya bakınız). FACS sıralayıcı basıp th yoluyla negatif kontrol tüpü (işaretsiz hücreleri) çalıştırınyan dağılım (SSC) ve forward scatter (FSC) parametrelerini (Şekil 1A) kullanarak e hücreleri. NOT: Ölü hücreleri (Şekil 1A ') Sadece HO-negatif fraksiyon yolluk ve sonra çiftlerin Darbe Genişliği negatif kısmını (Şekil 1A seçerek dışı bırakıldı' ') tarafından dışlandı. Adım 4.2 hazırlanan tek renk kontrolleri çalıştırın ve photomultiplier tüp ayarlayın (PMT) gerekirse (yani negatif nüfus çok yüksek ve / veya pozitif hücreler kapalı ölçek) gerilimleri. Yazılımın tazminat penceresinde renk tazminat gerçekleştirin. Run FMO adım 4.2 (Lex-FITC FMO kontrolü, CD24-PC7 FMO kontrol ve Ax647-konjuge EGF ligand FMO kontrol) hazırlanan kontrol ve sıralama kapıları (Şekil 1) çizin. Şirketinden 1.5 mi mikrotüplerde kültür ortamında 100 ul halinde sıralama hücreleri. Mikroskopi için Hücre 6. hazırlanması Taze sıralanmış hücreyi Plate1 bir yoğunlukta s – 3 x 10 3 hücre / kuyu ile ilgili Poly-D-lizin-kültür ortamında 300 ul, 96 oyuklu μ-Plate kaplama. Video mikroskopi önce, hücre yapışmasını sağlayacak kadar en az 1 saat boyunca CO2 37 ° C'de kültür plakaları inkübe ve% 5. 7. Mikroskop Kurulum ve Image Acquisition CO2 atmosferinde% 5 altında 37 ° C de ters termostatlı bölmeye bağlı bir konfokal lazer tarama mikroskobu sisteminde: Plan Apo VC 20x objektif DIC (0.75 NA) kullanılarak canlı görüntüleme gerçekleştirin. Önceden ısıtılmış ve dengelenir termostatlı odasının içine 96 kuyu μ-Plate yerleştirin ve termostatlı bir kapak ile kapağı değiştirin. NIS-Elements yazılımı açın ve menü çubuğunda tıklayın time-lapse seçenekleri (uzunluk, sahne pozisyonları, konfokal z bölümler, …), "Acquire / Toplama kontrollerini seçmek için" Acquire / Toplama / ND edinimi kontrol " / Ti Pad221; hedefleri seçmek ve "Acquire / Toplama kontrolleri / A1plus Ayarları" menü çubuğunda her floresan için PMT seviyesini seçmek için. veri dosyalarını kaydetmek için bir klasör seçin. ND edinme penceresini kullanarak, her merkezi sıra sahne konumunu ayarlamak ve 7 x 7 mm² büyük görüntü seçeneği seçin. Bu iyi, her merkezi etrafında bir mozaik görüntü yaratacaktır. % 5 büyük mozaik resim için örtüşme ayarlayın. 24 saat boyunca her 20 dakika fotoğraf çekmek. Ti Pad penceresinde: Planı Apo VC 20x DIC objektif (0.75 NA) seçin. A1plus Ayarlar penceresinde, 1.26 mm / piksel çözünürlüğe sahip 512 x 512 piksel formatında yüksek hızda rezonans tarayıcı kullanarak görüntü elde. Hücre şekilleri görselleştirmek için aydınlık kullanın. Fucci-Kırmızı farelerin durumunda, 561 nm kırmızı floresan heyecanlandırmak ve 595/50 nm filtre kullanılarak toplamak. Fucci-Yeşil farelerde durumunda, 488 nm 'de yeşil flüoresans tahrik ve 530/40 nm filtre kullanılarak toplanır. Optimal PM belirleyinHer dalga boyu T seviyesi, ofset ve lazer güç. NOT: Yazılım, her satın alma önce her aşama pozisyonunda otofokus izin aydınlık kanalı için otomatik odaklama işlevini kullanmanızı öneririz. İpucu: Bir Planı Apo VC 20x DIC hedefi (NA: 0.75) petrol için gerek kalmadan mükemmel çözünürlük için kullanıldı. Diğer hedefler istenilen optik çözünürlüğe bağlı olarak kullanılabilir. Edinimi başlamak için ND edinme penceresinde 'şimdi çalıştır' düğmesini seçin. İpucu: Düzgün çalışan her şeyin emin olmak için 1 döngü bilgisayar çalışmalarını izleyin. 8. Görüntü İşleme ve Analizi Hücreleri tek tek takip ederek NIS-Elements yazılımı doğrudan verileri analiz edin. İpucu: zaman kazanmak NIS-Elements yazılımı kullanılarak .avi formatında her konumunu kaydetmek ve ImageJ ile film analiz etmek. ImageJ yazılım olarak, en az 2 tümen (yani bir hücre geçiren bireysel hücreleri izlemekDört hücre kolonisi). Hücrenin etrafında küçük bir alanı kırpma ve 'Resim / Çoğalt' öğesini seçin. Bir montaj yapmak için menü çubuğundaki 'Resim / Yığınlar / Make Montage' seçeneğini seçin. Çerçeveler dahil edilecek görüntülerin boyutunu belirtin ve optimum çözümü için bir tif dosyası olarak montaj kaydedebilirsiniz. İlk SG 2 / M faz uzunluğu (Şekil 2C, D) hesaplamak için, (G 1) tek bir kırmızı floresan hücre seçin ve ardından t (kırmızı-floresan kapanır kez başlayacak S fazı) 0 = ayarlayın. Hücre SG 2 / M uzunluğunu tahmin etmek böler kadar kare sayısını sayın. NOT: Hesaplanan zaman her karede arasındaki zaman aralığına bağlıdır. Aşağıdaki G1 fazı (Şekil 2C, D) hesaplamak için, sadece bölünmüş hücreyi izlemek için devam ediyor. Bölünmüş hücre G1 fazı girerse, cdt1 kırmızı floresan proteini birikimi olacaktır. Kırmızı-floresan aga kapanana kadar kare sayısını hesaplayınher bir hücre için in. İpucu: G 1 yılı başında kırmızı floresan zayıf olabilir bu yüzden hücre yaklaşımlar önlemek için ikiye böldü çerçeve üzerinde G 1 fazının başlangıcını seçin.