Celsortering van neurale stamcellen en stamcellen uit de Adult Mouse subventriculaire zone en Live-beeldvorming van de celcyclus Dynamics

Dit protocol is ontworpen in overeenstemming met de Europese Gemeenschappen Richtlijn van de Raad van 24 november heeft 1986 (86/609 / EEG) en goedgekeurd door onze dierenwelzijn institutionele comité (CETEA-CEA DSV IDF). 1. Basic Setup Voorafgaand aan cultuur en videomicroscopie Gebruik glazen bodem cultuur platen of μ-platen voor confocale microscopie video. Voor 1 – 5 x 10 3 cellen / putje, gebruikt 96-well platen en 24-putjes meer dan 5 x 10 3 cellen / putje. Ten minste één dag vóór het begin van het experiment, voor te bereiden steriele Poly-D-lysine (PDL) gecoate platen voor hechtende monolaag culturen. Voeg genoeg PDL (10 ug / ml in dH2O) het bekleden van de bodem van elk putje en incubeer O / N bij 37 ° C. Verwijder de PDL en spoel driemaal met dH 2 O alvorens de plaat te drogen in de kap gedurende tenminste 2 uur onder een laminaire stroming. Indien niet onmiddellijk gebruikt, slaan de gecoate plaat bij-20 ° C. Bereid kweekmedium door menging NSC basismedium en NSC Proliferatie Supplement op een 9: 1 verhouding (zie Material tabel) samen met 2 ug / ml heparine, 20 ng / ml gezuiverd humaan recombinant epidermale groeifactor (EGF), en 10 ng / ml menselijke recombinant fibroblast groeifactor 2 (FGF-2). Warm het cultuurmedium tot 37 ° C in een waterbad vóór gebruik. Voor de SVZ dissociatie bereiden papaïne oplossing: 1 mg / ml papaïne (15 UI / ml) in Earl's Balance Salt Solution (EBSS) bevat 0,2 mg / ml L-cysteïne, 0,2 mg / ml EDTA en 0,01 mg / ml DNase I in PBS. Steriliseer de oplossing door het passeren door een 0,2 um filter. Equilibreer de oplossing bij 37 ° C vóór gebruik. Om de enzymatische reactie te stoppen, stelt een oplossing proteaseremmer (ovomucoïde): DMEM: F12 medium dat 0,7 mg / ml trypsine remmer type II. Filtreer de oplossing met behulp van een 0,2 urn filter. Bereid PBS 0,6% glucoseoplossing naar de hersenen en PBS 0,15% BSA s verzamelenPLOSSING voor wasstappen en antilichaamkleuring. Bereid dissectie instrumenten: schaar, ontleden en koppelverkoop pincet, scalpel. Week ze in 70% ethanol. 2. Het oogsten van Adult Mouse Brains en SVZ Microdissections Offer volwassen Fucci muizen 23 (2 tot 3 maanden oud en / of 12-maanden oude voor aging studies) uitvoeren van een cervicale dislocatie in overeenstemming met de toepasselijke institutionele richtlijnen. Spuit de muis met behulp van 70% ethanol en snijd het hoofd af met een scherpe schaar. Maak een insnijding langs de hoofdhuid aan de schedel te onthullen. Voer een overlangse middellijn snede begint bij de basis van de schedel naar de olfactorische lampen met een kleine schaar. Zorg ervoor dat u voorkomen dat schade aan de onderliggende hersenen met de schaar messen. Verwijder de bovenste open gedeelte van de schedel met gebogen pincet naar de hersenen bloot. Verzamel de hersenen in een 15 mm petrischaal die 0,6% glucose in PBS. Dissect de olfactorische bollen weg. Plaats de hersenen op de rugzijde en een coronale doorsnede door de optische chiasma met behulp van een scalpel. Onder een microscoop ontleden, de positie van de rostrale deel van de sectie hersenen met de gesneden coronale oppervlak naar boven in de richting van de experimentator. Om de SVZ ontleden, verwijder het septum met een fijn gebogen pincet steek dan een tip van een fijne tang in het striatum direct grenzend aan het ventrikel en maak de SVZ van het omringende weefsel. Voor meer informatie, zie Azari et al. 24. Plaats de SVZ ontleed in een petrischaaltje met 1 ml PBS-0,6% glucose. 3. SVZ Tissue Dissociatie Hak de ontleed SVZ in de petrischaal totdat er geen grote stukken blijven. Overdracht gehakt weefsel samen met PBS-0,6% glucose tot een 15 ml buis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en voeg 1 ml voorverwarmde papaïne (1mg / ml, bereid in stap 1,4) aangevuld met 0,01 mg / ml DNase I gedurende 10 min in een waterbad bij 37 ° C. Gebruik 1 ml papaïne per muis. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten en de bovenstaande vloeistof. Voeg 1 ml voorverwarmde ovomucoïde (0,7 mg / ml, bereid in stap 1,5) om papaïne te beëindigen. Mechanisch verder distantiëren het gehakt weefsel in een single-cell suspensie door zachtjes en neer te pipetteren 20 keer via een P1000 micropipet tip. Vermijd luchtbellen. Leid de celsuspensie door een steriele 20 urn filter in een nieuwe 15 ml buis. Zorg ervoor dat de cel filter met PBS 0,15% BSA wassen om te voorkomen dat cellen. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 10 min en de bovenstaande vloeistof. Resuspendeer de cellen in 100 pl PBS met 0,15% BSA. 4. immunofluorescentiekleuring voor celsortering Voor celsortering met Fucci-Rode muizen (Figuur 2A), gebruikt u de volgendeantilichamen: CD24 fyco-cyanine7 conjugaat [PC7]; CD15 / LeX fluoresceïneisothiocyanaat [FITC] geconjugeerd en Ax647 geconjugeerde EGF ligand. Opmerking: LeX + EGFR + cellen en EGFR + cellen zijn niet overvloedig in de volwassen SVZ: ≈ 600 en 1500 cellen / muis respectievelijk 9. We raden aan het bundelen van SVZ cellen 2-3 muizen om genoeg materiaal te hebben. Niet met meer dan 12 muizen op dezelfde dag, zodat de celsortering niet langer duren dan 3 uur. Houd in gedachten dat het werken met te veel muizen op dezelfde dag zal leiden tot een verhoogde celsortering duur mogelijk resulterend in een verhoogde celdood en / of celdifferentiatie. Voer de FACS kleuring in 100 pl PBS 0,15% BSA per muis (of 200 ul voor een groep van 2-3 muizen voor optimale kleuring). Bereid de controle buizen. Gebruik compensatie kralen enkele kleur controle buizen voor te bereiden volgens de fabrikant9; s protocol. Selecteer een fractie van cellen (1/10 van de cellen geëxtraheerd uit één muis is voldoende) en scheiden in 4 buizen 1 negatieve controle buis (alleen cellen) en fluorescentie 3 min één (FMO) controlebuizen bereiden. Resuspendeer de cellen in 200 pl PBS 0,15% BSA per buis. Hint: Lex-FITC FMO controle, het etiket van de cellen met CD24-PC7 (01:50) en Ax647-geconjugeerde EGF ligand (1: 200); voor CD24-PC7 FMO controle, het etiket van de cellen met CD15 / LeX-FITC (01:50) en Ax647-geconjugeerde EGF ligand (1: 200) en voor Ax647 geconjugeerde EGF ligand FMO controle, het etiket van de cellen met CD15 / Lexmark FITC (01:50) en CD24-PC7 (01:50). Voor de buizen gebruikt voor het sorteren van cellen, gebruikt u de volgende antilichamen op de aangegeven verdunning in PBS 0,15% BSA: CD24-PC7 (01:50), CD15 / LeX-FITC (01:50) en Ax647-geconjugeerde EGF ligand (1: 200). Incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C in het donker. Wassen met 1 ml PBS 0,15% BSA en centrifugeer bij 200 xg gedurende 10 min. Resuspendeer de cellen in 20081; l PBS 0,15% BSA per hersenen. Houd de cel sortering buizen op ijs en onmiddellijk naar de cel sorteren. Bij gebruik van Fucci-Green muizen, aparte LeX-positieve en LeX-negatieve fracties met scheidingskolommen voordat celsortering als lex-FITC antilichaam deelt dezelfde emissie golflengte dan de Fucci-groene fluorescentie (figuur 3A, B). Ten eerste etiket de cellen met een muis anti-humaan LeX antilichaam (1:50) gedurende 15 minuten bij 4 ° C in het donker in 100 pl PBS 0,15% BSA. Was de cellen met 1 ml PBS 0,15% BSA en centrifugeer bij 200 xg gedurende 10 min, vervolgens etiket de cellen met anti-muis IgM microkorrels (01:10) gedurende 15 minuten bij 4 ° C in het donker. Was de cellen met 1 ml PBS 0,15% BSA en centrifugeer bij 200 xg gedurende 10 min. Resuspendeer de cellen in 500 pi PBS 0,15% BSA en giet de cellen door scheidingskolom in het magnetisch veld zoals schematisch in figuur 3C. Was de kolom met 1 ml PBS 0,15% BSA Lex negatieve fractie te verkrijgen. Lex-positieve fractie te verkrijgen, verwijder de scheidingskolom vanuit het magnetische veld en elueer de cellen met 2 ml PBS 0,15% BSA. Ga verder met CD24-PC7 en Ax647 geconjugeerde EGF ligand vlekken zoals aangegeven in 4.2. 5. Cell Sorting Opmerking: De cellen werden gesorteerd op een FACS sorter 40 Psi met een 86 micrometer noozle. Fluorescentie werd verzameld met behulp van de volgende filter set: 520/35 nm (FITC), 575 / 26nm (PE), 670 / 20nm (Ax647) en 740LP (PC7). Compensatie is nodig om vals-positieve signalen te voorkomen als een overlap is gevonden tussen de emissie spectra van de Fucci-rode fluorescentie en de PC7 kleurstof. Onmiddellijk voorafgaand aan celsortering, voeg een vitale kleurstof voor levende onderscheiden van dode cellen. We gebruikten HO (zie materiaal tabel) in een 2 ug / ml uiteindelijke concentratie. Voer de negatieve controle buis (ongemerkte cellen) door de FACS sorter en selecteer the cellen met behulp van zijwaartse verstrooiing (SSC) en voorwaartse verstrooiing (FSC) parameters (Figuur 1A). OPMERKING: Dode cellen werden uitgesloten door het poorten alleen HO-negatieve fractie (Figuur 1A) en vervolgens werden doubletten uitgesloten door het selecteren van de Pulse Width negatieve fractie (Figuur 1A ''). Voer de enkele kleur controles bereid in stap 4.2 en pas de fotomultiplicatorbuis (PMT) spanningen indien nodig (dwz negatieve bevolking te hoog en / of positieve cellen uit schaal). Voeren kleurcompensatie in de vergoeding raam van de software. Run FMO controleert bereid in stap 4.2 (LEX-FITC FMO controle, CD24-PC7 FMO controle en Ax647 geconjugeerde EGF ligand FMO controle) en trek de sortering poorten (figuur 1). Sorteer de cellen direct in 100 ul kweekmedium in 1,5 ml microbuisjes. 6. Bereiding van Cellen voor Microscopie Plate de vers naargelang cels bij een dichtheid van 1 – 3 x 10 3 cellen / putje op met poly-D-lysine beklede 96 putjes μ-plaat met 300 pl kweekmedium. Vóór videomicroscopie Incubeer kweekplaten bij de 37 ° C en 5% CO2 gedurende ten minste 1 uur tot celadhesie laten. 7. Microscoop Setup en Image Acquisition Live beeldvorming met behulp van een Plan Apo VC DIC 20x objectief (NA: 0,75) op een confocale laser scanning microscoop systeem verbonden met een omgekeerde thermostaatregeling kamer bij 37 ° C onder 5% CO2 atmosfeer. Plaats de 96-well μ-plaat in de voorverwarmde en in evenwicht thermostaat is ruimte en plaats de deksel door een thermostaat deksel. Open de NOS-Elements software en klik in de menubalk op 'Acquire / Acquisition regelt / ND overname "om de opties van de time-lapse (lengte, podium posities, confocale z-profielen, …)," Ophalen / Acquisition controles selecteren / Ti Pad221; om de doelstellingen te selecteren en "Acquire / Acquisition controles / A1plus Settings" om het PMT voor elk fluorescentie in de menubalk te selecteren. Selecteer een map om de data bestanden op te slaan. Met behulp van de ND overname venster, stelt het midden van elk putje als podium positie en selecteer de grote afbeelding optie om 7 x 7 mm². Dit mozaïekbeeld rond het centrum van elk putje te creëren. Stel de overlap voor de grote afbeelding mozaïek tot 5%. Foto's nemen elke 20 minuten gedurende 24 uur. Selecteer het Plan Apo VC 20x DIC objectief (NA: 0,75) in het venster Ti Pad. In het venster Instellingen A1plus verwerven beelden met hoge snelheid resonante scanner op een 512 x 512 pixels formaat met een resolutie van 1,26 micrometer / pixel. Gebruik helderveld naar cel vormen visualiseren. Bij Fucci-Red muizen prikkelen rode fluorescentie bij 561 nm en laat met behulp van een 595/50 nm filter. Bij Fucci-Green muizen prikkelen groene fluorescentie bij 488 nm en laat met behulp van een 530/40 nm filter. Bepaal de optimale PMT level, offset en laservermogen voor elke golflengte. OPMERKING: Wij raden het gebruik van de autofocus functie voor de helderveld kanaal om de software naar automatische scherpstelling in elke fase positie voor elke overname. Hint: Een Plan Apo VC DIC 20x objectief (NA: 0,75) werd gebruikt om de uitstekende resolutie zonder olie. Andere doelstellingen kunnen worden gebruikt afhankelijk van de gewenste optische resolutie. Selecteer het 'nu Run "knop op de ND overname venster om acquisitie te beginnen. Hint: Volg de computer werken voor 1 lus om zeker te zijn dat alles in goed werkt. 8. beeldverwerking en analyse Analyseer de gegevens rechtstreeks op de NOS-Elements software door het bijhouden van de cellen individueel. Tip: om tijd te winnen, bespaart elke positie in .avi-formaat met behulp van NOS-Elements software en analyseren van de films met ImageJ. In ImageJ software, volgen individuele cellen ondergaan ten minste 2 divisies (dwz één celeen vier-cel kolonie). Bijsnijden een klein gebied rond de cel en selecteer 'Afbeelding / Duplicate'. Selecteer 'Beeld / Stacks / Maak Montage' in de menubalk om een ​​montage te maken. Geef de frames worden opgenomen, de grootte van de afbeeldingen en sla de montage als een .tif-bestand voor optimale resolutie. Om de eerste SG 2 / M faselengte (figuur 2C, D) te berekenen, selecteer een enkele rode fluorescerende cellen (in G 1) en stelt t = 0 (S-fase begint zodra de rode fluorescentie uitgeschakeld). Tel het aantal frames totdat de cel deelt de SG 2 / M lengte schatten. OPMERKING: De berekende tijd is afhankelijk van het tijdsinterval tussen elke frame. De volgende G1 fase (figuur 2C, D) te berekenen, blijft de cel die gewoon verdeeld volgen. Als de verdeelde cel binnenkomt G1 fase zal een accumulatie van CDT1 rood fluorescerend eiwit. Bereken het aantal frames tot rood-fluorescentie schakelt agaVoor elke cel. Hint: Begin G 1 de rode fluorescentie zwak kunnen zijn dus kies het begin van de G 1 fase van het frame waar de cel onderverdeeld om benaderingen te voorkomen.