فرز خلية العصبية الجذعية وخلايا السلف من الفأر Subventricular المنطقة الكبار وحية على التصوير من حيوية دورة الخلية الخاصة
Summary
We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.
Abstract
الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) في منطقة subventricular من البطينات الجانبية (SVZ) الحفاظ تكوين الخلايا العصبية الشمية في جميع مراحل الحياة في أدمغة الثدييات. هم على التوالي توليد خلايا العبور تضخيم (جان التقييم التقني) وneuroblasts أن تفرق في الخلايا العصبية بمجرد دمج بصيلات الشم. الناشئة فلوري خلية تنشيط الفرز سمحت (FACS) تقنيات عزل NSCs وكذلك ذريتها وبدأت لتسليط الضوء على شبكات تنظيم الجينات في محاريب العصبية الكبار. نفيدكم هنا تقنية خلية الفرز التي تسمح للمتابعة والتمييز بين ديناميات دورة الخلية من سكان الخلية المشار إليه أعلاه من SVZ الكبار مع ليكس / EGFR / CD24 تلطيخ الثلاثي. ومطلي ثم الخلايا المعزولة كما الخلايا الملتصقة لاستكشاف في تفاصيل تقدم دورة الخلية من خلال الوقت الفاصل بين الفيديو المجهري. تحقيقا لهذه الغاية، ونحن نستخدم المعدلة وراثيا الإسفار Ubiquitination المؤشر دورة الخلية (FUCCI) الفئران التي الخلايا الحمراء الفلورسنت الزيتوز G 1 المرحلة بسبب G 1 محدد مراسل الحمراء Cdt1. هذه الطريقة قد كشفت مؤخرا أن NSCs المتكاثرة يطيل تدريجيا من مرحلة G 1 أثناء الشيخوخة، مما يؤدي إلى ضعف تكوين الخلايا العصبية. هذا الأسلوب هو القابلة للنقل بسهولة إلى أنظمة أخرى، ويمكن أن تكون ذات فائدة كبيرة لدراسة ديناميات دورة الخلية خلايا الدماغ في سياق أمراض الدماغ.
Introduction
الخلايا الجذعية العصبية هادئة (NSCs) هي مصدر لتكوين الخلايا العصبية الكبار (1) ويمكن تحويلها الى التكاثري على "تنشيط" النموذج معربا عن EGFR (aNSCs) 2. تنشيط مرة واحدة، فإنها تؤدي إلى خلايا العبور تضخيم (جان التقييم التقني) 3 ثم neuroblasts التي تهاجر إلى بصيلات الشم (OB) عن طريق أنبوب من الخلايا النجمية وأخيرا تفرق في الخلايا العصبية 4،5. ويتم تنظيم NSCs وذريتها في "منافذ" المتخصصة أبنية على طول البطينين الوحشي، تورط عدد لا يحصى من العوامل المتحكمة انتشارها 6. عزل وتنقية الخلايا العصبية SVZ ضرورية لإلقاء الضوء على التنظيم الجزيئي المعقد من انتشارها ولكنها ظلت تحديا لفترة طويلة بسبب عدم وجود علامات محددة والتقنيات تكييفها.
مناهج جديدة باستخدام التدفق الخلوي قد جعلت من الممكن عزل NSCs وtheiص ذرية من الكبار SVZ 2،7-11. باستخدام علامة الخلية الجذعية ليكس 12 جنبا إلى جنب مع أرومة عصبية علامة CD24 13 وEGF مضان لتسمية EGFR في الخلايا المتكاثرة 2، وضعنا مؤخرا استراتيجية FACS السماح للتنقية من خمسة من الرئيسي السكان العصبية SVZ: هادئة والمفعلين NSCs، جان التقييم التقني، غير ناضج وكذلك المهاجرة neuroblasts 9. هنا، نحن تصف في تفاصيل هذه الخلية الفرز التقنية وكيف يمكن ليكس / EGFR / CD24 تلطيخ الثلاثي سمح لأول مرة عزل كل من NSCs هادئة وتفعيلها.
على الرغم من استمرار الخلايا العصبية خلال مرحلة البلوغ، وانخفض إنتاج خلايا عصبية جديدة بشكل جذري في المخ من الشيخوخة 14. معظم الدراسات تتفق على تخفيض تدريجي في عدد الخلايا المتكاثرة السلف في SGZ وSVZ 15-20. العواقب ليست بسيطة مثل انخفاض المرتبطة بالعمر في تكوين الخلايا العصبية في SVZ يثير تضاؤل نالخلايا العصبية ewborn في بصيلات الشم في الدماغ العمر، مما يؤدي في النهاية إلى ضعف في التمييز الشمي في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 18. توضيح حركية دورة الخلية من الأسلاف العصبية هو خطوة أساسية لفهم الآليات الكامنة وراء تطور الخلايا العصبية الكبار أثناء الشيخوخة. وقد حقق الدراسات التي أجريت مؤخرا دورة الخلية ونسب تطور الخلايا الجذعية العصبية الكبار في المختبر 21 و في الجسم الحي 22 ولكن أيا منها استغل تقنيات الخلية الفرز والمشفرة وراثيا الفلورسنت تحقيقات الخلية دورة لتصور مراحل دورة الخلية من الخلايا المعزولة على مستوى خلية واحدة.
نحن هنا وصف البروتوكول الذي يستفيد من الفئران المعدلة وراثيا في FUCCI التي فلوري الخلايا خلال دورة الخلية، مما يتيح التمييز بين G 1 و 2 SG / M مراحل 23. ويظهر هذا البروتوكول العزلة كيف المحتملين من NSCs وذريتها من الكبار FUCCI ميلم جنبا إلى جنب مع المجهري الوقت الفاصل بين الفيديو يسمح دراسة ديناميات دورة الخلية على مستوى خلية واحدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقنية الفرز الخلية المذكورة هنا تسمح التمييز موثوقة بين NSCs هادئة، NSCs تنشيط والدراسات ذرية تمكن من ممتلكاتهم وديناميكية في الدماغ البالغ 9. إلى جانب التكنولوجيا FUCCI الذي يسمح التصور من تقدم دورة الخلية في الخلايا الحية 23، قمنا بتطوير تقنية سريعة وفعالة لمتابعة مراحل G 1 و 2 SG / M من دورة الخلية من الشباب البالغين وخلايا مخ الفأر المسنين.
كانت تقنية خلية الفرز المستخدمة في هذا البروتوكول مزيج التحقق من صحتها الأول من علامات السماح للتنقية من السكان العصبية الرئيسي خمسة من SVZ 9. وكانت أيضا تقنية التحقق من صحة الأولى تمكن من تمييز من NSCs هادئة وتفعيلها. ومن الجدير بالذكر أن هذه التقنية لا تتطلب استخدام الفئران المعدلة وراثيا في حد ذاته، وهو أمر ضروري عندما تتكيف مع نماذج الماوس المعدلة وراثيا سوالفصل كما FUCCI. ومنذ ذلك الحين، استخدمت Codega وآخرون. 10 لGFAP-GFP / CD133 / EGFR مزيج العلامات الثلاثي للتمييز NSCs هادئة من نظيرتها تنشيط ولكن لا يمكن أن تتكيف مع التكنولوجيا FUCCI لأنه يتطلب استخدام GFAP-GFP الفئران المعدلة وراثيا. وضعت ولاية ميشيغان وآخرون. 11 ل/ EGFR / CD24 استراتيجية العلامات ثلاثية Glast أن يشارك النتائج المشتركة مع التقنية المستخدمة في هذه الدراسة 9. في الواقع، لوحظ وجود ارتباط وثيق بين ليكس وعلامات Glast NSCs بالفعل في Daynac آخرون دراسة 9. ومع ذلك، ويقترن الأجسام المضادة Glast المستخدمة في تقنية ولاية ميشيغان وآخرون إلى فيكوإيريترين، وبالتالي لا يمكن أن تتكيف مع استخدام الفئران FUCCI الأحمر.
هناك العديد من النقاط الفنية المهمة التي تتطلب اهتماما قبل فرز الخلايا SVZ. أولا، فإن الخطوة التفكك هي مهمة جدا لأنسجة المخ لابد من فصل إلى الخلايا وحيدة مع الحفاظ على الهيكلية فيtegrity من البروتينات المستخدمة في استراتيجية وضع العلامات الأجسام المضادة. وقد تبين 0.05٪ التربسين-EDTA أن تكون فعالة جدا في النأي SVZ الأنسجة 27 ولكن تم العثور على مستضد ليكس أن تكون حساسة للغاية وتقريبا كل ليكس-FITC المناعي الضائع (لا تظهر البيانات). وهكذا، تم استخدام غراء كما كان أكثر كفاءة وأقل تدميرا من البروتياز الأخرى على أنسجة المخ. وعلاوة على ذلك، تأثرت لا يكس ولا EGFR ولا CD24 عن طريق العلاج غراء. وتجدر الإشارة إلى أن وضع العلامات الضد تم تغيير إذا تجاوزت علاج غراء 15 دقيقة. حصلنا على أفضل النتائج مع العلاج غراء 10 دقيقة المرتبطة تفارق الميكانيكية (ماصة صعودا وهبوطا 20 مرات).
طلاء بولي-D-ليسين يسمح ثقافة الخلايا الملتصقة وتشكيل المستعمرات بعد عدة أيام في الثقافة. ومن المسلم به الآن على نطاق واسع أنه في فحوصات المختبر يأتي مع محدوديتها 28،29. ونحن نوصي تحديد فقط دورة الخلية الأولى لوالخلايا التي تمر تقسيم لاحقة واحدة على الأقل للبقاء في أقرب وقت ممكن لفي الجسم الحي خلية النمط الظاهري.
ومن الجدير بالذكر الإشارة إلى أن Geminin (مخضر) وCdt1 (مضان أحمر) البروتينات المستخدمة لتصميم نظام FUCCI 23 عرضت في وقت سابق أن أعرب بوفرة من قبل الأسلاف العصبية خلال الخلايا العصبية في وقت مبكر من الفئران 30 و في الدماغ الكبار الأنسجة 9،25 . على الرغم من أن mKO2-hCdt1 (30/120) بناء وتستخدم أساسا في هذه الدراسة لمتابعة المرحلة G1 مع مضان أحمر، واستخدام كل من يبني [mKO2-hCdt1 (30/120) وMAG-hGem (1/110) ] يمكن تصوره للسماح التصور للمراحل رئيسية من دورة الخلية (G 1 و 2 SG / M) وكذلك G 1 / S انتقال 23. العيب الرئيسي للتصوير ثنائي اللون هو مجموعات متوافقة محدودة من مضان التي ما زالت قائمة يمكن استخدامها لوضع العلامات الخلية. حل واحد هو استخدام separatiعلى أعمدة. على سبيل المثال، قمنا المنضب بنجاح الكسر-CD24 إيجابي من الخلايا باستخدام أعمدة الفصل قبل الخلية الفرز والعيش التصوير كما كنا الأجسام المضادة CD24-PE التي تتقاسم نفس الطول الموجي الانبعاثات من مضان FUCCI-أحمر 25.
وقد حقق عدد قليل من الدراسات طول دورة الخلية من سكان الماوس SVZ الكبار. إجمالي طول دورة الخلية التي تم الحصول عليها مع أسلوبنا على مقربة من أحد يقدر في المختبر عن طريق كوستا وآخرون 21، ولكن تمكنا للمرة الأولى على التمييز بين مختلف مراحل دورة الخلية. في الدراسة المجراة، بونتي وآخرون. 22 استخدام إدماج النظير ثيميدين لتحديد ديناميكية انتشار مختلف السكان الخلية SVZ. ومع ذلك، فإنها يمكن أن لا إجراء المراقبة المستمرة للدورة الخلية ولا تتبع الخلايا على مستوى خلية واحدة. وهذا يمكن أن يكون مشكلة كما تبين أن عدم التجانس قوي موجود الطرافةهين السكان الخلية SVZ نظرا 22،25. وصفنا هنا بديل في تقنية المختبر، من السهل اقامة، التي تسمح للتصوير حي من مراحل دورة الخلية من البالغين مختلف السكان العصبية على مستوى خلية واحدة.
فهم تنظيم دورة الخلية من الخلايا الجذعية العصبية والأسلاف لا يزال يشكل تحديا لتطوير أساليب علاجية جديدة في سياق شيخوخة الدماغ أو أمراض. وبالتالي يمكن أن بروتوكول لدينا مجموعة واسعة من التطبيقات. في سياق الشيخوخة، ويمكن لهذه التقنية أيضا أن تكون مفيدة لفهم آثار الشيخوخة على NSCs التمايز. في الواقع، فمن الممكن لتحديد الخلايا الجذعية / السلف العصبية دخول المفاضلة كما كثافة الفلورسنت الحمراء لديهم أعلى متميز 26. وأخيرا، فإنه يمكن أيضا أن تكون ذات فائدة لاستغلال التصوير الحي المستمر على مستوى خلية واحدة لدراسة الخلية العمليات الجوهرية وخارجي المسؤولة عن المؤيد النسبزيحان خلفي من NSCs الكبار.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن مدينون لC جوبير، V نوفيل، V Barroca، J Tilliet وجميع موظفي مرافق الحيوان؛ لJ Baijer وN Dechamps لخلية الفرز. O. اتيان للحصول على المساعدة الفنية، وA. Gouret للحصول على المساعدة الإدارية لها. التدفق الخلوي والفرز خلية نفذت في iRCM التدفق الخلوي الموارد المشتركة، التي أنشئت من المنح المقدمة المعدات من DIM-الجذعية القطب، INSERM، مؤسسة ARC، وCEA. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من كهرباء فرنسا (EDF). MD ديه زمالة من La الدوري الفرنسي مناهضة للسرطان وLM من منطقة إيل-دو-فرانس (DIM Biothérapies). مارك أندريه Mouthon وفرانسوا D. Boussin حصة المشارك كبار التأليف.
Materials
| 96-well uncoated glass bottom culture plates | MatTek Corp. | P96G-1.5-5-F | |
| µ-Plates 96-well | Ibidi | 89626 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A003E | |
| NeuroCult NSC Basal Medium | STEMCELL Technologies | 5700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplement | STEMCELL Technologies | 5701 | |
| Heparin | STEMCELL Technologies | 7980 | |
| EGF | Millipore | GF144 | |
| FGF-2 | Millipore | GF003 | |
| Papain | Worthington | LS003119 | |
| EBSS | Invitrogen | 24010-043 | |
| L-cysteine | Sigma | C-7352 | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Promega | V4231 | |
| DNase I | Sigma | D5025-15KU | |
| Trypsin inhibitor type II | Sigma | T9128 | Ovomucoid |
| DMEM:F12 medium | Life Technologies | 31330-038 | |
| 20 µm filter | BD Medimachine Filcon | 340622 | |
| Eppendorf microtubes 3810X | Sigma | Z606340-1000EA | |
| BSA | Sigma | A1595 | Bovine serum albumin solution |
| CD24 phycoerythrin-cyanine7 conjugate [PC7] | Life Technologies | A14776 | Mouse IgM; clone MMA. 1:50 |
| CD15/LeX fluorescein isothiocyanate [FITC] – conjugated | BD Biosciences | 332778 | Rat IgG2b; clone M1/69. 1:50 |
| Mouse anti-human LeX antibody | BD Pharmingen | 559045 | Mouse IgM; clone MAM. 1:50 |
| Alexa647 – conjugated EGF ligand | Life Technologies | E35351 | 1:200; Ax647-conjugated EGF ligand in the text |
| CompBeads | BD Biosciences | 644204 | |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | separation columns (in the manuscript) |
| Anti-mouse IgM microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-301 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 861405 | HO (in the manuscript) |
| INFLUX cell sorter | BD Biosciences | FACS sorter (in the text) | |
| Nikon A1R confocal laser scanning microscope system attached to an inverted ECLIPSE Ti | Nikon Corp. | confocal laser scanning microscope (in the manuscript) | |
| NIS-Elements AR.4.13.01 64-bit software | Nikon Corp. | NIS-Elements software (in the manuscript) | |
| Plan Apo VC 20x DIC objective (NA: 0.75) | Nikon Corp. | ||
| ECLIPSE Ti thermostated chamber | Nikon Corp. | thermostated chamber (in the manuscript) | |
| ImageJ | RBS | ||
| FlowJo | Tree Star, Ashland, OR | ||
| FUCCI mice | RIKEN BioResource Center, JAPAN | Sakaue-Sawano et al. 2008 |
References
- Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 6387-6392 (2009).
- Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 97, 703-716 (1999).
- Kriegstein, A., Alvarez Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Lois, C., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. Chain migration of neuronal precursors. Science. 271, 978-981 (1996).
- Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez Buylla, A. Adult neural stem cells bridge their niche. Cell stem cell. 10, 698-708 (2012).
- Rietze, R. L., et al. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412, 736-739 (2001).
- Fischer, J., et al. Prospective isolation of adult neural stem cells from the mouse subependymal zone. Nat Protoc. 6, 1981-1989 (2011).
- Daynac, M., et al. Quiescent neural stem cells exit dormancy upon alteration of GABAAR signaling following radiation damage. Stem Cell Res. 11, 516-528 (2013).
- Codega, P., et al. Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche. Neuron. 82, 545-559 (2014).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
- Capela, A., Temple, S. LeX ssea 1 is expressed by adult mouse CNS stem cells identifying them as nonependymal. Neuron. 35, 865-875 (2002).
- Calaora, V., Chazal, G., Nielsen, P. J., Rougon, G., Moreau, H. mCD24 expression in the developing mouse brain and in zones of secondary neurogenesis in the adult. Neuroscience. 73, 581-594 (1996).
- Pineda, J. R., et al. Vascular derived TGF-beta increases in the stem cell niche and perturbs neurogenesis during aging and following irradiation in the adult mouse brain. EMBO Mol Med. 5, 548-562 (2013).
- Lugert, S., et al. Quiescent and active hippocampal neural stem cells with distinct morphologies respond selectively to physiological and pathological stimuli and aging. Cell stem cell. 6, 445-456 (2010).
- Blackmore, D. G., Golmohammadi, M. G., Large, B., Waters, M. J., Rietze, R. L. Exercise increases neural stem cell number in a growth hormone dependent manner augmenting the regenerative response in aged mice. Stem cells. 27, 2044-2052 (2009).
- Bouab, M., Paliouras, G. N., Aumont, A., Forest Berard, K., Fernandes, K. J. Aging of the subventricular zone neural stem cell niche evidence for quiescence associated changes between early and mid adulthood. Neuroscience. 173, 135-149 (2011).
- Enwere, E., et al. Aging results in reduced epidermal growth factor receptor signaling diminished olfactory neurogenesis and deficits in fine olfactory discrimination. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 8354-8365 (2004).
- Maslov, A. Y., Barone, T. A., Plunkett, R. J., Pruitt, S. C. Neural stem cell detection characterization and age related changes in the subventricular zone of mice. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1726-1733 (2004).
- Tropepe, V., Craig, C. G., Morshead, C. M., van der Kooy, D. Transforming growth factor alpha null and senescent mice show decreased neural progenitor cell proliferation in the forebrain subependyma. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 7850-7859 (1997).
- Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138, 1057-1068 (2011).
- Ponti, G., et al. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1045-1054 (2013).
- Sakaue Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).
- Daynac, M., et al. TGFbeta lengthens the G1 phase of stem cells in aged mouse brain. Stem cells. 32, 3257-3265 (2014).
- Roccio, M., et al. Predicting stem cell fate changes by differential cell cycle progression patterns. Development. 140, 459-470 (2013).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse two cultures isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. Journal of visualized experiments JoVE. , e51225 (2014).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres re evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Pastrana, E., Silva Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open a critical review of sphere formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
- Spella, M., et al. Licensing regulators Geminin and Cdt1 identify progenitor cells of the mouse CNS in a specific phase of the cell cycle. Neuroscience. 147, 373-387 (2007).
