Tri cellulaire des neurones cellules souches et progénitrices de la souris adulte-ventriculaire Zone et Live-imagerie de la dynamique de leur cycle cellulaire

Ce protocole a été conçu en conformité avec les Communautés européennes Directive du Conseil du 24 Novembre 1986 (86/609 / CEE) et a été approuvé par notre comité institutionnel de protection des animaux (Cetea CEA-DSV IdF). 1. Configuration de base Avant Culture et vidéomicroscopie Utilisez verre des plaques de culture de fond ou u-plaques pour la microscopie confocale vidéo. Pour: 1 – 5 x 10 3 cellules / puits, utiliser des plaques à 96 puits et les plaques à 24 puits pendant plus de 5 x 10 3 cellules / puits. Au moins un jour avant de commencer l'expérience, la préparation de poly-D-lysine (PDL) stérile plaques revêtues de cultures monocouches adhérentes. Ajouter suffisamment PDL (10 pg / ml dans dH2O) pour recouvrir le fond de chaque puits et incuber O / N à 37 ° C. Retirer la solution PDL et rincer trois fois avec dH 2 O avant de permettre à la plaque sécher dans la hotte pendant au moins 2 heures sous un flux laminaire. Si pas utilisé immédiatement, stocker la plaque revêtue à-20 ° C. Préparer le milieu de culture en mélangeant NSC Basal Medium et Supplément NSC prolifération à 9: 1 (voir tableau Matériau) avec 2 ug / ml d'héparine, 20 ng / ml de facteur de croissance épidermique humain recombinant purifié (FEM), et 10 ng / ml facteur humain de croissance des fibroblastes recombinant 2 (FGF-2). Chauffer le milieu de culture à 37 ° C dans un bain d'eau avant utilisation. Pour la dissociation SVZ, préparer une solution de papaïne: 1 mg / ml de papaïne (15 UI / ml) dans la balance solution saline de Earl (EBSS) contenant 0,2 mg / ml de L-cystéine, 0,2 mg / ml d'EDTA, et 0,01 mg / ml de DNase I dans du PBS. Stériliser la solution par passage à travers un filtre de 0,2 um. Equilibrer la solution à 37 ° C avant utilisation. Pour arrêter la réaction enzymatique, préparer une solution de inhibiteur de la protéase (ovomucoïde): milieu F12 contenant 0,7 mg / ml de trypsine de type II inhibiteur: DMEM. Filtrer la solution à l'aide d'un filtre de 0,2 um. Préparer PBS 0,6% solution de glucose à recueillir les cerveaux et PBS 0,15% de BSA sOlution pour les étapes de lavage et pour la coloration des anticorps. Préparer les outils de dissection: ciseaux, disséquer et attachant forceps, scalpel. Faites-les tremper dans 70% d'éthanol. 2. La récolte de souris adultes Brains et SVZ Microdissections Sacrifice adultes FUCCI souris 23 (2 à 3-month-old et / ou 12-month-old pour des études de vieillissement) effectuer une dislocation cervicale conformément aux directives institutionnelles appropriées. Vaporiser la souris en utilisant 70% d'éthanol et de couper la tête à l'aide des ciseaux pointus. Faire une incision le long du cuir chevelu pour révéler le crâne. Effectuer une coupe longitudinale de la ligne médiane à partir de la base du crâne vers les bulbes olfactifs en utilisant une petite paire de ciseaux. Assurez-vous de ne pas endommager le cerveau sous-jacente avec les lames de ciseaux. Retirer la partie supérieure ouverte du crâne avec des pinces courbes pour exposer le cerveau. Recueillir le cerveau dans une boîte de Pétri de 15 mm contenant 0,6% de glucose dans du PBS. réissect loin les bulbes olfactifs. Placez le cerveau sur sa surface dorsale et faire une coupe coronale à travers le chiasma optique utilisant un scalpel. Sous un microscope de dissection, positionner la partie rostrale de la section du cerveau avec la surface coronale coupe vers le haut vers l'expérimentateur. Pour disséquer le SVZ, retirez la cloison avec une pince fine courbes puis insérez une pointe d'une pince fine dans le striatum immédiatement adjacente au ventricule et détacher le SVZ du tissu environnant. Pour plus de détails, reportez-vous à Azari et al. 24. Placer la SVZ disséqué dans une boîte de Pétri contenant 1 ml de PBS-0,6% de glucose. 3. SVZ dissociation tissulaire Émincer le SVZ disséqué dans la boîte de Pétri jusqu'à ce qu'aucun gros morceaux restent. Transférer le tissu haché avec le% de glucose PBS-0,6 dans un tube de 15 ml et centrifuger à 200 g pendant 5 min. Jeter le surnageant et ajouter 1 ml de papaïne préchauffé (1mg / ml, préparé à l'étape 1.4) additionné de 0,01 mg / ml de DNase I. Incuber pendant 10 min dans un bain-marie à 37 ° C. Utiliser 1 ml de papaïne par souris. Centrifuger à 200 g pendant 5 min et jeter le surnageant. Ajouter 1 ml de pré-chauffé ovomucoïde (0,7 mg / ml, préparé à l'étape 1.5) pour arrêter l'activité de la papaïne. Mécaniquement dissocier le tissu haché plus loin dans une suspension à cellule unique par pipetage doucement monter et descendre 20 fois à travers une pointe de micropipette P1000. Évitez les bulles d'air. Faire passer la suspension de cellules à travers un filtre stérile de 20 um dans un nouveau tube de 15 ml. Assurez-vous de laver le filtre cellulaire avec du PBS 0,15% de BSA pour éviter de perdre des cellules. Centrifuger à 200 g pendant 10 min et jeter le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 100 ul de PBS contenant 0,15% de BSA. 4. immunofluorescence pour Tri cellulaire Pour le tri de cellules en utilisant FUCCI-Rouge souris (figure 2A), utilisez la commande suivante: anticorps CD24 conjugué à la phycoérythrine cyanine7 [PC7]; CD15 / LeX isothiocyanate de fluorescéine [FITC] conjugué et Ax647 ligand EGF conjugué. Remarque: LEX + EGFR + et les cellules EGFR + cellules ne sont pas abondantes dans la SVZ adulte: ≈ 600 et 1500 cellules / souris respectivement 9. Nous recommandons la mise en commun des cellules SVZ de 2 à 3 souris d'avoir assez de matériel. Ne pas travailler avec plus de 12 souris, le même jour de sorte que la durée de tri cellulaire ne dépasse pas 3 heures. Gardez à l'esprit que le travail avec trop de souris sur le même jour conduira à une augmentation de la durée de tri cellulaire qui peut entraîner une augmentation de la mort cellulaire et / ou la différenciation cellulaire. Effectuer la coloration FACS dans 100 ul de PBS 0,15% de BSA par souris (ou dans 200 pl d'un groupe de 2 à 3 souris pour la coloration optimale). Préparer les tubes témoins. Utilisez des perles de compensation pour préparer des tubes de contrôle de la couleur unique selon le fabricantLe protocole; 9. Sélectionnez une fraction de cellules (1/10 des cellules extraites d'une souris est suffisant) et le séparer en 4 tubes pour préparer 1 tube de contrôle négatif (cellules non marquées) et 3 fluorescence moins un (FMO) tubes de contrôle. Resuspendre les cellules dans 200 ul de PBS 0,15% de BSA par tube. Astuce: Pour un contrôle LEX-FITC FMO, étiqueter les cellules avec CD24-PC7 (01h50) et le ligand EGF Ax647-conjugué (1: 200); pour le contrôle CD24-PC7 FMO, étiqueter les cellules avec CD15 / LEX-FITC (1:50) et Ax647 conjugué EGF ligand (1: 200) et pour Ax647 conjugué contrôle de la FMO ligand EGF, étiqueter les cellules avec CD15 / Lex- FITC (01:50) et CD24-PC7 (1:50). Pour les tubes utilisés pour le tri de cellules, utiliser les anticorps suivants à la dilution indiquée dans du PBS 0,15% de BSA: CD24-PC7 (01:50), CD15 / LEX-FITC (01:50) et le ligand EGF Ax647-conjugué (1: 200). Incuber pendant 20 min à 4 ° C dans l'obscurité. Laver avec 1 ml de PBS 0,15% de BSA et centrifuger à 200 g pendant 10 min. Reprendre les cellules dans 20081; l de PBS 0,15% de SAB par le cerveau. Gardez les tubes de tri de cellules sur la glace et procéder immédiatement à la tri cellulaire. Si vous utilisez la souris FUCCI-Vert, fractions LEX-positifs et négatifs LEX-séparés en utilisant des colonnes de séparation avant le tri de cellules que les actions anticorps LEX-FITC la même longueur d'onde d'émission de la fluorescence FUCCI-vert (figure 3A, B). Tout d'abord, marquer les cellules avec un LEX-anticorps anti-humain de souris (1:50) pendant 15 minutes à 4 ° C dans l'obscurité dans 100 ul de PBS 0,15% de BSA. Laver les cellules avec 1 ml de PBS 0,15% de BSA et centrifuger à 200 g pendant 10 min, puis marquer les cellules avec des microbilles IgM anti-souris (1:10) pendant 15 minutes à 4 ° C dans l'obscurité. Laver les cellules avec 1 ml de PBS 0,15% de BSA et centrifuger à 200 g pendant 10 min. Resuspendre les cellules dans 500 ul de PBS 0,15% de BSA et les cellules d'écoulement à travers la colonne de séparation dans un champ magnétique comme schématisé sur la figure 3 C. Laver la colonne avec 1 ml de PBS 0,15% de BSA d'obtenir LeX fraction négative. Pour obtenir fraction LEX-positif, supprimer la colonne de séparation du champ magnétique et éluer les cellules avec 2 ml de PBS 0,15% de BSA. Passez à CD24-PC7 et Ax647 conjugué ligand EGF coloration comme indiqué en 4.2. 5. Tri cellulaire Note: Les cellules ont été triées sur un trieur FACS à 40 psi avec un noozle 86 um. La fluorescence a été recueillie à l'aide de l'ensemble de filtre suivant: 520 / 35nm (FITC), 575 / 26nm (PE), 670 / 20nm (Ax647) et 740LP (PC7). La rémunération est nécessaire pour empêcher des signaux faux positifs comme un chevauchement est découvert entre les spectres d'émission de la fluorescence FUCCI-rouge et le colorant PC7. Immédiatement avant le tri de cellules, ajouter un colorant vital de discriminer en direct à partir de cellules mortes. Nous avons utilisé HO (voir tableau des matériaux) à 2 pg / ml de concentration finale. Exécutez le tube de contrôle négatif (cellules non marquées) à travers le trieur FACS et sélectionnez ecellules e utilisant la diffusion latérale (SSC) et diffusion vers l'avant (FSC) paramètres (figure 1A). REMARQUE: Les cellules mortes ont été exclus par gating seule la fraction HO-négative (figure 1A) puis doublets ont été exclues par la sélection de la largeur d'impulsion fraction négative (figure 1A ''). Exécutez les commandes de couleur simples préparés à l'étape 4.2 et ajuster le tube photomultiplicateur (PMT) tensions (échelle de cellules-à-dire la population négative trop élevées et / ou positifs off) si nécessaire. Effectuer la compensation de couleur dans la fenêtre de compensation du logiciel. Exécuter FMO contrôle préparé à l'étape 4.2 (LEX-FITC contrôle FMO, CD24-PC7 contrôle FMO et le contrôle de la FMO ligand EGF Ax647-conjugué) et tirer les portes de tri (Figure 1). Trier les cellules directement dans 100 pi de milieu de culture dans 1,5 ml microtubes. 6. Préparation des cellules pour la microscopie Plaque la cellule fraîchement triés à une densité de 1-3 x 10 3 cellules / puits de poly-D-revêtus de lysine 96 puits μ-Plate avec 300 pi de milieu de culture. Avant la microscopie vidéo, incuber les plaques de culture à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant au moins 1 heure pour permettre l'adhésion cellulaire. 7. Configuration de microscope et l'acquisition d'images Effectuer une imagerie en temps réel en utilisant un objectif 20x Plan Apo VC DIC (NA: 0,75) sur un système de microscope à balayage laser à foyer commun fixé à une chambre thermostatée renversé à 37 ° C sous 5% de CO 2 atmosphère. Positionner le 96 puits μ-Plate intérieur de la chambre thermostatée préchauffé et équilibrée et remplacer le couvercle par un couvercle thermostaté. Ouvrez le logiciel NIS-Elements et cliquez dans la barre de menu sur "Acquérir / Acquisition contrôle / acquisition ND" pour sélectionner les options du time-lapse (longueur, les positions de la scène, z-sections confocale, …), «acquérir / contrôles d'acquisition / Pad Ti221; pour sélectionner les objectifs et «Acquérir / contrôles d'acquisition / A1plus Paramètres" pour sélectionner le niveau de PMT pour chaque fluorescence dans la barre de menu. Sélectionnez un dossier pour enregistrer les fichiers de données. Utilisation de la fenêtre d'acquisition ND, définir le centre de chaque puits comme une position de scène et sélectionnez l'option de grande image pour 7 x 7 mm². Ceci créera une image mosaïque autour du centre de chaque puits. Réglez le recouvrement de la grande mosaïque d'images à 5%. Prenez des photos toutes les 20 min pendant 24 heures. Sélectionnez l'objectif Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0,75) dans la fenêtre Ti Pad. Dans la fenêtre Paramètres A1plus, acquérir des images à l'aide de résonance scanner haute vitesse à un format de 512 x 512 pixels avec une résolution de 1,26 um / pixel. Utilisez fond clair de visualiser des formes cellulaires. Dans le cas des souris FUCCI-Rouge, exciter la fluorescence rouge à 561 nm et de recueillir l'aide d'un filtre 595/50 nm. Dans le cas des souris FUCCI-Vert, exciter la fluorescence verte à 488 nm et de recueillir l'aide d'un filtre 530/40 nm. Déterminer le PM optimaleNiveau de T, le décalage et la puissance du laser pour chaque longueur d'onde. NOTE: Nous vous recommandons d'utiliser la fonction de mise au point automatique pour le canal de fond clair pour permettre au logiciel mise au point automatique à chaque position de scène avant chaque acquisition. Astuce: Un objectif Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0,75) a été utilisé pour son excellente résolution sans la nécessité pour le pétrole. D'autres objectifs peuvent être utilisés en fonction de la résolution optique souhaitée. Sélectionnez le bouton "Exécuter maintenant" sur la fenêtre d'acquisition ND pour commencer l'acquisition. Astuce: Suivez le travail de l'ordinateur pour une boucle pour être sûr que tout fonctionne correctement. 8. Traitement et analyse d'images Analyser les données directement sur le logiciel NIS-Elements en suivant les cellules individuellement. Astuce: Pour gagner du temps, économiser de chaque position au format .avi utilisant le logiciel NIS-Elements et d'analyser les films avec ImageJ. Dans le logiciel ImageJ, le suivi des cellules individuelles subissant au moins 2 divisions (ie une cellule àune colonie à quatre cellules). Recadrage d'une petite zone autour de la cellule et sélectionnez 'image / Dupliquer'. Sélectionnez 'image / Piles / Faire Montage »dans la barre de menu pour faire un montage. Spécifiez les vues à inclure, la taille des images et enregistrez le montage comme un fichier .tif pour une résolution optimale. Pour calculer le premier SG 2 / m de longueur de phase (figure 2C, D), sélectionnez une seule cellule rouge fluorescent (en G 1), puis réglez de T = 0 (phase S débutera une fois que la fluorescence rouge éteint). Comptez le nombre de trames jusqu'à ce que la cellule se divise pour estimer la longueur SG 2 / M. NOTE: Le temps calculé dépend de l'intervalle de temps entre chaque trame. Pour calculer la phase G1 suivante (figure 2C, D), continuer à suivre la cellule qui vient divisé. Si la cellule en phase G1 divisé entre, il y aura une accumulation de la protéine fluorescente rouge-CDT1. Calculer le nombre de trames jusqu'à fluorescence rouge éteint agaen pour chaque cellule. Astuce: Au début de G 1 la fluorescence rouge pourrait être faible afin de choisir le début de la phase G 1 sur le cadre où la cellule a divisé pour éviter les approximations.