Clasificación celular del Neuronales madre y progenitoras Las células del adulto Ratón zona subventricular y Live-imágenes de sus Dinámica del Ciclo Celular

Este protocolo ha sido diseñado de acuerdo con las Comunidades Europeas Directiva del Consejo, de 24 de noviembre de 1986 (86/609 / CEE) y ha sido aprobado por nuestro bienestar animal comité institucional (CETEA-CEA DSV IDF). 1. Configuración básica Antes de la cultura y videomicroscopia Utilice vidrio placas de cultivo de fondo o mu-placas para microscopía confocal de vídeo. 1 – 5 x 10 3 células / así, utilizar placas de 96 pocillos y las placas de 24 pocillos durante más de 5 x 10 3 células / pocillo. Al menos un día antes de comenzar el experimento, preparar poli-D-lisina (PDL) estéril placas recubiertas para cultivos monocapa adherentes. Agregar suficiente PDL (10 mg / ml en dH2O) para cubrir el fondo de cada pocillo e incubar O / N a 37 ° C. Retire la solución PDL y enjuagar tres veces con dH2O antes de permitir que la placa se seque en la campana durante al menos 2 horas bajo un flujo laminar. Si no se utiliza inmediatamente, almacenar la placa recubierta en-20 ° C. Preparar medio de cultivo mediante la mezcla de NSC Basal Medium y NSC proliferación Suplemento en una relación 9: 1 (ver tabla de materiales), junto con 2 mg / ml de heparina, 20 ng / factor humano purificado ml de crecimiento epidérmico recombinante (EGF), y 10 ng / ml factor de crecimiento de fibroblastos humano recombinante 2 (FGF-2). Calentar el medio de cultivo a 37 ° C en un baño de agua antes de su uso. Para la disociación SVZ, preparar la solución de papaína: 1 mg / ml de papaína (15 UI / ml) en el equilibrio salino Solución de Earl (EBSS) que contenía 0,2 mg / ml de L-cisteína, 0,2 mg / ml de EDTA, y 0,01 mg / ml de DNasa I en PBS. Esterilizar la solución haciéndola pasar a través de un filtro de 0,2 micras. Equilibrar la solución a 37 ° C antes de su uso. Para detener la reacción enzimática, preparar una solución de inhibidor de proteasa (ovomucoide): medio F12 que contiene 0,7 mg / ml de tripsina inhibidor de tipo II: DMEM. Filtrar la solución usando un filtro de 0,2 micras. Preparar PBS 0,6% solución de glucosa para recoger los cerebros y PBS 0,15% de BSA sOLUCIÓN para los pasos de lavado y para la tinción de anticuerpos. Preparar herramientas de disección: tijeras, disección y atando unas pinzas, bisturí. Remojar en etanol al 70%. 2. La recolección de Adult ratón cerebros y SVZ microdisecciones Sacrificio adultos FUCCI ratones 23 (2 a 3 meses de edad y / o de 12 meses de edad, para el envejecimiento de estudios) la realización de una dislocación cervical de conformidad con las directrices institucionales apropiados. Rocíe el ratón usando el 70% de etanol y cortar la cabeza con unas tijeras afiladas. Hacer una incisión a lo largo del cuero cabelludo para revelar el cráneo. Realizar un corte en la línea media longitudinal a partir de la base del cráneo hacia los bulbos olfatorios utilizando un pequeño par de tijeras. Asegúrese de no dañar el cerebro subyacente con las hojas de las tijeras. Retire la parte abierta superior del cráneo con pinzas curvas para exponer el cerebro. Recoger el cerebro en una placa de Petri de 15 mm que contiene 0,6% de glucosa en PBS. Dissect distancia los bulbos olfatorios. Coloque el cerebro en su superficie dorsal y hacer una sección coronal a través del quiasma óptico utilizando un bisturí. Bajo un microscopio de disección, coloque la parte rostral de la sección del cerebro con la superficie coronal corte hacia arriba hacia el experimentador. Para diseccionar la SVZ, quitar el tabique con unas pinzas finas curvas a continuación, insertar un consejo de una multa con fórceps en el cuerpo estriado inmediatamente adyacente al ventrículo y separar la SVZ del tejido circundante. Para más detalles, consulte Azari et al. 24. Coloque la SVZ diseccionado en una placa de Petri que contiene 1 ml de PBS-0,6% de glucosa. 3. SVZ Tissue Disociación Picar la SVZ diseccionado en la placa de Petri hasta que no haya piezas grandes se mantienen. Transferir el tejido picado junto con el% de glucosa PBS-0,6 a un tubo de 15 ml y centrifugar a 200 xg durante 5 min. Descartar el sobrenadante y añadir 1 ml de papaína precalentado (1mg / ml, preparado en la etapa 1.4) suplementado con 0,01 mg / ml de DNasa I. Incubar durante 10 min en un baño de agua a 37 ° C. Utilice 1 ml de papaína por ratón. Centrifugar a 200 xg durante 5 min y descartar el sobrenadante. Añadir 1 ml de pre-calentado ovomucoide (0,7 mg / ml, preparado en el paso 1.5) para detener la actividad de la papaína. Mecánicamente disociar el tejido picado aún más en una suspensión de una sola célula pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 20 veces a través de una punta de la micropipeta p1000. Evite las burbujas de aire. Pasar la suspensión celular a través de un filtro de 20 micras estéril en un nuevo tubo de 15 ml. Asegúrese de lavar el filtro de células con PBS 0,15% BSA para evitar la pérdida de células. Centrifugar a 200 xg durante 10 min y descartar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 100 l de PBS que contenía 0,15% de BSA. 4. La tinción de inmunofluorescencia para la clasificación de células Para la clasificación celular usando-FUCCI Red ratones (Figura 2), utilice la siguienteanticuerpos CD24 conjugado con ficoeritrina:-cyanine7 [PC7]; CD15 / LeX isotiocianato de fluoresceína [FITC] conjugados y Ax647 ligando EGF conjugado. Nota: Las células LeX + EGFR + y células EGFR + no son abundantes en la SVZ adultos: ≈ ​​600 y 1500 células / ratón, respectivamente 9. Se recomienda poner en común las células SVZ de 2 a 3 ratones para tener suficiente material. No trabaje con más de 12 ratones en el mismo día por lo que la duración de clasificación de células no exceda de 3 horas. Tenga en cuenta que el trabajo con demasiados ratones en el mismo día dará lugar a un aumento de la duración de la clasificación celular, posiblemente, lo que resulta en aumento de la muerte celular y / o diferenciación celular. Realice la tinción FACS en 100 l de PBS 0,15% de BSA por ratón (o en 200 l para un grupo de 2 a 3 ratones para la tinción óptima). Preparar los tubos de control. Utilice cuentas de compensación para preparar los tubos individuales de control de color de acuerdo con el fabricante9; s protocolo. Seleccionar una fracción de células (1/10 de las células extraídas de un ratón es suficiente) y separarlo en 4 tubos para preparar tubo 1 control negativo (células sin marcar) y 3 fluorescencia menos uno (FMO) tubos de control. Resuspender las células en 200 l de PBS 0,15% de BSA por tubo. Sugerencia: Para un control LEX-FITC FMO, etiquetar las células con CD24-PC7 (1:50) y el ligando EGF Ax647 conjugado (1: 200); para el control de CD24-PC7 FMO, etiquetar las células con CD15 / LEX-FITC (1:50) y Ax647 conjugado ligando EGF (1: 200) y para conjugado Ax647 control de FMO ligando EGF, etiquetar las células con CD15 / LEX FITC (1:50) y CD24-PC7 (01:50). Para los tubos utilizados para la clasificación de células, utilice los siguientes anticuerpos a la dilución indicada en PBS 0,15% de BSA: CD24-PC7 (01:50), CD15 / LEX-FITC (1:50) y el ligando EGF Ax647 conjugado (1: 200). Incubar durante 20 min a 4 ° C en la oscuridad. Lavar con 1 ml de PBS 0,15% de BSA y centrifugar a 200 xg durante 10 min. Resuspender las células en 20081; l de PBS 0,15% BSA por cerebro. Mantenga los tubos de clasificación de células en hielo y proceder de inmediato a la clasificación de células. Si el uso de ratones FUCCI-Verdes, fracciones LEX-positivas y Lex-negativas separadas utilizando columnas de separación antes de clasificación de células como las acciones de anticuerpos LEX-FITC la misma longitud de onda de emisión de la fluorescencia FUCCI-verde (Figura 3A, B). En primer lugar, etiquetar las células con un ratón LEX-anticuerpo anti-humano (1:50) durante 15 minutos a 4 ° C en la oscuridad en 100 l de PBS 0,15% de BSA. Lavar las células con 1 ml de PBS 0,15% de BSA y centrifugar a 200 xg durante 10 min, a continuación, marcar las células con microperlas de IgM anti-ratón (1:10) durante 15 minutos a 4 ° C en la oscuridad. Lavar las células con 1 ml de PBS 0,15% de BSA y centrifugar a 200 xg durante 10 min. Resuspender las células en 500 l de PBS 0,15% de BSA y se vierte a través de las células de la columna de separación en el campo magnético como se esquematiza en la Figura 3 C. Lavar la columna con 1 ml de PBS 0,15% BSA para obtener la fracción negativa LeX. Para obtener fracción LEX-positivo, retire la columna de separación del campo magnético y eluir las células con 2 ml de PBS 0,15% de BSA. Proceda a las manchas ligando EGF CD24-PC7 y Ax647 conjugado como se indica en 4.2. 5. Cell Sorting Nota: Las células fueron ordenados en un clasificador FACS a 40 psi con un 86 micras noozle. La fluorescencia se recogió mediante el siguiente conjunto de filtro: 520/35 nm (FITC), 575 / 26nm (PE), 670 / 20nm (Ax647) y 740LP (PC7). La compensación es necesaria para evitar que las señales de falsos positivos como una superposición se encuentra entre los espectros de emisión de la fluorescencia FUCCI rojo y el tinte PC7. Inmediatamente antes de la clasificación de células, añadir un colorante vital para discriminar en vivo de las células muertas. Utilizamos HO (ver tabla de materiales) a / ml de concentración final de 2 mg. Ejecute el tubo de control negativo (células no marcadas) a través del clasificador FACS y seleccione ªcélulas correos utilizando dispersión lateral (SSC) y la dispersión frontal (FSC) parámetros (Figura 1A). NOTA: Las células muertas se excluyeron por gating sólo la fracción HO-negativo (Figura 1A ') y luego dobletes fueron excluidos por la selección de la fracción de ancho de pulso negativo (Figura 1A' '). Ejecutar los controles individuales de color preparados en la etapa 4.2 y ajustar el tubo fotomultiplicador (PMT) tensiones (es decir, células escala población negativa demasiado alta y / o positivos off) si es necesario. Realizar compensación de color en la ventana de compensación del software. Ejecutar FMO controla preparado en el paso 4.2 (control LEX-FITC FMO, CD24-PC7 control de FMO y Ax647 conjugado de control FMO ligando EGF) y dibujar las puertas de clasificación (Figura 1). Ordenar las células directamente en 100 l de medio de cultivo en microtubos de 1,5 ml. 6. Preparación de las células para microscopía Placa de la célula recién ordenadoss a una densidad de 1 – 3 x 10 3 células / pocillo en poli-D-Lisina recubiertas de 96 pocillos μ-Plate con 300 l de medio de cultivo. Antes de la microscopía de video, se incuban las placas de cultivo a 37 ° C y 5% de CO 2 al menos por 1 hora para permitir la adhesión celular. Configuración 7. Microscopio y Adquisición de imágenes Realizar imágenes en vivo usando un objetivo del Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0.75) en un sistema de microscopio de barrido láser confocal conectado a una cámara con termostato invertida a 37 ° C en 5% de CO 2 atmósfera. Coloque el 96 pocillos μ-Placa interior de la cámara con termostato precalentado y se equilibró y reemplace la tapa por una cubierta con termostato. Abra el software de NIS-Elements y haga clic en la barra de menú en "Adquirir / Adquisición controla / ND adquisición" para seleccionar las opciones del time-lapse (longitud, posiciones de la etapa, z secciones confocal, …), "Adquirir controles / Adquisición / Ti Pad221; para seleccionar los objetivos y "Adquirir / controles de adquisición / A1plus Configuración" para seleccionar el nivel de PMT para cada fluorescencia en la barra de menú. Seleccione una carpeta para guardar los archivos de datos. Uso de la ventana de adquisición ND, establezca el centro de cada uno, así como una posición escenario y seleccione la opción de imagen de gran tamaño de 7 x 7 mm ². Esto creará una imagen de mosaico alrededor del centro de cada pocillo. Ajuste el solapamiento de la gran imagen de mosaico y el 5%. Hacer fotos cada 20 minutos durante 24 horas. Seleccione el objetivo del Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0,75) en la ventana de Ti Pad. En la ventana A1plus Configuración, adquirir imágenes utilizando el escáner de resonancia de alta velocidad en un formato de 512 x 512 píxeles con una resolución de 1,26 m / pixel. Use campo claro de visualizar formas celulares. En el caso de los ratones FUCCI-Rojas, excitar la fluorescencia roja de 561 nm y recoger usando un 595/50 nm filtro. En el caso de los ratones FUCCI-Green, excitar la fluorescencia verde a 488 nm y recoger usando un 530/40 nm filtro. Determinar la PM óptimaNivel T, offset y la potencia del láser para cada longitud de onda. NOTA: Recomendamos el uso de la función de enfoque automático para el canal de campo claro para que el software para el enfoque automático en cada posición de la etapa antes de cada adquisición. Sugerencia: Un Plan Apo VC 20x objetivo DIC (NA: 0,75) fue utilizado por su excelente resolución, sin necesidad de aceite. Otros objetivos pueden ser utilizados dependiendo de la resolución óptica deseada. Seleccione el botón "Ejecutar ahora" en la ventana de adquisición ND para empezar adquisición. Sugerencia: Siga el equipo de trabajo de 1 lazo para asegurarse de que todo en el trabajo correctamente. 8. Procesamiento y Análisis de Imágenes Analizar los datos directamente en el software de NIS-Elements mediante el seguimiento de las células de forma individual. Sugerencia: Para ganar tiempo, ahorrar cada posición en formato .avi utilizando software NIS-Elements y analizar las películas con ImageJ. En el software ImageJ, realizar un seguimiento de las células individuales se someten a por lo menos 2 divisiones (es decir, una célula auna colonia de cuatro celdas). Recortar una pequeña área alrededor de la celda y seleccione 'Imagen / Duplicar'. Seleccione "Imagen / Pilas / Hacer Montage 'en la barra de menú para hacer un montaje. Especifique los marcos que se incluirán, el tamaño de las imágenes y guardar el montaje como un archivo .tif de resolución óptima. Para el cálculo de la primera SG 2 / M fase de longitud (Figura 2 C, D), seleccione una sola célula fluorescente roja (en G 1) y luego ponga t = 0 (fase S se iniciará una vez que la fluorescencia roja se apaga). Contar el número de fotogramas hasta que la célula se divide para estimar la longitud SG 2 / M. NOTA: El tiempo calculado depende del intervalo de tiempo entre cada fotograma. Para calcular la siguiente fase G1 (Figura 2C, D), continúe para realizar un seguimiento de la célula que simplemente dividido. Si la célula dividida entra en la fase G1, habrá una acumulación de la proteína fluorescente de color rojo-Cdt1. Calcular el número de fotogramas hasta rojo-fluorescencia se apaga agaen para cada celda. Sugerencia: Al comienzo de G 1 la fluorescencia roja podría ser débil así que elige el inicio de la fase G 1 en el marco donde la célula se ha dividido para evitar aproximaciones.