セル成体マウス脳室下帯から神経幹細胞および前駆細胞の選別とその細胞周期ダイナミクスのライブイメージング

このプロトコルは、11月24日の欧州共同体理事会、1986（609分の86 / EEC）に準拠して設計されており、当社の動物福祉制度委員会（CETEA-CEA DSV IDF）によって承認されています。 培養前とビデオ顕微鏡1.基本設定共焦点ビデオ顕微鏡用ガラス底培養プレートまたはμ-プレートを使用してください。 1の場合- 5×10 3細胞/ウェル、よく以上5×10 3細胞 / 96ウェルプレート、24ウェルプレートを使用しています。 少なくとも一日前に実験を開始し、接着単層培養のための滅菌ポリ-D-リジン（PDL）でコーティングしたプレートを準備します。各ウェルの底部を被覆するために十分なPDL（のdH 2 O中10μg/ mlの）を追加し、37℃でO / Nインキュベートします。 PDL溶液を除去し、プレートを層流の下で、少なくとも2時間の間にフードで乾燥させる前のdH 2 Oで3回すすいでください。すぐに使用しない場合は、でコーティングされたプレートを保存します-20℃。 9でNSC基礎培地およびNSC増殖サプリメントを混合することにより、培養液を準備：1の比率を2μg/ mlのヘパリン、20 ngの/ mlの精製ヒト組換え上皮増殖因子（EGF）、および10 ngの/ mlのと一緒に（材料表を参照してください）ヒト組み換え線維芽細胞増殖因子2（FGF-2）。使用前に37℃の水浴中に培地をウォームアップ。 SVZ解離のために、パパイン溶液を調製：1mg / mlのパパイン0.2 mg / mlのL-システイン、0.2 mg / mlのEDTA、および0.01 mg / mlのDNアーゼIを含有するアールのバランス塩溶液（EBSS）中の（15 UI / ml）をPBSインチ0.2μmのフィルターを通過することにより、溶液を滅菌します。使用前に37℃で溶液を平衡化。 DMEM：F12培地0.7 mg / mlのトリプシンインヒビターII型を含む酵素反応を停止するには、プロテアーゼ阻害剤溶液（オボムコイド）を準備します。 0.2μmのフィルターを使用してソリューションをフィルタリングします。 脳およびPBS 0.15％BSAのPBSを収集するために0.6％のグルコース溶液を調製します洗浄工程および抗体染色のためのolution。 ハサミ、ピンセットを解剖し、結ぶ、メス：解剖ツールを準備します。 70％エタノールでそれらを浸します。 2.収穫成体マウスの脳とSVZ Microdissections 犠牲成人FUCCIマウス23（老化研究のための2から3ヶ月齢および/ ​​または12ヶ月齢）は、適切な機関のガイドラインに従う頸椎脱臼を行います。 70％エタノールを用いてマウスをスプレーし、鋭いハサミを使用してヘッドをカット。 頭蓋骨を明らかにするために、頭皮に沿って切開してください。 はさみの小さなペアを使用して嗅球に向けて頭蓋底から始まる縦正中線のカットを行います。はさみの刃で、基礎となる脳の損傷を避けるようにしてください。脳が露出するように湾曲鉗子で頭蓋骨の上部の開口部を削除します。 PBS中の0.6％グルコースを含む15ミリメートルのペトリ皿に脳を収集します。 D嗅球を離れissect。その背側表面に脳を置き、メスを用いて視交叉を通じて冠状断面を作ります。 解剖顕微鏡下では、実験者に向かって上向きにカットコロナル面で脳切片の吻側部分を配置します。 、SVZを分析細かい曲がったピンセットでセプタムを削除するには、次に心室にすぐ隣接する線条体に微細な鉗子の先端を挿入し、周囲の組織からSVZを切り離します。詳細については、Azari ら。24を参照してください。 PBS-0.6％グルコースの1ミリリットルを含むペトリ皿に解剖SVZを置きます。 3. SVZの組織解離大きな作品が残っていないまで、ペトリ皿に解剖SVZをみじん切り。 5分間200×gで15ミリリットルチューブと遠心分離機にPBS-0.6％グルコースと一緒にみじん切りの組織を転送します。 上清を捨て、予め温めておいたパパインの1ミリリットルを追加します（1mg / mlで、37℃の水浴中で10分間、0.01 mg / mlのDNアーゼIをインキュベートを補充した）ステップ1.4で調製しました。マウスあたりパパインの1ミリリットルを使用してください。 5分間200×gで遠心分離し、上清を捨てます。 パパインの活動を停止する（0.7 mg / mlの、ステップ1.5で調製した）オボムコイド予め温めておいた1mlのを追加します。機械的に優しくP1000マイクロピペット先端を下に20回ピペッティングにより単一細胞懸濁液にさらに細分化した組織を解離します。気泡を避けてください。 新しい15mlチューブに無菌の20μmのフィルターを通して細胞懸濁液を渡します。細胞が失われないように、PBS 0.15％BSAで細胞フィルターを洗浄することを確認します。 10分間200×gで遠心分離し、上清を捨てます。再懸濁0.15％BSAを含む100μlのPBSで細胞を。 細胞選別のための4免疫蛍光染色セルはFUCCIレッドマウス（ 図2A）を使用してソートするため、以下を使用します抗体：CD24フィコエリトリンcyanine7共役【PC7]; CD15 / LEXフルオレセインイソチオシアネート[FITC共役とAx647共役EGFリガンド。 注：LEX + EGFR +細胞およびEGFR +細胞は、成体SVZに豊富ではないが、それぞれ≈600〜1500細胞/マウス9。我々は十分な材料を持っている2〜3匹のマウスからのSVZ細胞をプールすることをお勧めします。細胞選別期間が3時間を超えないように、同じ日に12以上のマウスでは動作しません。同じ日にあまりにも多くのマウスでの作業は増加した細胞ソーティング期間はおそらく増加した細胞死および/または細胞分化の結果につながることを覚えておいてください。 マウスあたり（または最適な染色のために2〜3匹のマウスのグループの200μl中）をPBS 0.15％BSAを含む100μlのFACS染色を実行します。 対照チューブを準備します。メーカーによると、単一色の対照チューブを準備するために、補償ビーズを使用9; sのプロトコル。細胞の割合（1マウスで十分ですから抽出した細胞の10分の1）を選択し、1ネガティブコントロールチューブ（マークされていない細胞）および3蛍光マイナス1（FMO）対照チューブを準備するために4チューブにそれを分けます。チューブあたりPBS 0.15％BSAを200μlの細胞を再懸濁します。 ヒント：LEX-FITC FMOの制御のために、CD24-PC7（1時50分）とAx647共役EGFリガンド（1：200）で細胞を標識します。 CD24-PC7 FMO制御のため、CD15 / LEX-FITC（1時50分）と細胞とAx647共役EGFリガンドラベル（1：200）とAx647共役EGFリガンドFMO制御のために、CD15 / LeX-で細胞を標識FITC（1：50）およびCD24-PC7（1：50）。 細胞選別のために使用されるチューブのために、PBS中に示された希釈率で0.15％BSAを以下の抗体を使用する：CD24-PC7（1時50分）、CD15 / LEX-FITC（1：50）とAx647共役EGFリガンド（1： 200）。 暗闇の中で4℃で20分間インキュベートします。 10分間200×gで1mlのPBS 0.15％BSAおよび遠心分離機で洗います。 200で細胞を再懸濁81;脳あたりPBS 0.15％のBSAのリットル。氷上で細胞選別管を維持し、細胞選別にすぐに進みます。 LEX-FITC抗体株式としてFUCCI -緑色蛍光（ 図3A、B）と同じ発光波長を細胞選別前に分離カラムを使用して、個別のLEX陽性とLEX陰性画分をFUCCI -グリーンマウスを使用している場合。 まず、PBS 0.15％BSAを含む100μlの暗所で4℃で15分間、マウス抗ヒトLEX抗体（1：50）で細胞を標識します。 その後、暗所で4℃で15分間、抗マウスIgMマイクロビーズ（1:10）で細胞を標識、10分間200×gで1mlのPBS 0.15％BSAおよび遠心分離で細胞を洗浄します。 10分間200×gで1mlのPBS 0.15％BSAおよび遠心分離で細胞を洗浄します。 500μlのPBS 0.15％BSA中で細胞を再懸濁し、 図3のCに図式として磁場中で分離カラムを通して細胞を注ぐ。1mlのPBS 0.15％Bでカラムを洗浄SA LEX陰性画分を得ました。 LEX陽性画分を得るために、磁場からの分離カラムを除去し、2 mlのPBS 0.15％BSAで細胞を溶出します。 4.2に示すように、CD24-PC7とAx647共役EGFリガンド染色に進みます。 5.セルソーティング注：細胞を、86ミクロンnoozleで40 psiで、FACSソーターで選別しました。 520 / 35nmの（FITC）、575 / 26nm（PE）、670 / 20nmの（Ax647）及び740LP（PC7）：蛍光は、以下のフィルターセットを使用して収集しました。報酬は重複がFUCCI – 赤色蛍光およびPC7色素の発光スペクトルとの間で見られるような偽陽性シグナルを防ぐために必要です。 細胞選別の直前に、死細胞からのライブ区別する生体色素を追加します。私たちは、2 / mlの最終濃度でHOを（材料の表を参照）を使用しました。 FACS選別機を通して陰性対照チューブ（マークされていない細胞）を実行し、目を選択eは、細胞側方散乱（SSC）および前方散乱（FSC）のパラメータ（ 図1A）を使用 。 注：死細胞のみHO陰性画分（ 図1A '）をゲーティングすることによって除外し、次いで二重パルス幅陰性画分（ 図1（a）選択して除外された'を'）。 （オフスケールすなわち陰性集団が高すぎるおよび/ ​​または陽性細胞）必要に応じて電圧ステップ4.2で作成し、単一のカラーコントロールを実行し、光電子増倍管を調整する（PMT）。ソフトウェアの補正ウィンドウで色補正を行います。 ファイル名を指定して実行FMOは、ステップ4.2（LEX-FITC FMO制御、CD24-PC7 FMO制御とAx647共役EGFリガンドFMO制御）で準備を制御するとソートゲート（ 図1）を描きます。 1.5ミリリットルのマイクロチューブ中の培養培地100μlに直接細胞をソートします。 顕微鏡用の細胞の6準備たてソート細胞をプレート1の密度でS – 3×10 3細胞/ウェルのポリ-D-リジンを培地300μlの96ウェルμ-プレートをコーティングしました。 細胞接着を可能にするために、少なくとも1時間、ビデオ顕微鏡検査の前に、37℃で培養プレートをインキュベートし、5％CO 2。 7.顕微鏡のセットアップと画像収集 CO 2雰囲気の5％の下で37℃で反転サーモスタット室に取り付けられた共焦点レーザー走査顕微鏡システム上：プランアポVC 20倍DIC目標（0.75 NA）を使用してライブイメージングを実行します。 あらかじめ温めて、平衡化温度調節チャンバー内に96ウェルμ-プレートを置き、サーモスタットカバーで蓋を交換してください。 NIS-要素ソフトウェアを開き、メニューバーのをクリックタイムラプスのオプション（長さ、ステージ位置、共焦点のzセクション、…）、「取得/取得コントロールを選択し、「取得/取得は/ NDの取得を制御します」 / Tiのパッド221;メニューバーの各蛍光のためのPMTレベルを選択することが目標と「取得/取得コントロール/ A1plus設定」を選択します。データファイルを保存するフォルダを選択します。 ND取得ウィンドウを使用して、各中心部だけでなく、ステージ位置を設定し、7×7mm²のに大きな画像のオプションを選択します。これは、各ウェルの中央付近でモザイク画像を作成します。 5％に大きなモザイク画像のオーバラップを設定します。 24時間ごとに20分写真を撮ります。チタンパッド]ウィンドウで：プランアポVC 20倍DIC目標（0.75 NA）を選択します。 A1plus設定ウィンドウでは、1.26ミクロン/ピクセルの解像度で512×512ピクセル・フォーマットで高速レゾナントスキャナを使用して画像を取得します。セル形状を可視化するために明視野を使用してください。 FUCCIレッドマウスの場合には、561 nmの赤色蛍光を励起し、50分の595 nmのフィルターを用いて収集します。 FUCCIグリーンマウスの場合には、488 nmの緑色の蛍光を励起し、40分の530 nmのフィルターを用いて収集します。最適なPMを決定しますTレベル、波長ごとにオフセットレーザパワー。 注：私たちは、ソフトウェアがそれぞれ取得する前に、各ステージ位置でオートフォーカスを可能にするために明視野チャンネルに対してオートフォーカス機能を使用することをお勧めします。ヒント：プランアポVC 20倍DIC目標（NA：0.75）は油を必要とせずに、その優れた解像度のために使用されました。他の目的は、所望の光学解像度に応じて使用することができます。 取得を開始するためにND取得ウィンドウの[今すぐ実行]ボタンを選択します。 ヒント：正常に動作してのすべてそれを確認するために、1ループのためのコンピュータワークに従ってください。 8.画像処理と解析個々の細胞を追跡することによって、NISの要素のソフトウェアに直接データを分析します。ヒント：、時間を稼ぐ、NISの要素ソフトウェアを使用して、.AVI形式でそれぞれの位置を保存し、ImageJので映画を分析します。 ImageJソフトウェアでは、少なくとも2分割（ すなわち、一つのセルにを受ける個々の細胞を追跡します4セルコロニー）。セルの周りの小さな領域をトリミングし、「画像/複製」を選択します。 モンタージュを作るために、メニューバーの[イメージ/スタック/メイクモンタージュ」を選択します。 、フレームが含まれるように画像のサイズを指定し、最適な解決のための.tifファイルとしてモンタージュを保存します。 最初のSG 2 / M期の長さ（ 図2C、D）を計算するには、（G 1）単一赤色蛍光セルを選択し、tは（赤蛍光がオフ一度S期が開始されます）= 0と設定してください。セルは、SG 2 / M長さを推定するために分割するまでのフレーム数をカウントします。 注：算出された時間は、各フレーム間の時間間隔に依存します。 次のG1期（ 図2C、D）を計算するには、単に分割されたセルを追跡し続けます。分割されたセルは、G1期に入ると、CDT1赤の蛍光タンパク質の蓄積が存在することになります。赤蛍光がAGAをオフにするまでのフレーム数を計算します各セルのインチヒント：G 1の開始時に赤色蛍光が弱い可能性がありますので、セルは近似値を回避するために分割したフレームに、G 1期の開始を選択します。