מיון תא של תאי גזע ועצביים ממבוגרי עכבר Subventricular האזור וחי-הדמיה של Dynamics תא המחזור שלהם
Summary
We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.
Abstract
תאי גזע עצביים (NSCs) באזור subventricular של החדרים לרוחב (SVZ) לקיים neurogenesis חוש הריח לאורך כל חיים במוח של היונקים. הם ברציפות לייצר תאי מעבר הגברה (TACs) וneuroblasts שלהתמיין נוירונים ברגע שהם לשלב נורות חוש הריח. תא הניאון מתעורר מיון פעיל טכניקות (FACS) אפשרו את הבידוד של NSCs כמו גם צאצאיהם והחלו לשפוך אור על רשתות רגולציה גן בנישות עצביות מבוגרות. אנו מדווחים כאן טכניקת מיון תא שמאפשרת לעקוב ולהבחין דינמיקת מחזור התא של אוכלוסיות תאים הנ"ל מSVZ המבוגר עם לקס / EGFR / הכתמה משולשת CD24. לאחר מכן תאים מבודדים הם מצופים כמו תאים חסיד לחקור בפרטי התקדמות מחזור התא שלהם על ידי מיקרוסקופ וידאו הזמן לשגות. לשם כך, אנו משתמשים בעכברים מהונדסים מחוון סלולארי מחזור הקרינה Ubiquitination (FUCCI) שבו תאים אדומים-ניאון דוריןG G שלב 1 בשל כתב אדום-Cdt1 ספציפי G 1. שיטה זו חשפה לאחרונה כי NSCs מתרבים בהדרגה להאריך שלב G 1 במהלך הזדקנות, שהוביל לירידת ערך neurogenesis. שיטה זו היא בקלות transposable למערכות אחרות ויכולה להיות עניין רב ללימוד דינמיקת מחזור התא של תאי מוח בהקשר של פתולוגיות מוח.
Introduction
תאי גזע עצביים רגיעה (NSCs) הם המקור לneurogenesis מבוגרת 1 ויכולים להמיר שגשוגם "מופעל" צורה המבטאת את EGFR (aNSCs) 2. לאחר הפעלה, הם להצמיח תאי מעבר הגברה (TACs) 3 ולאחר מכן neuroblasts שנודדים לנורות חוש הריח (OB) דרך צינור של האסטרוציטים ולבסוף להתמיין נוירונים 4,5. NSCs וצאצאיהם מאורגנים ב" נישות "מיוחדות ארכיטקטורות לאורך החדרים לרוחב, לסבך את מספר עצום של גורמי שליטה התפשטותם 6. הבידוד והטיהור של תאים עצביים SVZ יש צורך להאיר את הרגולציה המולקולרית המורכבת של ההפצה שלהם, אבל נשאר אתגר במשך זמן רב בשל חוסר סמנים ספציפיים וטכניקות מותאמות.
גישות חדשות באמצעות cytometry זרימה שניתנו אפשריות הבידוד של NSCs וtheiצאצאי r מהמבוגרים SVZ 2,7-11. באמצעות סמן תאי גזע 12 LEX יחד עם CD24 neuroblast סמן 13 וEGF הקרינה לתייג EGFR בתאים מתרבים 2, לאחרונה פיתחו אסטרטגית FACS מאפשרת הטיהור של חמש מהאוכלוסיות העצביות SVZ העיקריות: שקטה והופעלה NSCs, TACs, neuroblasts לא בוגר כמו גם הנודד 9. כאן אנו מתארים בפרטי תא זה מיון טכניקה ואיך לקס / EGFR / הכתמה משולשת CD24 אפשרה בפעם הראשונה את הבידוד של שני NSCs שקט והופעל.
למרות neurogenesis נמשכת בבגרות, הייצור של תאי עצב חדשים הוא ירד באופן דרסטי במוח המזדקן 14. רוב המחקרים מסכימים על ירידה הדרגתית במספר מתרבים תאים בSGZ וSVZ 15-20. ההשלכות הן לא תמימות כמו הירידה הקשורות לגיל בהנוירוגנזה בSVZ מעוררת הפחתה של nנוירונים ewborn בנורות חוש הריח של המוח בגיל, סופו של דבר מוביל לירידת ערך באפליה חוש הריח בעכברים בגיל 18. הבהרת קינטיקה מחזור התא של אבות עצביים היא צעד מפתח להבנת מנגנוני ההתפתחות של neurogenesis למבוגרים במהלך הזדקנות. מחקרים שנעשו לאחרונה חקרו את מחזור התא והתקדמות שושלת של תאי גזע עצביים מבוגרים במבחנה 21 וin vivo 22 אבל אף אחד מהם ניצל טכניקות תא מיון ובדיקות מחזור תא ניאון מקודדים גנטיים כדי להמחיש את שלבי מחזור התא של תאים מבודדים ברמת תא בודד.
כאן אנו מתארים פרוטוקול שמנצל את העכברים מהונדסים FUCCI שבו תאים הם פלורסנט במהלך מחזור התא שלהם, המאפשר ההבחנה בין G 1 וSG 2 / M שלבים 23. פרוטוקול זה מראה כיצד בידוד פוטנציאלי של NSCs וצאצאיהם ממבוגרי FUCCI מילCE בשילוב עם מיקרוסקופ וידאו הזמן לשגות מאפשר המחקר של דינמיקת מחזור התא ברמת תא בודד.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקת מיון התא המתוארת במסמך זה מאפשרת אפליה בין NSCs אמין השקטים, NSCs מופעל ומחקרי הצאצאים מאפשרים של הנכסים שלהם ואת הדינמיקה במוח הבוגר 9. בשילוב עם טכנולוגית FUCCI המאפשר ההדמיה של התקדמות מחזור התא בתאים חיים 23, שפתחנו טכניקה מהירה ויעילה למעקב G 1 וSG 2 / M השלבים של מחזור התא ממבוגרים צעירים ותאי מוח עכבר גילאים.
טכניקת תא מיון שימוש בפרוטוקול זה הייתה שילוב תוקף הראשון של סמנים המאפשרים טיהור של חמש האוכלוסיות עצביות העיקריות מSVZ 9. זה היה גם הטכניקה הראשונה תוקף מאפשרת את ההבחנה של NSCs שקט והופעל. ראוי לציין כי טכניקה זו אינה דורשת שימוש בעכברים מהונדסים כשלעצמה, אשר הוא הכרחי כאשר מותאם לדגמי עכבר מהונדסים suפרק כFUCCI. מאז, קודגה et al. 10 השתמשו שילוב תיוג משולש GFAP-GFP / CD133 / EGFR להבחין NSCs שקט מעמיתו הופעל אבל זה לא יכול להיות מותאם לטכנולוגית FUCCI כפי שהוא דורש שימוש בעכברים מהונדסים GFAP-GFP. מישיגן et al. 11 פיתחו / EGFR / אסטרטגית Glast CD24 משולשת תיוג שמחולקת תוצאות משותפות עם הטכניקה המשמשת במחקר זה 9. ואכן, מתאם גבוה בין לקס וסמני Glast NSCs כבר נצפה באל Daynac et. ללמוד 9. עם זאת, נוגדני Glast משמשים במישיגן et al. הטכניקה הוא מצמידים את Phycoerythrin ולכן לא יכולים להיות מותאמים לשימוש בעכברים FUCCI-אדומים.
יש כמה נקודות טכניות חשובות שדורשות תשומת לב לפני מיון תאי SVZ. ראשית, צעד הניתוק הוא מאוד חשוב כמו רקמת המוח יש ניתק לתוך תאים בודדים תוך שמירה על המבנה בטגריטי של החלבונים המשמשים לאסטרטגית תיוג נוגדן. 0.05% טריפסין-EDTA הוכח כיעיל מאוד בdissociating רקמת SVZ 27 אבל אנטיגן לקס נמצא רגיש מאוד שכן כמעט כל immunofluorescence LEX-FITC היה אבוד (מידע לא מוצג). לפיכך, פפאין שימש כזה היה יותר יעיל ופחות הרסני מאשר פרוטאזות אחרת ברקמת המוח. יתר על כן, לא לקס ולא EGFR ולא CD24 הושפע טיפול פפאין. יש לציין כי תיוג הנוגדן שונו אם טיפול פפאין עלה 15 דקות. השגנו תוצאות אופטימליות עם טיפול פפאין 10 דקות הקשורים ניתוק מכאני (פיפטה למעלה ולמטה 20 פעמים).
ציפוי פולי-D-ליזין מאפשר תרבות של תאים חסיד והיווצרות המושבות לאחר מספר ימים בתרבות. עכשיו זה מקובל כי במבחני חוץ גופית מגיע עם המגבלות שלהם 28,29. אנו ממליצים קביעת מחזור התא הראשון רק להתאים עוברים החלוקה לפחות אחד לאחר להישאר קרוב ככל האפשר לin vivo פנוטיפ התא.
ראוי לציין להזכיר כי חלבוני Geminin (הקרינה ירוקה) וCdt1 (הקרינה אדומה) המשמשים לעיצוב מערכת FUCCI 23 הוצגו בעבר לבוא לידי ביטוי בשפע על ידי אבות עצביים במהלך הנוירוגנזה מוקדמת בעכברים 30 וברקמות מוח בוגר 9,25 . למרות מבנה mKO2-hCdt1 (30/120) היה בעיקר בשימוש במחקר הנוכחי לעקוב שלב G1 עם הקרינה אדומה, השימוש בשני המבנים [mKO2-hCdt1 (30/120) וMAG-hGem (1/110) ] יכול להיות שחזה כדי לאפשר ההדמיה של השלבים העיקריים של מחזור התא (1 G וSG 2 / M), כמו גם את המעבר / S G 1 23. החסרון העיקרי של ההדמיה כפול הצבע הוא הסטים תואמים המוגבלים של הקרינה שעדיין יכול לשמש לתיוג התא. פתרון אחד הוא להשתמש separatiעל עמודים. לדוגמא, יש לנו בהצלחה מדולדלת חלק CD24 חיובי מהתאים באמצעות עמודות הפרדה לפני תא מיון ולחיות הדמיה כפי שנהגנו נוגדן CD24-PE שחלק את אותו אורך גל הפליטה מקרינת FUCCI-האדומה 25.
מחקרים מעטים בחנו את אורך מחזור התא של אוכלוסיות SVZ העכבר מבוגרות. אורך מחזור התא הכולל שהושג עם הטכניקה שלנו הוא קרוב לאחד מוערך במבחנה על ידי קוסטה et al. 21, אבל הצלחנו בפעם הראשונה להבחין שלבי מחזור התא השונים. במחקר in vivo, פונטי et al. 22 השתמש בשילוב של תחליפי תימידין כדי לקבוע את דינמיקת ההתפשטות של אוכלוסיות תאי SVZ השונות. עם זאת, הם יכולים גם לבצע ניטור רציף של מחזור התא ולא לעקוב אחר התאים ברמת התא הבודד. זה יכול להיות נושא כפי שהראה כי ההטרוגניות חזקה קיימת שנינותהין אוכלוסיית תאי SVZ נתון 22,25. אנו מתארים כאן חלופיים בטכניקת מבחנה, קל להתקנה, המאפשר ההדמיה החיה של שלבי מחזור התא של אוכלוסיות עצביות מבוגרות שונה ברמת תא בודד.
הבנת הרגולציה של מחזור התא של תאי גזע עצביים ואת אבות עדיין מהווה אתגר לפיתוח גישות טיפוליות חדשות בהקשר של פתולוגיות הזדקנות או מוח. כך הפרוטוקול שלנו יכול להיות מגוון רחב של יישומים. בהקשר של הזדקנות, טכניקה זו יכולה להיות יעילה גם כדי להבין את ההשפעות של הזדקנות על בידול NSCs. ואכן, ניתן לזהות תאי גזע / עצביים נכנסו בידול כעוצמת הניאון האדום שלהם היא במובהק גבוהה יותר 26. לבסוף, זה יכול להיות גם עניין לנצל את ההדמיה לחיות רציפה ברמת תא בודד ללמוד תהליכים פנימיים וחיצוניים התא אחראים לפרו השושלתgression של NSCs המבוגר.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו אסירי תודה ל- C ז'ובר, V נוויל, V Barroca, J טיליאט וכל צוות של מתקני בעלי חיים; לJ Baijer וN Dechamps למיון תא; O. אטיין לקבלת סיוע טכני, וא Gouret לסיועה המנהלי. Cytometry זרימה ומיון תא בוצעה בiRCM cytometry הזרימה המשותפת למשאב, שהוקמה על ידי מענקי ציוד מDIM-גזע-קוטב, INSERM, Fondation ARC, וCEA. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של חברת חשמל הצרפתי (EDF). יש MD מלגה מLa הליגה העל Contre le הסרטן וLM מאזור איל-דה-פראנס (DIM Biothérapies). מארק-אנדרה Mouthon ופרנסואה ד Boussin מחבר מניות שותף בכיר.
Materials
| 96-well uncoated glass bottom culture plates | MatTek Corp. | P96G-1.5-5-F | |
| µ-Plates 96-well | Ibidi | 89626 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A003E | |
| NeuroCult NSC Basal Medium | STEMCELL Technologies | 5700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplement | STEMCELL Technologies | 5701 | |
| Heparin | STEMCELL Technologies | 7980 | |
| EGF | Millipore | GF144 | |
| FGF-2 | Millipore | GF003 | |
| Papain | Worthington | LS003119 | |
| EBSS | Invitrogen | 24010-043 | |
| L-cysteine | Sigma | C-7352 | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Promega | V4231 | |
| DNase I | Sigma | D5025-15KU | |
| Trypsin inhibitor type II | Sigma | T9128 | Ovomucoid |
| DMEM:F12 medium | Life Technologies | 31330-038 | |
| 20 µm filter | BD Medimachine Filcon | 340622 | |
| Eppendorf microtubes 3810X | Sigma | Z606340-1000EA | |
| BSA | Sigma | A1595 | Bovine serum albumin solution |
| CD24 phycoerythrin-cyanine7 conjugate [PC7] | Life Technologies | A14776 | Mouse IgM; clone MMA. 1:50 |
| CD15/LeX fluorescein isothiocyanate [FITC] – conjugated | BD Biosciences | 332778 | Rat IgG2b; clone M1/69. 1:50 |
| Mouse anti-human LeX antibody | BD Pharmingen | 559045 | Mouse IgM; clone MAM. 1:50 |
| Alexa647 – conjugated EGF ligand | Life Technologies | E35351 | 1:200; Ax647-conjugated EGF ligand in the text |
| CompBeads | BD Biosciences | 644204 | |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | separation columns (in the manuscript) |
| Anti-mouse IgM microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-301 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 861405 | HO (in the manuscript) |
| INFLUX cell sorter | BD Biosciences | FACS sorter (in the text) | |
| Nikon A1R confocal laser scanning microscope system attached to an inverted ECLIPSE Ti | Nikon Corp. | confocal laser scanning microscope (in the manuscript) | |
| NIS-Elements AR.4.13.01 64-bit software | Nikon Corp. | NIS-Elements software (in the manuscript) | |
| Plan Apo VC 20x DIC objective (NA: 0.75) | Nikon Corp. | ||
| ECLIPSE Ti thermostated chamber | Nikon Corp. | thermostated chamber (in the manuscript) | |
| ImageJ | RBS | ||
| FlowJo | Tree Star, Ashland, OR | ||
| FUCCI mice | RIKEN BioResource Center, JAPAN | Sakaue-Sawano et al. 2008 |
References
- Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 6387-6392 (2009).
- Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 97, 703-716 (1999).
- Kriegstein, A., Alvarez Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Lois, C., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. Chain migration of neuronal precursors. Science. 271, 978-981 (1996).
- Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez Buylla, A. Adult neural stem cells bridge their niche. Cell stem cell. 10, 698-708 (2012).
- Rietze, R. L., et al. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412, 736-739 (2001).
- Fischer, J., et al. Prospective isolation of adult neural stem cells from the mouse subependymal zone. Nat Protoc. 6, 1981-1989 (2011).
- Daynac, M., et al. Quiescent neural stem cells exit dormancy upon alteration of GABAAR signaling following radiation damage. Stem Cell Res. 11, 516-528 (2013).
- Codega, P., et al. Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche. Neuron. 82, 545-559 (2014).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
- Capela, A., Temple, S. LeX ssea 1 is expressed by adult mouse CNS stem cells identifying them as nonependymal. Neuron. 35, 865-875 (2002).
- Calaora, V., Chazal, G., Nielsen, P. J., Rougon, G., Moreau, H. mCD24 expression in the developing mouse brain and in zones of secondary neurogenesis in the adult. Neuroscience. 73, 581-594 (1996).
- Pineda, J. R., et al. Vascular derived TGF-beta increases in the stem cell niche and perturbs neurogenesis during aging and following irradiation in the adult mouse brain. EMBO Mol Med. 5, 548-562 (2013).
- Lugert, S., et al. Quiescent and active hippocampal neural stem cells with distinct morphologies respond selectively to physiological and pathological stimuli and aging. Cell stem cell. 6, 445-456 (2010).
- Blackmore, D. G., Golmohammadi, M. G., Large, B., Waters, M. J., Rietze, R. L. Exercise increases neural stem cell number in a growth hormone dependent manner augmenting the regenerative response in aged mice. Stem cells. 27, 2044-2052 (2009).
- Bouab, M., Paliouras, G. N., Aumont, A., Forest Berard, K., Fernandes, K. J. Aging of the subventricular zone neural stem cell niche evidence for quiescence associated changes between early and mid adulthood. Neuroscience. 173, 135-149 (2011).
- Enwere, E., et al. Aging results in reduced epidermal growth factor receptor signaling diminished olfactory neurogenesis and deficits in fine olfactory discrimination. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 8354-8365 (2004).
- Maslov, A. Y., Barone, T. A., Plunkett, R. J., Pruitt, S. C. Neural stem cell detection characterization and age related changes in the subventricular zone of mice. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1726-1733 (2004).
- Tropepe, V., Craig, C. G., Morshead, C. M., van der Kooy, D. Transforming growth factor alpha null and senescent mice show decreased neural progenitor cell proliferation in the forebrain subependyma. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 7850-7859 (1997).
- Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138, 1057-1068 (2011).
- Ponti, G., et al. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1045-1054 (2013).
- Sakaue Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).
- Daynac, M., et al. TGFbeta lengthens the G1 phase of stem cells in aged mouse brain. Stem cells. 32, 3257-3265 (2014).
- Roccio, M., et al. Predicting stem cell fate changes by differential cell cycle progression patterns. Development. 140, 459-470 (2013).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse two cultures isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. Journal of visualized experiments JoVE. , e51225 (2014).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres re evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Pastrana, E., Silva Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open a critical review of sphere formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
- Spella, M., et al. Licensing regulators Geminin and Cdt1 identify progenitor cells of the mouse CNS in a specific phase of the cell cycle. Neuroscience. 147, 373-387 (2007).
