Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen
Summary
The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.
Abstract
Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.
Introduction
Die wichtigste physiologische Rolle von Skelettmuskel Mitochondrien ist es, ATP aus oxidative Phosphorylierung 1 zu produzieren. Wichtig ist, zu spielen Skelettmuskel Mitochondrien eine besondere Rolle bei der körperlichen Leistungsfähigkeit 2, Alterung 3, degenerative Erkrankung 4 und Diabetes Typ II 5. Als einer alternden Gesellschaft und Typ-II-Diabetes als die 7. führende Todesursache in den Vereinigten Staaten 6, der Bedarf an Methoden, die die Funktion der Mitochondrien zu beurteilen hat sich immer häufiger in der biomedizinischen Forschung 7,8. Insbesondere ist die Messung des Sauerstoffverbrauchs hat außergewöhnliche Nützlichkeit bei der Beurteilung der Mitochondrienfunktion, da sie das koordinierte Zusammenwirken zwischen mitochondrialen und nuklearen Genome stellt den funktionalen Komponenten der oxidativen Phosphorylierung 9 auszudrücken.
Mehrere Technologien existieren, ermöglichen die Messung des Sauerstoffverbrauchs in intakten Zellen und zu isolieren,d Mitochondrien 7-10. Darüber hinaus haben Tests für mehrere Zelltypen und Geweben entwickelt worden und in einer Vielzahl von Arten, die für die Messung der mitochondrialen Atmungswege und Steuer 9,11,12 ermöglichen. Allerdings gibt es derzeit eine Lücke in der Literatur in Bezug auf die Zusammenstellung aller dieser Tests unter Verwendung von isolierten Mitochondrien aus Maus Skelettmuskel für die Verwendung in auf Mikrotiterplatte Sauerstoffverbrauch Technologien. Wichtig ist, dass Verwendung auf Mikrotiterplatte respirometrischen Assays unter mitochondrialen Biologen wächst und ermöglicht hohe Durchsatzmessungen mit minimalen Mengen an isolierten Mitochondrien 9. Daher ist eine Sammlung von auf Mikrotiterplatte respirometrischen Tests wurden entwickelt, die die Ermittlung, wo Anomalien und / oder Anpassungen können in der Elektronentransportkette (ETC) auftreten werden, zu ermöglichen. Darüber hinaus wurden zwei weitere auf Mikrotiterplatte respirometrischen Assays entwickelt, die die Analyse der Koordinierung betwee aktivierenn der Tricarbonsäure (TCA) Zyklus und der ETC und zwischen ß-Oxidation und der ETC. Wichtig ist, dass die vorgestellten Methoden liefern eine klare und präzise Art und Weise, um mechanistische Veränderungen im mitochondrialen Funktion in einem häufig verwendeten Tiermodell zu messen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die in diesem Artikel vorgestellten Methoden bieten Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Durchführung von einer Sammlung von auf Mikrotiterplatte respirometrischen Tests unter Verwendung von Mitochondrien aus 75 isoliert – 100 mg Maus-Skelettmuskel. Diese Tests können mit hoher Präzision durchgeführt werden, wie durch die enge Standardabweichung zwischen den drei Vertiefungen belegt. Wichtig ist, dass diese respirometrischen Assays erlauben die Ermittlung von wo Anomalien und / oder Anpassungen können in der ETC, TCA-Zyklus, β-Oxidationswegs, Substrat-Transporter etc. auftreten werden, in einem häufig verwendeten Tiermodell.
Es ist wichtig, den Grund für die Verwendung verschiedener Brennstoffe und Inhibitoren in diesem Protokoll verwendet markieren. Pyruvat / Malat und Glutamat / Malat respirometrischen Assays erlauben die Beurteilung komplexer I vermittelte Atmung, sowie die Beurteilung der jeweiligen Transporter, und im Fall von Glutamat, Desaminase 15. Alternativ kann die Kombination vonSuccinat / Rotenon ermöglicht die Beurteilung der mitochondrialen Atmungsfluss durch Complex II des ETC seit Rotenon hemmt Komplex I und Succinat bietet Elektronen-Komplex II über die Reduktion von Flavinadenindinucleotid (FADH 2) 15. Diese Untersuchungen liefern substratspezifischen Information, die Kopplungseffizienz und maximale Atmung. Der Elektronenstrom Assay ist, daß die Kombination von Substraten und Inhibitoren ermöglicht die Bewertung von Mehrfachkomplexen in mitochondrialen Atmungsfluss 9 einzigartig. Das Ausgangssubstrat Mischung von Pyruvat / Malat + FCCP erlaubt die Auswertung von maximal Atmung durch Komplex I angesteuert, während die Injektion von Rotenon gefolgt von Succinat ermöglicht die Beurteilung maximale Atmung durch Complex II angetrieben. Die Injektion von Antimycin A, ein Inhibitor der Komplex III, gefolgt von der Injektion von Ascorbat / TMPD ermöglichen die für die Auswertung der Atmung durch Komplex IV da die Ascorbate angetrieben / TMPD istElektronendonor zu Cytochrom C / Complex IV. Während keine Informationen über die Kopplungseffizienz erreicht wird, ist das Verfahren ideal für sehr kleine Probengrößen, die das Ausführen mehrerer Substrate unabhängig auszuschließen. Schließlich ermöglicht die Analyse der Koordinierung zwischen β-Oxidation und die ETC da die aus der Oxidation von Palmitinsäure (β-Oxidation) hergestellt Reduktionsäquivalent der Einsatz von Palmitoylcarnitin / Malat Einspeisung ins ETC durch das Elektronenübertragungs Flavoprotein 15. Es sei darauf hingewiesen, daß die Kupplung und die Elektronen fließen Assays können auch in Tandem aufgrund einiger Eingriff (medikamentöse Behandlung, genetische Manipulation) verwendet werden, um Veränderungen in der mitochondrialen Funktion identifiziert werden.
Die hohe Präzision für diese Assays erreicht ist vor allem eine gute Durchmischung der Mitochondrien, sei es vor der Proteinbestimmung, bzw. mit den Substratlösungen ist. In diese Richtung einmal den Mitochondrien in das Substrat solutio resuspendendns, ist es wichtig, diese Lösung gut vor dem Laden der Zellkultur-Platte, wie in Schritt 2.2 mit einem verbreiterten Öffnung Pipettenspitze beschrieben mischen. Die Nichtbeachtung der Mitochondrien gründlich mischen wird, um große Variation innerhalb des Assays führen. Zusätzlich mit einer schmalen Öffnung Pipettenspitze wird Scherkräfte zu erzeugen, während das Mischen der Mitochondrien und erhöht das Potential, um die Membranen der Mitochondrien und die Freisetzung von Cytochrom C. Die Einhaltung der Schritt (2.7) ist ebenfalls ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll zu beschädigen. Bei Nichtbeachtung der geladenen Zellkulturplatte lang / schnell genug drehen wird in unvollständiger Einhaltung der Mitochondrien zum Brunnen führen, so führen erhöhte Variabilität zwischen den Bohrlöchern und Messungen.
Die beschriebenen Protokoll wurde optimiert, um die folgenden: Laden eine optimale Menge an mitochondrialer Protein pro Loch, mit den richtigen Konzentrationen / Herstellungsverfahren, um Lager und Substratlösungen zu machen, die Änderung der Testlauf, um mitochondriale Zustand pla sicherzustellen,teaus und geeignete Durchmischung der mitochondrialen Lager und mitochondriale / Substratmischungen. Vor diesen Optimierungsbemühungen stießen die Autoren Fallstricke in der Testlauf. Im Folgenden beschreibt Methoden zur Problembehandlung / Änderungen, die hilfreich bei der Optimierung dieses Protokoll gab. In Bezug auf die optimale Beladung wird geladen zu wenig Mitochondrien nicht eine robuste Reaktion hervorzurufen, während das Laden zu viel Mitochondrien wird die Sauerstoff innerhalb der Mikrokammer erschöpfen und führen zu ungenauen Messungen. Rogers et al 9 enthält Beispiele für die Bestimmung der optimalen Beladungsmengen der Mitochondrien pro Vertiefung auf Mikrotiterplatte respirometrischen Assays. Häufiger zu viel Mitochondrien pro über 100-200 pmol / min / Loch und Zustand 3 Raten> 1500 pmol / min / Vertiefung geladen sowie durch staatliche belegt 2 Raten. Wenn über Laden auftritt, ein Experiment mit verschiedenen Konzentrationen von mitochondriales Protein (beispielsweise zwischen 1 -. 10 ug) zu OCR innerhalb des dynamischen r hervorrufenange des Sauerstoffverbrauchs-Messmaschine. Herstellung und Verwendung der richtigen Konzentrationen von Substraten und Aktien ist von größter Bedeutung. Verwenden Sie immer die Säureform von Substraten / Injektionen und der pH-Wert mit Kaliumhydroxid oder HCl; Natrium-Puffer / Lösungen sind nicht zu empfehlen. Darüber hinaus Resuspendieren Substrate / Aktien in DMSO oder 100% Ethanol wird in der Messfehler oder Fehler. Achten Sie darauf, 95% Ethanol zu verwenden, wo gemerkt. Es ist üblich, Palmitoylcarnitin, um aus dem 95% Ethanol nach dem Auftauen des gefrorenen stock auszufällen, wodurch große Variabilität. Seien Sie sicher zum Aufwärmen der Palmitoylcarnitin Lager und Wirbel vor Gebrauch gut. Darüber hinaus kann ein sehr variables Pyruvat / Malat-Assay-Ergebnis durch die Pyruvat stock Befinden> 2 Wochen alt sein. Achten Sie darauf, gefrorenen Aliquots von Pyruvat alle 2 Wochen erneuern. Der Testlauf wurde auf 2-min-Messungen modifiziert, um mitochondriale Staatsebenen zu gewährleisten. Wenn Beobachtung der Erschöpfung der ADP gewünscht wird, kann der Forschererstrecken sich die Messzeit auf der Registerkarte "Protokoll" unter dem "Test Wizard" Forum. Schließlich tritt große Variabilität bei der mitochondrialen Lager und Mitochondrien sowie Substratlösungen sind nicht vollständig vor dem Verladen homogenisiert. Wenn Variabilität zwischen Brunnen hoch ist nach dem Testlauf, müssen Sie vollständig vor dem nächsten Versuch mischen die Substratlösung. Nie vortexen die Mitochondrien / Substratlösungen, sondern rühren, Maische, und sanft verreiben mit einem verbreiterten Öffnung Pipettenspitze.
Es gibt einige Einschränkungen dieser Technik, die erwähnenswert sind. Erstens ist die Anzahl der Vertiefungen auf der Zellkulturplatte für diese Assays verwendeten relativ niedrig ist (dh., Mit 24 Vertiefungen und die Blindvertiefungen bezeichnet mindestens 2). Wenn es gewünscht ist, alle 5 dieser Assays auf einer Platte durchzuführen, ist der Forscher nur in der Lage, die Reaktionen aus einer Maus zu einem Zeitpunkt zu untersuchen. Es sollte jedoch darauf hingewiesen, dass 96 auch Instrumente zur Verfügung steht higher Durchsatz. Zweitens gibt es inhärente Stärken und Schwächen bei der Beurteilung mitochondriale Dysfunktion in isolierten Mitochondrien im Vergleich zu intakten Zellen 1. Einige Schwachstellen sind mit weniger physiologische Relevanz im Vergleich zu intakten Zellen und induzieren Artefakte aus dem Isolationsprozess. Schließlich ist der Erfolg dieser Methode abhängig von der Qualität der mitochondrialen Isolationsprozesses.
Obwohl einige dieser Assays wurden entweder in verschiedenen Systemen entwickelt haben oder in anderen Tiermodellen validiert, die hier vorgestellten Verfahren sind die ersten, alle zuvor erwähnten Tests für die optimale Verwendung in einer Multi-Well-Sauerstoffverbrauchs-Messmaschine mit Maus synthetisieren Skelettmuskulatur. Wichtiger ist, daß alle 5 dieser Assays mit der Menge an Mitochondrien aus ~ 75 getrennt durchgeführt werden, – 100 mg Maus Skelettmuskel, wodurch hohen Durchsatz bei geringen Material. Von großer Bedeutung ist die Fähigkeit der MultiwellSauerstoffverbrauch Technologien auf Assays mit minimalen Mengen von Mitochondrien, in Kombination mit einer optimierten Isolierungsverfahren durchzuführen, ermöglicht es dem Forscher, eine Vielzahl weiterer Experimente mit dem Rest des Skelettmuskelgewebe (z. B. Western-Blots durchzuführen, RT-PCR, enzymatische Assays, etc.), die oft ein Kampf mit diesem Tiermodell.
Abschließend können die hier vorgestellten Methoden bieten Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Durchführung von einer Sammlung von auf Mikrotiterplatte respirometrischen Tests unter Verwendung von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel. Wichtig ist, dass die vorgestellten Methoden benötigen nur minimale Mengen von Gewebe und Mitochondrien. Einmal gemeistert werden die hierin beschriebenen Techniken können die Forscher einen potentiellen Mechanismus, einer Verbindung oder eines Genprodukts mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs in einem üblicherweise verwendeten Tiermodell zu bestimmen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.
Materials
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | Store at room temperature |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | Store at room temperature |
| Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0% | Sigma Aldrich | P5379 | Store at room temperature |
| Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0% | Sigma Aldrich | M9272 | Store at room temperature |
| HEPES minimum 99.5% titration | Sigma Aldrich | H3375 | Store at room temperature |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | Store at room temperature |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | Store at 4°C |
| Acid Free- BSA | |||
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4°C |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | Store at room temperature |
| 99%, powder [TMPD] | |||
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20°C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20°C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8°C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20°C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20°C |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
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