Uso de mitocondrias aisladas a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para alta microplacas rendimiento Mediciones respiratorias
Summary
The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.
Abstract
Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.
Introduction
La principal función fisiológica de las mitocondrias del músculo esquelético es producir ATP a partir de la fosforilación oxidativa 1. Es importante destacar que las mitocondrias del músculo esquelético juegan un papel específico en la capacidad de ejercicio 2, diabetes 5 3, 4 y enfermedad degenerativa de tipo II de envejecimiento. Como una sociedad que envejece, y la diabetes tipo II es la 7ª causa de muerte en los Estados Unidos 6, la necesidad de métodos que evalúan la función mitocondrial se ha convertido cada vez más frecuente en la investigación biomédica 7,8. Específicamente, la medición del consumo de oxígeno tiene utilidad excepcional en la evaluación de la función mitocondrial, ya que representa la función coordinada entre los genomas mitocondriales y nucleares para expresar los componentes funcionales de la fosforilación oxidativa 9.
Varias tecnologías existen que permiten la medición del consumo de oxígeno en las células intactas y aísland mitocondrias 7-10. Además, los ensayos han sido desarrollados para múltiples tipos de células y tejidos, y en una variedad de especies que permiten la medición de las vías respiratorias mitocondriales y de control 9,11,12. Sin embargo, en la actualidad existe un vacío en la literatura en cuanto a la recopilación de todos estos ensayos usando mitocondrias aisladas de músculo esquelético de ratón para el uso de las tecnologías de consumo de oxígeno basado en una microplaca. Es importante destacar que el uso de ensayos respirométricos microplacas basado está creciendo entre los biólogos mitocondriales y permite mediciones de alto rendimiento utilizando cantidades mínimas de mitocondrias aisladas 9. Por lo tanto, una colección de ensayos respirométricos microplacas basado fueron desarrolladas que permiten la localización de dónde anomalías y / o adaptaciones pueden estar ocurriendo en la cadena de transporte de electrones (ETC). Además, dos ensayos respirométricos basados microplaca adicionales fueron desarrolladas que permiten la evaluación de la coordinación between el ácido (TCA) ciclo tricarboxílico y el ETC, y entre ß-oxidación y la ETC. Es importante destacar que los métodos presentados proporcionan una manera clara y concisa para medir los cambios mecánicos en la función mitocondrial en un modelo animal de uso común.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos presentados en este artículo ofrecen paso a paso las instrucciones para la realización de una colección de microplacas basado en ensayos respirométricos utilizando mitocondrias aisladas 75-100 mg de músculo esquelético del ratón. Estos ensayos pueden realizarse con alta precisión como se evidencia por la desviación estándar hermético entre pocillos por triplicado. Es importante destacar que estos ensayos respirométricos permiten la localización de dónde anomalías y / o adaptaciones pueden estar ocurriendo en el ETC, ciclo de Krebs, vía β-oxidación, transportadores de sustratos, etc., en un modelo animal de uso común.
Es importante destacar la justificación del uso de diversos combustibles y los inhibidores utilizados en este protocolo. El piruvato / malato y ensayos respirométricos malato de glutamato / permiten la evaluación del complejo I mediada por la respiración, así como la evaluación de sus respectivos transportadores, y en el caso de glutamato, la desaminasa 15. Alternativamente, la combinación desuccinato / rotenona permite la evaluación de flujo respiratoria mitocondrial a través de Complejo II de la ETC desde rotenona inhibe el complejo I y succinato proporciona electrones al complejo II a través de la reducción de dinucleótido de flavina adenina (FADH 2) 15. Estos ensayos proporcionan información específica sustrato como a la eficiencia de acoplamiento y la respiración máxima. El ensayo de flujo de electrones es único en que la combinación de sustratos e inhibidores permite la evaluación de múltiples complejos durante el flujo respiratoria mitocondrial 9. La mezcla de sustrato inicial de piruvato / malato + FCCP permite la evaluación de la respiración máxima impulsada por el Complejo I, mientras que la inyección de la rotenona seguido de succinato permite la respiración máxima evaluación impulsado por Complejo II. La inyección de antimicina A, un inhibidor del complejo III, seguido por la inyección de ascorbato / TMPD permite la para la evaluación de la respiración impulsado por Complejo IV ya que el ascorbato / TMPD es unadonador de electrones al citocromo C / Complejo IV. Si bien no se obtiene información sobre la eficiencia de acoplamiento, el método es ideal para muy pequeños tamaños de muestra que impiden la ejecución de múltiples sustratos de forma independiente. Finalmente, el uso de carnitina palmitoil / malato permite la evaluación de la coordinación entre la β-oxidación y el ETC desde el equivalente reducir producido a partir de la oxidación del ácido palmítico (β-oxidación) se introduce en la ETC a través de la electrónica de la transferencia de flavoproteína 15. Cabe señalar que los ensayos de flujo de acoplamiento y el electrón también se podrían usar en tándem para identificar los cambios en la función mitocondrial debido a algún tipo de intervención (tratamiento de drogas, la manipulación genética).
La alta precisión alcanzadas para estos ensayos se debe principalmente a una mezcla completa de las mitocondrias, ya sea antes de la determinación de proteínas, o con las soluciones de sustrato. En este sentido, una vez que las mitocondrias se resuspendend en el solutio sustratons, es fundamental para mezclar esta solución a fondo antes de cargar la placa de cultivo celular como se describe en el paso 2.2 con una punta de pipeta de orificio ensanchado. El no mezclar las mitocondrias bien dará lugar a una gran variación dentro del ensayo. Además, el uso de una punta de pipeta orificio estrecho creará fuerzas de cizallamiento mientras se mezcla la mitocondria y aumenta el potencial de dañar las membranas mitocondriales y la liberación de citocromo C. El paso de la adhesión (2.7) es también un paso crítico en este protocolo. El fracaso para hacer girar la placa cargada de cultivo celular a largo / suficientemente rápido dará lugar a la adhesión incompleta de la mitocondria al pozo, lo que conduce la mayor variabilidad entre los pozos y mediciones.
El protocolo descrito ha sido optimizado para incluir: cargar una cantidad óptima de proteína mitocondrial por pozo, utilizando las concentraciones / métodos de preparación adecuados para hacer soluciones madre y del sustrato, alterando el proceso de la prueba para asegurar pla estado mitocondrialteaus, y la mezcla adecuada de las acciones y mitocondrial / sustrato mezclas mitocondriales. Antes de estos esfuerzos de optimización, los autores encontraron con dificultades en el proceso de la prueba. A continuación se analizan los métodos de solución de problemas / modificaciones que fueron útiles en la optimización de este protocolo. Con respecto a la carga óptima, carga demasiado pequeñas mitocondrias no obtener una respuesta robusta, al cargar demasiado las mitocondrias, se agotará la de oxígeno dentro de la microcámara y dar lugar a mediciones inexactas. Rogers et al 9 proporciona ejemplos de la determinación de las cantidades de carga óptimos de mitocondrias por pocillo para ensayos respirométricos basado en una microplaca. Más a menudo, demasiado mitocondrias se carga por pozo como lo demuestra el estado 2 tasas de más de 100 a 200 pmol / min / pocillo y el estado 3 tarifas> 1500 pmol / min / pocillo. Si se produce más de carga, lleve a cabo un experimento con diferentes concentración de proteína mitocondrial (por ejemplo, entre 1 -. 10 g) para obtener OCRs dentro del r dinámicaange de la máquina de medición del consumo de oxígeno. Preparación y las concentraciones correctas de sustratos y acciones es de suma importancia. Utilice siempre una forma ácida de sustratos / inyecciones y ajustar el pH con hidróxido de potasio o HCl; / No se recomiendan los buffers de sodio soluciones. Además, los sustratos resuspender / existencias en DMSO o etanol al 100% resultará en el fracaso de medición o error. Asegúrese de utilizar etanol al 95% cuando se indique. Es común que la carnitina palmitoil para precipitar fuera del etanol al 95% después de descongelar la madre congelado, causando así una gran variabilidad. Asegúrese de calentar el stock de carnitina palmitoil y agitar bien antes de usar. Además, un resultado del ensayo altamente variable piruvato / malato puede ser debido a la piruvato Stock ser> 2 semanas de edad. Asegúrese de rehacer alícuotas congeladas de piruvato cada 2 semanas. El proceso de la prueba fue modificado para mediciones de 2 min para asegurar mesetas estatales mitocondriales. Si se desea la observación del agotamiento de ADP, el investigador puedeextender el tiempo de medición en la pestaña "Protocolo" en el marco del foro "Asistente de ensayo". Por último, una gran variabilidad se produce cuando las soluciones de la Bolsa y las mitocondrias mitocondrial además de sustrato no se homogeneizan completamente antes de la carga. Si la variabilidad entre los pozos es alta después de que el proceso de la prueba, asegúrese de mezclar completamente la solución de sustrato antes de la siguiente experimento. Nunca vórtice las soluciones mitocondrias / sustrato, y no agitar, puré, y se tritura suavemente con una punta de pipeta de orificio ensanchado.
Hay algunas limitaciones de esta técnica que vale la pena destacar. En primer lugar, el número de pocillos en la placa de cultivo celular utilizado para estos ensayos es relativamente bajo (es decir., 24 pozos y al menos 2 designado para pozos en blanco). Si se desea llevar a cabo todos los 5 de estos ensayos en un plato, el investigador sólo es capaz de examinar las respuestas de un ratón a la vez. Sin embargo, cabe señalar que el 96 instrumentos así están disponibles para higher rendimiento. En segundo lugar, hay fortalezas y debilidades inherentes en la evaluación de la disfunción mitocondrial en las mitocondrias aisladas en comparación con 1 en células intactas. Algunas debilidades incluyen tener relevancia fisiológica menos en comparación con las células intactas y que inducen artefactos del proceso de aislamiento. Por último, el éxito de este método depende de la calidad del proceso de aislamiento mitocondrial.
Aunque algunos de estos ensayos se han desarrollado ya sea en diferentes sistemas o han sido validados en otros modelos animales, los métodos presentados en este documento son la primera para sintetizar todos los ensayos mencionados anteriormente para el uso óptimo en una de múltiples pocillos máquina de medición del consumo de oxígeno a través del ratón músculo esquelético. Es importante destacar que todos los 5 de estos ensayos se pueden realizar con la cantidad de mitocondrias aisladas de ~ 75 – 100 mg de músculo esquelético de ratón, proporcionando así un alto rendimiento con un material mínimo. De gran importancia, la capacidad de los múltiples pocillostecnologías de consumo de oxígeno para llevar a cabo ensayos con cantidades mínimas de las mitocondrias, en combinación con un método de aislamiento optimizado, permite al investigador para llevar a cabo una multitud de otros experimentos con el resto del tejido de músculo esquelético (por ejemplo., transferencias de Western, RT-PCR, ensayos enzimáticos, etc.), que es a menudo una lucha con este modelo animal.
En conclusión, los métodos presentados en este documento proporcionan paso a paso las instrucciones para la realización de una colección de microplacas basado en ensayos respirométricos utilizando cantidades mínimas de músculo esquelético del ratón. Es importante destacar que los métodos presentados requieren cantidades mínimas de tejido y las mitocondrias. Una vez dominado, las técnicas descritas en este documento permitirá a los investigadores determinar un mecanismo potencial de un producto compuesto o de genes en el consumo de oxígeno mitocondrial en un modelo animal de uso común.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.
Materials
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | Store at room temperature |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | Store at room temperature |
| Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0% | Sigma Aldrich | P5379 | Store at room temperature |
| Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0% | Sigma Aldrich | M9272 | Store at room temperature |
| HEPES minimum 99.5% titration | Sigma Aldrich | H3375 | Store at room temperature |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | Store at room temperature |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | Store at 4°C |
| Acid Free- BSA | |||
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4°C |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | Store at room temperature |
| 99%, powder [TMPD] | |||
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20°C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20°C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8°C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20°C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20°C |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
References
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