באמצעות מבודד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות נשימה microplate תפוקה הגבוה
Summary
The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.
Abstract
Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.
Introduction
התפקיד הפיזיולוגי העיקרי של המיטוכונדריה שרירי שלד הוא לייצר ATP מזרחון חמצוני 1. חשוב לציין, מיטוכונדריה שריר השלד לשחק תפקיד ספציפי בתרגיל קיבולת 2, 3 הזדקנות, מחלה ניוונית 4 וסוכרת סוג II 5. כחברה מזדקנת, ולהיות הגורם המוביל -7 של מוות בארצות הברית 6 סוכרת סוג II, את הצורך בשיטות שלהעריך את התפקוד המיטוכונדריה הפך יותר ויותר נפוץ יותר במחקר ביו 7,8. באופן ספציפי, המדידה של צריכת חמצן יש שירות יוצא דופן בהערכה של תפקוד המיטוכונדריה שכן הוא מייצג את הפונקציה מתואמת בין הגנום המיטוכונדריאלי והגרעיני להביע רכיבים פונקציונליים של חמצוני זירחון 9.
מספר טכנולוגיות הקיימות לאפשר המדידה של צריכת חמצן בתאים שלמים ולבודדמיטוכונדריה ד 7-10. בנוסף, מבחני פותחו עבור סוגי תאים רבים ורקמות, ובמגוון רחב של מינים המאפשרים המדידה של מסלולי המיטוכונדריה ושליטה בדרכי הנשימה 9,11,12. עם זאת, אין כיום חלל בספרות בנוגע לאוסף של כל מבחני אלה באמצעות המיטוכונדריה מבודדת משרירי שלד עכבר לשימוש בטכנולוגיות צריכת חמצן microplate מבוססים. חשוב לציין, שימוש במבחני respirometric microplate מבוסס גדל בקרב הביולוגים המיטוכונדריה ומאפשר למדידות תפוקה גבוהות באמצעות כמויות מזעריות של מיטוכונדריה המבודדת 9. לכן, אוסף של מבחני respirometric microplate מבוסס פותחו המאפשר איתור של חריגות שבו ו / או התאמות עשויות להיות מתרחשות בשרשרת הובלת אלקטרונים (וכו '). בנוסף, שני מבחני respirometric מבוססים microplate נוסף פותחו המאפשרות ההערכה של התיאום between חומצת מחזור tricarboxylic (TCA) והכד ', ובין SS-חמצון ווכו' חשוב לציין, השיטות שהוצגו מספקות דרך ברורה ותמציתית כדי למדוד שינויי מכניסטית במיטוכונדריה במודל חיה נפוץ.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטות שהוצגו במאמר זה מספקות הוראות צעד-אחר-צעד לביצוע אוסף של מבחני respirometric microplate מבוסס באמצעות המיטוכונדריה מבודדת 75-100 מ"ג של שרירי שלד עכבר. ניתן לבצע מבחני אלה עם דיוק גבוה כפי שמעידים סטיית התקן ההדוקה בין בארות בשלושה עותקים. חשוב לציין, מבחני respirometric אלה מאפשרים איתור של חריגות שבו ו / או התאמות עשויות להיות מתרחשות בETC, מחזור TCA, מסלול β-חמצון, מובילי מצע, וכו 'במודל חיה נפוץ.
חשוב להדגיש את הרציונל לשימוש בדלקים שונים ומעכבי שימוש בפרוטוקול זה. פירובט / Malate ומבחני respirometric Malate גלוטמט / נאפשר להערכת נשימה אני קומפלקס תיווך, כמו גם ההערכה של המובילים שלהם, ובמקרה של גלוטמט, deaminase 15. לחלופין, השילוב שלsuccinate / rotenone מאפשר ההערכה של שטף נשימה במיטוכונדריה באמצעות הקומפלקס השני של ETC מאז rotenone מעכב אני מורכב וsuccinate מספק אלקטרונים לקומפלקס השני באמצעות ההפחתה של פלבין dinucleotide אדנין (FADH 2) 15. מבחני אלה מספקים מידע ספציפי מצע כליעילות צימוד ונשימה מקסימלי. זרימת האלקטרונים assay הוא ייחודי בכך שהשילוב של מצעים ומעכבים מאפשר ההערכה של מתחמים מרובים במהלך שטף נשימה במיטוכונדריה 9. תערובת המצע הראשונית של פירובט / Malate + FCCP מאפשרת ההערכה של נשימה מקסימלי מונעת על ידי מורכב, תוך ההזרקה של rotenone אחרי succinate מאפשרת לנשימה המקסימלי הערכה מונעת על ידי הקומפלקס השני. ההזרקה של Antimycin, מעכב של קומפלקס III, ואחרי ההזרקה של ascorbate / TMPD לאפשר להערכת הנשימה מונעת על ידי IV מורכב מאז Ascorbate / TMPD הואתורם אלקטרונים לציטוכרום C / IV מורכב. אמנם אין מידע על יעילות צימוד מתקבל, השיטה אידיאלית לגודל מדגם קטן מאוד שמונעים הפעלת מצעים מרובים באופן עצמאי. לבסוף, השימוש בקרניטין / Malate palmitoyl מאפשר ההערכה של התיאום בין β-חמצון וETC מאז שווה ערך הפחתה מופק מהחמצון של חומצה פלמיטית (β-חמצון) מוזן לתוך ETC דרך אלקטרון העברת flavoprotein 15. יש לציין כי מבחני זרימת הצימוד ואלקטרונים יכולים לשמש גם במקביל לזיהוי שינויים בתפקוד המיטוכונדריה בשל כמה התערבות (טיפול תרופתי, מניפולציה גנטית).
הדיוק הגבוה שהושג עבור מבחני אלה הוא בעיקר בשל ערבוב יסודי של המיטוכונדריה, אם זה לפני קביעת חלבון, או עם פתרונות המצע. לאורך שורות אלה, ברגע שהמיטוכונדריה הוא resuspendend בsolutio המצעNS, זה קריטי כדי לערבב את הפתרון הזה ביסודיות לפני טעינת צלחת תרבית התאים כפי שמתואר בשלב 2.2 עם קצה פיפטה פתח מורחב. כישלון לערבב מיטוכונדריה יסודיות יוביל לשינוי גדול בתוך assay. בנוסף, באמצעות קצה פיפטה פתח צר ייצור כוחות הגז תוך ערבוב מיטוכונדריה ומגדיל את הפוטנציאל לניזק לקרומי המיטוכונדריה ושחרורו של ציטוכרום C. צעד הדבקות (2.7) הוא גם שלב קריטי בפרוטוקול זה. אי לסובב את צלחת תרבית תאים הטעונה ארוכים / מספיק מהר יגרמו דבקות שלמה של המיטוכונדריה לטובה, ובכך מוביל השתנות מוגברת בין בארות ומדידות.
הפרוטוקול המתואר כבר מותאם לכולל: טעינת כמות אופטימלית של חלבון המיטוכונדריה בכל טוב, באמצעות ריכוזים / שיטות הכנה הנכונות כדי להפוך פתרונות מניות ומצע, לשנות את טווח assay כדי להבטיח PLA המדינה המיטוכונדריהteaus, וערבוב מתאים של תערובות המניות והמיטוכונדריה / מצע של המיטוכונדריה. לפני מאמצי ייעול אלה, המחברים נתקלו מלכודות בטווח assay. הבא דן שיטות לפתרון בעיות / שינויים שהיו מסייע באופטימיזציה של פרוטוקול זה. עם כל כבוד לטעינה אופטימלית, מיטוכונדריה מעט מדי טעינה לא לעורר תגובה חזקה, בעת הטעינה מדי מיטוכונדריה יהיה למצות את החמצן בתוך microchamber ולהוביל למדידה לא מדויקת. רוג'רס ואח '9 מספק דוגמאות לקביעת סכומי טעינה אופטימליות של מיטוכונדריה לכל גם למבחני respirometric microplate מבוססים. לעתים קרובות יותר, יותר מדי מיטוכונדריה נטענת בכל טוב כפי שמעידה מדינה 2 שיעורים על 100-200 pmol / דקות / גם ושיעורים 3> 1500 pmol / דקות / גם מדינה. אם על טעינה מתרחשת, לבצע ניסוי עם משתנה ריכוז של חלבון המיטוכונדריה (למשל, בין 1 -. 10 מיקרוגרם) כדי לעורר OCRs בתוך r הדינמיAnge של המכונה מדידת צריכת חמצן. הכנה ושימוש בריכוזים הנכונים של מצעים ומניות היא בעל חשיבות עליונה. תמיד השתמש בטופס החומצה של מצעים / זריקות ולהתאים את ה- pH עם אשלגן הידרוקסיד או HCl; מאגרי נתרן / פתרונות אינם מומלצים. בנוסף, מצעי resuspending / המניות בDMSO או אתנול 100% יגרמו לכישלון מדידה או שגיאה. הקפד להשתמש אתנול 95% שבו ציין. זה נפוץ קרניטין palmitoyl כדי לזרז מתוך אתנול 95% לאחר הפשרת המניות הקפואות, ובכך גורם שונות גדולות. הקפד לחמם את מניית קרניטין palmitoyl ומערבולת היטב לפני השימוש. בנוסף, פירובט / תוצאת assay Malate משתנה מאוד יכולה להיות בגלל יצור מניית פירובט> 2 שבועות. הקפד מחדש aliquots הקפוא של פירובט כל 2 שבועות. ריצת assay שונה כדי מדידות 2-דקות כדי להבטיח מישורי המדינה המיטוכונדריה. אם תצפית של תשישות של ADP היא רצויה, רשאי החוקרלהאריך את זמן המדידה תחת לשונית "פרוטוקול" תחת הפורום "Assay האשף". לבסוף, השתנות גדולה מתרחשת כאשר פתרונות מניית המיטוכונדריה ומיטוכונדריה בתוספת המצע אינם הומוגני לפני מלא לטעינה. אם שונות בין הבארות היא גבוהות אחרי ריצת assay, הקפד לערבב באופן מלא את פתרון המצע לפני הניסוי הבא. לא מערבולת פתרונות מיטוכונדריה / מצע, ולא לעורר, מחית, ובעדינות triturate עם פיפטה קצה פתח מורחב.
ישנן מספר מגבלות של טכניקה זו, כי הם ראויים לציון. ראשית, מספר הבארות בצלחת תרבית תאים המשמשת למבחנים אלה הוא נמוך יחסית (כלומר., 24 בארות ולפחות 2 מיועדים לבארות ריקות). אם זה רצוי לבצע את כל 5 של מבחני אלה על צלחת אחת, החוקר הוא רק מסוגל לבחון את התגובות מעכבר אחד בכל פעם. עם זאת, יש לציין כי 96 מכשירים וזמינים לhigheתפוקת r. שנית, יש את נקודות החוזק וחולשות הגלומות בהערכת תפקוד המיטוכונדריה במיטוכונדריה מבודדת בהשוואה בתאים שלמים 1. חולשות מסוימות כוללות שיש רלוונטי פחות פיסיולוגי לעומת תאים שלמים וחפצי התרמה מתהליך הבידוד. לבסוף, ההצלחה של שיטה זו היא תלויה באיכות של תהליך בידוד המיטוכונדריה.
למרות שחלק ממבחנים אלה פותחו גם במערכות שונות או אומתו במודלים של בעלי חיים אחרים, השיטות שהוצגו במסמך זה הן ראשון לסנתז את כל מבחני האמורים לשימוש האופטימלי בעכבר באמצעות מכונה מדידת צריכת חמצן רב גם שרירי שלד. חשוב לציין, כל 5 של מבחני אלה יכולים להתבצע עם כמות המיטוכונדריה מבודדת מ~ 75-100 מ"ג של שרירי שלד עכבר, ובכך לספק תפוקה גבוהה עם חומר מינימאלי. משמעות רבה, היכולת של רב גםטכנולוגיות צריכת חמצן כדי לבצע מבחני עם כמויות מינימליות של מיטוכונדריה, בשילוב עם שיטת בידוד מותאמת, מאפשר לחוקר לבצע מספר רב של ניסויים אחרים עם שארית רקמת שריר שלד (למשל., כתמים מערביים, RT-PCR, מבחני האנזימטית, וכו '), אשר לעתים קרובות מאבק עם מודל חיה זו.
לסיכום, השיטות שהוצגו במסמך זה מספקות הוראות צעד-אחר-צעד לביצוע אוסף של מבחני respirometric microplate מבוסס באמצעות כמויות מינימליות של שריר שלד עכבר. חשוב לציין, השיטות שהוצגו דורשות כמויות מינימליות של רקמות ומיטוכונדריה. ברגע שמשתלט עליו, הטכניקות המתוארות במסמך זה תאפשר לחוקרים לקבוע מנגנון פוטנציאלי של מוצר או מתחם גן על צריכת חמצן במיטוכונדריה במודל חיה נפוץ.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.
Materials
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | Store at room temperature |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | Store at room temperature |
| Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0% | Sigma Aldrich | P5379 | Store at room temperature |
| Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0% | Sigma Aldrich | M9272 | Store at room temperature |
| HEPES minimum 99.5% titration | Sigma Aldrich | H3375 | Store at room temperature |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | Store at room temperature |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | Store at 4°C |
| Acid Free- BSA | |||
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4°C |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | Store at room temperature |
| 99%, powder [TMPD] | |||
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20°C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20°C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8°C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20°C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20°C |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
References
- Brand, M., Nicholls, D. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
- Wang, H., Hiatt, W. R., Barstow, T. J., Brass, E. P. Relationships between muscle mitochondrial DNA content, mitochondrial enzyme activity and oxidative capacity in man: alterations with disease. European Journal of Applied Physiology and Occupational Physiology. 80, 22-27 (1999).
- Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. The mitochondrial genome in aging and senescence. Ageing Research Reviews. 18C, 1-15 (2014).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, 1145-1159 (2012).
- Dube, J. J., et al. Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance. Endocrinology and Metabolism. 307, E1117-E1124 (2014).
- Disease Control and Prevention Services. National diabetes statistics report: estimates of diabetes and its burden in the United States. , (2014).
- Guarino, R. D., et al. Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration. Biotechnology and Bioengineering. 86, 775-787 (2004).
- Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nature Protocols. 1, 2563-2572 (2007).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6, e21746 (2011).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, C125-C136 (2007).
- Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods (San Diego, Calif.). 26, 292-297 (2002).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Frisard, M. I., et al. Low levels of lipopolysaccharide modulate mitochondrial oxygen consumption in skeletal muscle. Metabolism. 64, 416-427 (2015).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Advances in Enzymology and Related Subjects of Biochemistry. 17, 65-134 (1956).
- Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and respiratory control. , (2007).
