عن طريق عزل الميتوكوندريا من كميات الحد الأدنى من الفأر العضلات الهيكلية لارتفاع صفيحة ميكروسكوبية الإنتاجية قياسات الجهاز التنفسي
Summary
The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.
Abstract
Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.
Introduction
دور الفسيولوجية الرئيسي الميتوكوندريا العضلات والهيكل العظمي هو إنتاج ATP من الفسفرة التأكسدية 1. الأهم من ذلك، الميتوكوندريا العضلات والهيكل العظمي دورا محددا في القدرة على ممارسة الرياضة 2، والشيخوخة 3، الأمراض التنكسية (4) والنوع الثاني من مرض السكري 5. كما مجتمع الشيخوخة، والسكري من النوع الثاني يكون السبب الرئيسي ال 7 للوفاة في الولايات المتحدة 6، أصبحت الحاجة إلى أساليب التي تقيم وظيفة الميتوكوندريا على نحو متزايد أكثر انتشارا في البحوث الطبية الحيوية 7،8. على وجه التحديد، وقياس استهلاك الأوكسجين له فائدة استثنائية في تقييم وظيفة الميتوكوندريا لأنها تمثل وظيفة منسقة بين جينوم الميتوكوندريا والنووية للتعبير عن المكونات الوظيفية لالفسفرة التأكسدية 9.
العديد من التقنيات موجودة والتي تمكن من قياس استهلاك الأوكسجين في خلايا سليمة وعزلد الميتوكوندريا 7-10. وبالإضافة إلى ذلك، تم تطوير فحوصات لأنواع خلايا متعددة والأنسجة، ومجموعة متنوعة من الأنواع التي تسمح لقياس مسارات الميتوكوندريا والتحكم في الجهاز التنفسي 9،11،12. ومع ذلك، لا يوجد حاليا فراغا في الأدب في ما يخص تجميع كل هذه المقايسات باستخدام الميتوكوندريا المعزولة من الماوس العضلات والهيكل العظمي لاستخدامها في تقنيات استهلاك الأوكسجين صفيحة ميكروسكوبية القائمة. الأهم من ذلك، استخدام صفيحة ميكروسكوبية مقرها المقايسات respirometric ينمو بين علماء الأحياء الميتوكوندريا ويسمح لقياس إنتاجية عالية باستخدام كميات ضئيلة من الميتوكوندريا معزولة 9. لذلك، وضعت مجموعة من صفيحة ميكروسكوبية مقرها المقايسات respirometric التي تسمح التحديد الدقيق من حيث تشوهات و / أو التعديلات قد تحدث في سلسلة نقل الإلكترون (ETC). وبالإضافة إلى ذلك، تم تطوير تحليلين respirometric صفيحة ميكروسكوبية إضافية على أساس أن تمكين تقييم التنسيق بين هذا وذاكن الثلاثي الكربوكسيل حمض (TCA) دورة وETC، وبين ß للأكسدة والخ. الأهم من ذلك أن الأساليب المقدمة توفر وسيلة واضحة وموجزة لقياس التغيرات الميكانيكية في وظيفة الميتوكوندريا في نموذج حيواني تستخدم عادة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطرق الواردة في هذه المادة توفر خطوة بخطوة تعليمات لأداء مجموعة من صفيحة ميكروسكوبية مقرها المقايسات respirometric باستخدام الميتوكوندريا المعزولة 75-100 ملغ من الماوس العضلات والهيكل العظمي. ويمكن تنفيذ هذه المقايسات مع دقة عالية كما يتضح من الانحراف المعياري ضيق بين الآبار ثلاث نسخ. الأهم من ذلك، هذه المقايسات respirometric تسمح التحديد الدقيق من حيث تشوهات و / أو التعديلات قد تحدث في ETC، دورة TCA، مسار β للأكسدة، النقل الركيزة، وما إلى ذلك في نموذج حيواني تستخدم عادة.
من المهم تسليط الضوء على الأساس المنطقي لاستخدام مختلف أنواع الوقود ومثبطات المستخدمة في هذا البروتوكول. البيروفات / مالات والغلوتامات / المقايسات respirometric مالات يسمح لتقييم مجمع I التنفس بوساطة، فضلا عن تقييم شركات النقل الخاصة بها، وذلك في حالة من الغلوتامات، ونازعة أمين 15. بدلا من ذلك، فإن الجمع بينسوسينات / روتينون يسمح تقييم تدفق الجهاز التنفسي الميتوكوندريا من خلال مجمع الثاني من ETC منذ روتينون يمنع مجمع الأول ويتيح سوسينات الإلكترونات إلى مجمع II عن طريق الحد من فلافين الأدينين ثنائي النوكليوتيد (القوات المسلحة الهايتية 2) 15. توفر هذه المقايسات معلومات محددة الركيزة لكفاءة اقتران والتنفس القصوى. فحص تدفق الإلكترونات هي فريدة من نوعها في أن الجمع بين ركائز ومثبطات يسمح لتقييم المجمعات متعددة خلال تدفق الجهاز التنفسي الميتوكوندريا 9. مزيج الركيزة الأولي من البيروفات / مالات + FCCP يسمح لتقييم التنفس القصوى يقودها مجمع I، في حين أن حقن روتينون تليها سوسينات يسمح للتنفس القصوى تقييم يقودها مجمع II. حقن Antimycin A، مثبط لمجمع III، تليها حقن أسكوربات / TMPD السماح لللتقييم التنفس يقودها مجمع IV منذ أسكوربات / TMPD هوالإلكترون المانحة لالسيتوكروم C / مجمع IV. في حين يتم الحصول على أي معلومات عن كفاءة اقتران، فإن هذه الطريقة مثالية لأحجام عينة صغيرة جدا التي تحول دون تشغيل ركائز متعددة بشكل مستقل. وأخيرا، واستخدام بالميتويل الكارنيتين / مالات يسمح لتقييم التنسيق بين β للأكسدة وETC منذ ما يعادل خفض إنتاجها من أكسدة الأحماض البالمتيك (β-الأكسدة) تغذي ETC من خلال الإلكترون نقل بروتين فلافيني 15. وتجدر الإشارة إلى أن فحوصات تدفق اقتران والكترون ويمكن أيضا أن تستخدم جنبا إلى جنب لتحديد التغيرات في وظيفة الميتوكوندريا بسبب بعض التدخل (العلاج من تعاطي المخدرات، والتلاعب الجيني).
ومن المقرر في المقام الأول إلى خلط دقيق من الميتوكوندريا عالية الدقة بلغ عن هذه المقايسات، سواء كان ذلك قبل تقرير البروتين، أو مع حلول الركيزة. على طول هذه الخطوط، وبمجرد أن الميتوكوندريا وresuspendend في solutio الركيزةنانوثانية، فمن الأهمية بمكان لخلط هذا الحل مسبق بدقة لتحميل لوحة زراعة الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.2 مع اتساع فتحة طرف ماصة. عدم خلط الميتوكوندريا بدقة سوف يؤدي إلى تفاوت كبير في الفحص. وبالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام فتحة ضيقة ماصة سيخلق قوى القص في حين خلط الميتوكوندريا ويزيد من القدرة على تلف الأغشية الميتوكوندريا والإفراج عن السيتوكروم C. الخطوة التزام (2.7) هي أيضا خطوة حاسمة في هذا البروتوكول. وعدم تدور تحميل لوحة الثقافة خلية طويلة / بسرعة كافية يؤدي إلى الالتزام غير الكامل للالميتوكوندريا إلى البئر، مما أدى إلى زيادة التباين بين الآبار والقياسات.
وقد تم تحسين بروتوكول صفها لتشمل: تحميل مبلغ الأمثل للبروتين الميتوكوندريا لكل بئر، وذلك باستخدام تركيزات / أساليب إعداد الصحيحة لجعل الأسهم والركيزة الحلول، وتغيير على المدى فحص للتأكد من جيش التحرير الشعبى الصينى دولة الميتوكوندرياteaus، وخلط المناسب للسهم والميتوكوندريا / الركيزة الميتوكوندريا يمزج. قبل هذه الجهود الأمثل، واجهت عثرات الكتاب في المدى الفحص. يناقش يلي طرق استكشاف الأخطاء وإصلاحها / التعديلات التي كانت مفيدة في تحسين هذا البروتوكول. وفيما يتعلق التحميل الأمثل، وتحميل الميتوكوندريا قليلة جدا لا تثير استجابة قوية، أثناء تحميل الميتوكوندريا الكثير من واستنفاد الأكسجين داخل microchamber وتؤدي إلى قياسات غير دقيقة. روجرز وآخرون 9 يقدم أمثلة من تحديد كميات التحميل الأمثل الميتوكوندريا لكل بئر للصفيحة ميكروسكوبية مقرها المقايسات respirometric. في كثير من الأحيان، يتم تحميل الميتوكوندريا الكثير لكل بئر كما يتضح من الدولة 2 معدلات أكثر من 100-200 بمول / دقيقة / جيد والدولة 3 معدلات> 1500 بمول / دقيقة / جيد. إذا حدث الحمولة الزائدة، إجراء تجربة مع اختلاف تركيز البروتين الميتوكوندريا (على سبيل المثال، بين 1 – 10 ميكروغرام) للحصول OCRs داخل ص الديناميكيانجى للآلة قياس استهلاك الأوكسجين. إعداد واستخدام تركيزات الصحيحة من ركائز والأسهم هي ذات أهمية قصوى. دائما استخدام الحمض من ركائز / الحقن وضبط درجة الحموضة مع هيدروكسيد البوتاسيوم أو حمض الهيدروكلوريك. مخازن الصوديوم / لا ينصح الحلول. بالإضافة إلى ذلك، ركائز إعادة التعليق / الأسهم في DMSO أو الإيثانول بنسبة 100٪ سوف يؤدي إلى فشل قياس أو خطأ. تأكد من استخدام الايثانول 95٪ حيث لوحظ. ومن الشائع لبالميتويل الكارنيتين ليعجل خروج من الايثانول 95٪ بعد ذوبان المجمدة الأسهم، مما تسبب تقلبات كبيرة. ومن المؤكد أن الاحماء الأسهم بالميتويل الكارنيتين ودوامة جيدا قبل الاستخدام. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون شديدة التباين البيروفات / مالات نتيجة الفحص نظرا لكائن الأسهم البيروفات> 2 أسابيع من العمر. مما لا شك فيه أن يعيد قسامات المجمدة البيروفات كل 2 أسابيع. تم تعديل المدى مقايسة لقياسات 2-دقيقة لضمان الهضاب الدولة الميتوكوندريا. إذا كان المطلوب مراقبة استنفاد ADP، يجوز للباحثتمديد وقت القياس تحت عنوان "البروتوكول" التبويب في إطار منتدى "معالج الفحص". أخيرا، يحدث تفاوت كبير عندما لا يتم المتجانس في الأوراق المالية والميتوكوندريا الميتوكوندريا بالإضافة إلى الركيزة حلول مسبق تماما التحميل. إذا التباين بين الآبار عالية بعد تشغيل الفحص، تأكد من مزيج تماما الحل الركيزة قبل التجربة المقبلة. أبدا دوامة الحلول الميتوكوندريا / الركيزة، وليس إثارة، والهريس، ويسحن بلطف مع اتساع فتحة طرف ماصة.
هناك بعض القيود المفروضة على هذه التقنية التي تستحق الملاحظة. أولا، عدد من الآبار على لوحة زراعة الخلايا المستخدمة لهذه المقايسات منخفض نسبيا (أي.، 24 بئرا و 2 على الأقل المعينة للآبار فارغة). إذا كان المطلوب من أداء كل 5 من هذه المقايسات على لوحة واحدة، الباحث هو فقط قادرة على فحص ردود من الماوس في وقت واحد. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن و96 أدوات جيدا المتاحة لhigheص الإنتاجية. ثانيا، هناك نقاط القوة ونقاط الضعف الكامنة في تقييم ضعف الميتوكوندريا في الميتوكوندريا المعزولة مقارنة في خلايا سليمة 1. وتشمل بعض نقاط الضعف التي لها علاقة أقل الفسيولوجية بالمقارنة مع خلايا سليمة وحمل التحف من عملية العزل. وأخيرا، فإن نجاح هذه الطريقة يتوقف على نوعية العملية العزلة الميتوكوندريا.
على الرغم من أن بعض هذه المقايسات تم وضعها إما في مختلف النظم أو تم التحقق من صحتها في النماذج الحيوانية الأخرى، الأساليب الواردة في هذه الوثيقة هي الأولى لتجميع كل من المقايسات المذكورة أعلاه للاستخدام الأمثل في الماوس متعددة أيضا آلة قياس استهلاك الأكسجين باستخدام العضلات والهيكل العظمي. الأهم من ذلك، كل 5 من هذه المقايسات لا يمكن أن يؤديها مع كمية من الميتوكوندريا المعزولة من ~ 75-100 ملغ من الماوس العضلات والهيكل العظمي، وبالتالي توفير إنتاجية عالية مع الحد الأدنى من المواد. ذات أهمية كبيرة، وقدرة متعددة جيداتقنيات استهلاك الأكسجين لأداء المقايسات مع كميات ضئيلة من الميتوكوندريا، جنبا إلى جنب مع أسلوب العزل الأمثل، بما يسمح للباحث لإجراء العديد من التجارب الأخرى مع ما تبقى من أنسجة العضلات والهيكل العظمي (على سبيل المثال، البقع الغربية، RT-PCR، المقايسات الأنزيمية، وما إلى ذلك)، والتي غالبا ما يكون الصراع مع هذا النموذج الحيواني.
في الختام، الأساليب المقدمة في هذه الوثيقة توفر خطوة بخطوة تعليمات لأداء مجموعة من صفيحة ميكروسكوبية مقرها المقايسات respirometric باستخدام كميات ضئيلة من الماوس العضلات والهيكل العظمي. الأهم من ذلك أن الأساليب المقدمة تتطلب كميات ضئيلة من الأنسجة والميتوكوندريا. مرة واحدة يتقن، فإن الأساليب المذكورة في هذه الوثيقة تسمح للباحثين لتحديد آلية ممكنة لمركب أو الجين المنتج على استهلاك الأوكسجين الميتوكوندريا في نموذج حيواني تستخدم عادة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.
Materials
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | Store at room temperature |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | Store at room temperature |
| Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0% | Sigma Aldrich | P5379 | Store at room temperature |
| Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0% | Sigma Aldrich | M9272 | Store at room temperature |
| HEPES minimum 99.5% titration | Sigma Aldrich | H3375 | Store at room temperature |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | Store at room temperature |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | Store at 4°C |
| Acid Free- BSA | |||
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4°C |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | Store at room temperature |
| 99%, powder [TMPD] | |||
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20°C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20°C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8°C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20°C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20°C |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
References
- Brand, M., Nicholls, D. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
- Wang, H., Hiatt, W. R., Barstow, T. J., Brass, E. P. Relationships between muscle mitochondrial DNA content, mitochondrial enzyme activity and oxidative capacity in man: alterations with disease. European Journal of Applied Physiology and Occupational Physiology. 80, 22-27 (1999).
- Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. The mitochondrial genome in aging and senescence. Ageing Research Reviews. 18C, 1-15 (2014).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, 1145-1159 (2012).
- Dube, J. J., et al. Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance. Endocrinology and Metabolism. 307, E1117-E1124 (2014).
- Disease Control and Prevention Services. National diabetes statistics report: estimates of diabetes and its burden in the United States. , (2014).
- Guarino, R. D., et al. Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration. Biotechnology and Bioengineering. 86, 775-787 (2004).
- Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nature Protocols. 1, 2563-2572 (2007).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6, e21746 (2011).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, C125-C136 (2007).
- Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods (San Diego, Calif.). 26, 292-297 (2002).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Frisard, M. I., et al. Low levels of lipopolysaccharide modulate mitochondrial oxygen consumption in skeletal muscle. Metabolism. 64, 416-427 (2015).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Advances in Enzymology and Related Subjects of Biochemistry. 17, 65-134 (1956).
- Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and respiratory control. , (2007).
