Met behulp Isolated Mitochondriën van geringe hoeveelheden van de muis skeletspieren voor High throughput Microplate Respiratory Metingen
Summary
The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.
Abstract
Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.
Introduction
De belangrijkste fysiologische rol van skeletspieren mitochondriën is om ATP te produceren tegen oxidatieve fosforylering 1. Belangrijker nog, skeletspieren mitochondriën een specifieke rol spelen in de inspanningscapaciteit 2, veroudering 3, degeneratieve ziekte 4 en type II diabetes 5. Als een vergrijzende samenleving, en type II diabetes zijn de 7e belangrijkste doodsoorzaak in de Verenigde Staten 6, is de behoefte aan methoden die de mitochondriale functie te evalueren steeds vaker in het biomedisch onderzoek 7,8 geworden. Met name de meting van het zuurstofverbruik heeft uitzonderlijk nut bij de beoordeling van de mitochondriale functie, omdat het vertegenwoordigt de gecoördineerde functie tussen mitochondriale en nucleaire genomen om functionele componenten van oxidatieve fosforylering 9 te drukken.
Verschillende technologieën bestaan die het mogelijk maken de meting van het zuurstofverbruik in intacte cellen en isolerend mitochondriën 7-10. Verder zijn assays ontwikkeld voor meerdere celtypes en weefsels, en in een aantal soorten die het mogelijk maken de meting van mitochondriale pathways en respiratoire control 9,11,12. Er is echter momenteel een leegte in de literatuur met betrekking tot de samenstelling van al deze assays gebruikt mitochondriën geïsoleerd uit muizen skeletspieren voor gebruik in microplaat zuurstofverbruik technologieën. Belangrijker nog, het gebruik van microplaat respirometrische assays groeit onder mitochondriale biologen en zorgt voor een high throughput metingen met behulp van minimale hoeveelheden van geïsoleerde mitochondria 9. Daarom is een verzameling microplaat respirometrische assays ontwikkeld waarmee aanwijzen waar afwijkingen en / of aanpassingen kunnen voorkomen in de elektronentransportketen (ETC). Daarnaast werden twee extra microplaat respirometrische assays ontwikkeld dat de beoordeling van de coördinatie betwee staatn de tricarbonzuur (TCA) cyclus en ETC en tussen ß-oxidatie en de ETC. Belangrijk is dat de gepresenteerde methoden zorgen voor een duidelijke en beknopte manier om mechanistische veranderingen in de mitochondriale functie in een veel gebruikte diermodel meten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De informatie in dit artikel methoden bieden stap-voor-stap instructies voor het uitvoeren van een verzameling van microplaat respirometrische testen met behulp van mitochondriën geïsoleerd 75-100 mg muis skeletspieren. Deze assays kunnen worden uitgevoerd met een hoge nauwkeurigheid zoals blijkt uit de nauwe standaardafwijking tussen drievoudige putjes. Belangrijk is dat deze respirometrische assays toelaten lokaliseren waar afwijkingen en / of aanpassingen kunnen voorkomen in de ETC, TCA cyclus, β-oxidatie route substraat transporters, etc. Het is gebruikelijk diermodel.
Het is belangrijk de rationale voor het gebruik van verschillende brandstoffen en inhibitoren gebruikt in dit protocol te markeren. Het pyruvaat / malaat en glutamaat / malaat respirometrische assays mogelijk maken de beoordeling van Complex I gemedieerde ademhaling, evenals de beoordeling van de respectieve transporteurs, en in het geval van glutamaat, de deaminase 15. Als alternatief kan de combinatie vansuccinaat / rotenone laat de beoordeling van mitochondriale respiratoire flux door Complex II van de ETC sinds rotenone remt complex I en succinaat biedt elektronen Complex II via de vermindering van flavineadeninedinucleotide (FADH 2) 15. Deze testen geven substraat specifieke informatie over koppelingsefficiëntie en maximaal ademhaling. De elektronenstroom test is uniek doordat de combinatie van substraten en remmers maakt de beoordeling van meerdere complexen in mitochondriale respiratoire flux 9. De aanvankelijke substraat mix van pyruvaat / malaat + FCCP maakt de evaluatie van de maximale ademhaling aangedreven door Complex I, terwijl de injectie van rotenon gevolgd door succinaat maakt de beoordeling maximale ademhaling aangedreven door Complex II. De injectie van Antimycin A, een remmer van complex III, gevolgd door de injectie van ascorbaat / TMPD kan de voor de evaluatie van de ademhaling veroorzaakt door Complex IV aangezien de Ascorbaat / TMPD eenelektron donor van cytochroom C / Complex IV. Hoewel geen informaties over koppelrendement wordt verkregen, is de werkwijze geschikt voor zeer kleine monsters te beletten dat het uitvoeren van meerdere substraten onafhankelijk. Tenslotte, het gebruik van palmitoyl carnitine / malaat maakt de beoordeling van de coördinatie tussen β-oxidatie en de ETC omdat de reducerende equivalente geproduceerd door de oxidatie van palmitinezuur (β-oxidatie) meegenomen in de ETC via de electron flavoproteïne 15 overdragen. Opgemerkt wordt dat de koppeling en elektronenstroom assays ook kunnen worden gebruikt in combinatie met veranderingen in de mitochondriale functie te identificeren vanwege enkele interventie (behandeling met geneesmiddelen, genetische manipulatie).
De hoge nauwkeurigheid bereikt bij deze testen is voornamelijk het gevolg van grondig mengen van mitochondria, of het vóór eiwitbepaling, of met het substraat oplossingen. Langs deze lijnen, zodra de mitochondria is resuspendend in het substraat solutions, is het essentieel om deze oplossing grondig vóór het laden van de celkweek plaat zoals beschreven in stap 2.2 met een verbrede opening pipetpunt mengen. Als de mitochondriën meng leidt tot grote variatie binnen de assay. Bovendien, met een smalle opening pipetpunt wordt afschuifkrachten creëren tijdens het mengen van de mitochondriën en verhoogt het potentieel om de mitochondriale membranen en afgifte van cytochroom C. De hechting trap (2,7) is een kritische stap in het protocol beschadigen. Verzuim om de beladen celkweekplaat lang / snel genoeg draaien zal resulteren in een onvolledige naleving van de mitochondriën naar de bron, hetgeen leidt toegenomen variabiliteit tussen putten en metingen.
Is geoptimaliseerd de beschreven protocol op te nemen: het laden van een optimale hoeveelheid van mitochondriaal eiwit per putje, met behulp van de juiste concentraties / bereidingswijzen om de balans en de ondergrond oplossingen te maken, het veranderen van de test run om mitochondriale staat pla zorgenteaus en passende vermenging van de mitochondriale voorraad en mitochondriale / substraat mixen. Voorafgaand aan deze optimalisatie inspanningen, de auteurs aangetroffen valkuilen in de test run. De volgende bespreekt methoden / wijzigingen die nuttig zijn bij het optimaliseren van dit protocol waren het oplossen van problemen. Met betrekking tot een optimale belading, zal het laden te weinig mitochondria niet ontlokken een robuuste reactie, tijdens het laden te veel mitochondriën zal de zuurstof uitlaat binnen de microkamer en leiden tot onnauwkeurige metingen. Rogers et al 9 geeft voorbeelden van het bepalen van de optimale belading hoeveelheden mitochondriën per goed voor microplaat respirometrische assays. Vaker, is te veel mitochondriën per geladen en, zoals blijkt uit de staat 2 tarieven meer dan 100-200 pmol / min / goed en de toestand 3 tarieven> 1500 pmol / min / goed. Als over lading optreedt, voert een experiment met verschillende concentraties van mitochondriale eiwit (bijvoorbeeld tussen 1 -. 10 ug) tot OCRs lokken binnen de dynamische range van het zuurstofverbruik meetmachine. De voorbereiding en het gebruik van de juiste concentraties van substraten en de voorraden is van het allergrootste belang. Gebruik altijd de zure vorm van substraten / injecties en de pH met kalium hydroxide of HCl; natrium buffers / oplossingen worden niet aanbevolen. Daarnaast resuspenderen substraten / voorraden in DMSO of 100% ethanol zal resulteren in de meting storing of fout. Zorg ervoor dat u 95% ethanol te gebruiken indien aangegeven. Het is gebruikelijk palmitoyl carnitine neerslaan van de 95% ethanol na het ontdooien van de bevroren voorraad, waardoor grote variabiliteit. Zorg ervoor dat u op te warmen de palmitoyl carnitine voorraad en vortex goed voor gebruik. Bovendien kan een zeer variabele pyruvaat / malaat testresultaat vanwege het pyruvaat stock wezen> 2 weken oud. Zorg ervoor dat bevroren monsters van pyruvaat om de 2 weken remake. De test run werd gewijzigd om 2-min metingen om mitochondriale staat plateaus zorgen. Als observatie van uitputting van ADP gewenst is, kan de onderzoekerverlenging van de meettijd onder het tabblad "Protocol" in het "Test Wizard" forum. Tot slot, grote variabiliteit treedt op wanneer de mitochondriale voorraad en mitochondriën plus substraatoplossingen niet volledig vóór het laden gehomogeniseerd. Als variabiliteit tussen de putten is hoog na de test run, moet u de substraat oplossing volledig te mengen voorafgaand aan het volgende experiment. Vortex nooit de mitochondriën / substraat oplossingen, in plaats van roer, puree, en voorzichtig vermaal met een verbrede opening pipetpunt.
Er zijn enkele beperkingen van deze techniek die het vermelden waard zijn. Ten eerste, het aantal putten op de celkweekplaat voor deze testen is relatief laag (bijv., 24 wells en minstens 2 aangewezen blanco wells). Indien het gewenst is om alle 5 van deze testen uit te voeren op een plaat, de onderzoeker slechts in staat om de antwoorden van één muis te onderzoeken tegelijk. Er moet echter worden opgemerkt dat 96 ook instrumenten beschikbaar voor higher throughput. Ten tweede zijn er inherente sterke en zwakke punten beoordelen mitochondriale dysfunctie in geïsoleerde mitochondriën in vergelijking met intacte cellen 1. Enkele zwakke omvatten met minder fysiologische relevantie vergelijking met intacte cellen en induceren voorwerpen uit het isolatieproces. Tenslotte, het succes van deze werkwijze is afhankelijk van de kwaliteit van het mitochondriale isolatieproces.
Hoewel sommige van deze testen zijn ofwel ontwikkeld in verschillende systemen of gevalideerd in andere dierlijke modellen, de hierin gepresenteerde methoden zijn eerste alle bovengenoemde bepalingen synthetiseren voor optimaal gebruik in een multi-well zuurstofverbruik meetmachine met de muis skeletspier. Belangrijk al 5 deze assays kunnen worden uitgevoerd met de hoeveelheid mitochondriën geïsoleerd uit ~ 75 – 100 mg muis skeletspieren, waardoor hoge doorvoer met minimale materiaal. Van groot belang is het vermogen van multi-wellzuurstofverbruik technologieën assays met minimale hoeveelheden mitochondria, gecombineerd met een geoptimaliseerde isolatie werkwijze uit te voeren, kan de onderzoeker een veelheid van andere experimenten met de rest van skeletspierweefsel (bv., western blots uitgevoerd, RT-PCR, enzymatische assays, etc.), die vaak een strijd met dit diermodel.
Tot slot, de hier gepresenteerde methoden bieden stap-voor-stap instructies voor het uitvoeren van een verzameling van microplaat respirometrische assays met minimale hoeveelheden muis skeletspieren. Belangrijk is dat de gepresenteerde methoden vereisen minimale hoeveelheden weefsel en mitochondria. Eenmaal knie, zal de hierin beschreven technieken kunnen onderzoekers een mogelijk mechanisme van een verbinding of genproduct op mitochondriale zuurstofverbruik bepalen een veelgebruikte diermodel.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.
Materials
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | Store at room temperature |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | Store at room temperature |
| Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0% | Sigma Aldrich | P5379 | Store at room temperature |
| Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0% | Sigma Aldrich | M9272 | Store at room temperature |
| HEPES minimum 99.5% titration | Sigma Aldrich | H3375 | Store at room temperature |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | Store at room temperature |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | Store at 4°C |
| Acid Free- BSA | |||
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4°C |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | Store at room temperature |
| 99%, powder [TMPD] | |||
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20°C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20°C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8°C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20°C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20°C |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
References
- Brand, M., Nicholls, D. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
- Wang, H., Hiatt, W. R., Barstow, T. J., Brass, E. P. Relationships between muscle mitochondrial DNA content, mitochondrial enzyme activity and oxidative capacity in man: alterations with disease. European Journal of Applied Physiology and Occupational Physiology. 80, 22-27 (1999).
- Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. The mitochondrial genome in aging and senescence. Ageing Research Reviews. 18C, 1-15 (2014).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, 1145-1159 (2012).
- Dube, J. J., et al. Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance. Endocrinology and Metabolism. 307, E1117-E1124 (2014).
- Disease Control and Prevention Services. National diabetes statistics report: estimates of diabetes and its burden in the United States. , (2014).
- Guarino, R. D., et al. Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration. Biotechnology and Bioengineering. 86, 775-787 (2004).
- Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nature Protocols. 1, 2563-2572 (2007).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6, e21746 (2011).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, C125-C136 (2007).
- Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods (San Diego, Calif.). 26, 292-297 (2002).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Frisard, M. I., et al. Low levels of lipopolysaccharide modulate mitochondrial oxygen consumption in skeletal muscle. Metabolism. 64, 416-427 (2015).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Advances in Enzymology and Related Subjects of Biochemistry. 17, 65-134 (1956).
- Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and respiratory control. , (2007).
