Usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para alta taxa de transferência de microplacas respiratórias Medições
Summary
The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.
Abstract
Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.
Introduction
O principal papel fisiológico das mitocôndrias do músculo esquelético é produzir ATP a partir de 1 de fosforilação oxidativa. É importante ressaltar que as mitocôndrias musculares esqueléticas desempenhar um papel específico na capacidade de exercício 2, 3 envelhecimento, doença degenerativa 4 e diabetes tipo II 5. Como o envelhecimento da sociedade, e diabetes Tipo II sendo o 7º principal causa de morte nos Estados Unidos 6, a necessidade de métodos para avaliar a função mitocondrial tornou-se cada vez mais prevalente na investigação biomédica 7,8. Especificamente, a medição do consumo de oxigênio tem utilidade excepcional na avaliação da função mitocondrial, uma vez que representa a função coordenada entre os genomas mitocondriais e nucleares para expressar os componentes funcionais da fosforilação oxidativa 9.
Várias tecnologias existem que permitem a medição do consumo de oxigénio em células intactas e isolard mitocôndrias 7-10. Além disso, os ensaios foram desenvolvidos para vários tipos de células e tecidos, e uma variedade de espécies que permitem a medição das vias respiratória mitocondrial e controlo 9,11,12. No entanto, não existe actualmente um vazio na literatura no que diz respeito à compilação de todos estes ensaios utilizando mitocôndrias isoladas de rato músculo esquelético para utilização em tecnologias de consumo de oxigénio em microplacas. É importante ressaltar que o uso de microplacas ensaios respirométricos está crescendo entre os biólogos mitocondriais e permite medições de alto rendimento, utilizando quantidades mínimas de mitocôndrias isoladas 9. Portanto, uma coleção de ensaios em microplacas respirométricos foram desenvolvidos que permitem identificar de onde anomalias e / ou adaptações podem estar ocorrendo na cadeia de transporte de elétrons (ETC). Além disso, dois ensaios respirométricos em microplacas adicionais foram desenvolvidos que permitem a avaliação da coordenação between o ciclo de ácido tricarboxílico (TCA) e do ETC, e entre ß-oxidação eo ETC. É importante ressaltar que os métodos apresentados fornecem uma maneira clara e concisa para medir mudanças mecânicas em função mitocondrial em um modelo animal comumente usados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os métodos apresentados neste artigo fornecem instruções passo-a-passo para a realização de uma coleção de ensaios em microplacas respirométricos utilizando mitocôndrias isoladas 75-100 mg de rato músculo esquelético. Estes ensaios podem ser realizados com grande precisão como evidenciado pelo desvio padrão apertado entre poços em triplicado. É importante ressaltar que estes ensaios permitem identificar respirométricos de onde anomalias e / ou adaptações podem estar ocorrendo na ETC, ciclo TCA, via β-oxidação, transportadores de substrato, etc. em um modelo animal comumente usados.
É importante destacar a justificativa para o uso vários combustíveis e inibidores utilizados neste protocolo. O piruvato / malato e glutamato / malato respirométricos ensaios permitem a avaliação de respiração mediada Complexo I, bem como a avaliação dos respectivos transportadores, e, no caso de o glutamato, a desaminase 15. Alternativamente, a combinação desuccinato / rotenone permite a avaliação de fluxo respiratória mitocondrial através Complexo II da ETC desde rotenone inibe complexo I e succinato fornece elétrons para Complex II através da redução da flavina adenina dinucleotídeo (FADH 2) 15. Estes ensaios fornecem informações específicas de substrato como a eficiência de acoplamento e respiração máxima. O ensaio de fluxo de electrões é único na medida em que a combinação dos substratos e inibidores permite a avaliação de complexos de múltiplas durante o fluxo respiratório mitocondrial 9. A mistura de substrato inicial de piruvato / malato + FCCP permite a avaliação da respiração máxima impulsionado por Complexo I, enquanto que a injecção de rotenona seguido por succinato permite a respiração para a avaliação máxima impulsionado por complexo II. A injecção de antimicina A, um inibidor do complexo III, seguindo-se a injecção de ascorbato / TMPD permitir que o para a avaliação da respiração impulsionado por complexo IV uma vez que o ascorbato / TMPD é umdoador de elétrons para citocromo C / Complexo IV. Embora nenhuma informação sobre a eficiência de acoplamento é obtido, o método é ideal para amostras muito pequenas que impedem a execução de vários substratos de forma independente. Finalmente, a utilização de palmitoil carnitina / malato permite a avaliação da coordenação entre β-oxidação e a etc desde o equivalente reduzindo produzido a partir da oxidação do ácido palmítico (β-oxidação) alimentar o ETC através do electrão transferência flavoproteína 15. Deve notar-se que os ensaios de fluxo de acoplamento de electrões e também poderiam ser usados em conjunto para identificar alterações na função mitocondrial devido a alguma intervenção (tratamento da toxicodependência, manipulação genética).
A elevada precisão alcançadas para estes ensaios é principalmente devido a uma mistura completa das mitocôndrias, quer seja antes da determinação da proteína, ou com as soluções de substrato. Ao longo destas linhas, uma vez que a mitocôndria é resuspendend no solutio substratoNS, que é crítico para misturar esta solução cuidadosamente antes de carregar a placa de cultura celular tal como descrito na etapa 2.2, com uma ponta de pipeta de orifício alargado. A falha em misturar cuidadosamente as mitocôndrias irá conduzir a grande variação dentro do ensaio. Além disso, usando uma pipeta de orifício de ponta estreita vai criar forças de cisalhamento durante a mistura a mitocôndria e aumenta o potencial para danificar as membranas mitocondriais e libertação do citocromo C. O passo de aderência (2.7) é também um passo crítico neste protocolo. A falha para girar a placa de cultura celular carregado longa / suficientemente rápido resultará na adesão incompleta das mitocôndrias para o poço, levando, assim, aumentada a variabilidade entre poços e medições.
O protocolo descrito foi otimizado para incluir: carregar uma quantidade ideal de proteína mitocondrial por poço, utilizando as concentrações / métodos de preparação corretos para fazer soluções de reserva e de substrato, alterando o ensaio de execução para garantir pla estado mitocondrialteaus, ea mistura adequada das ações e mitocondrial / substrato mitocondriais misturas. Antes destes esforços de otimização, os autores encontraram armadilhas no ensaio de execução. A seguir discute métodos de resolução de problemas / modificações que foram úteis na otimização deste protocolo. Com relação à carga ideal, carregamento muito pouco mitocôndrias não vai provocar uma resposta robusta, ao carregar demais mitocôndrias irá esgotar o oxigênio dentro do microc�ara e levar a medições imprecisas. Rogers et al 9 fornece exemplos de determinação dos montantes de carregamento ideais de mitocôndrias por poço para microplacas ensaios respirométricos. Mais frequentemente, demasiado mitocôndria é carregado por poço como evidenciado pelo estado 2 taxas sobre 100-200 pmol / min / bem e estado 3 Taxas> 1500 pmol / min / poço. Se ocorre ao longo de carregamento, realizar uma experiência com concentrações variáveis de proteína mitocondrial (por exemplo, entre 1 -. 10 ^ g) para induzir OCRs dentro do r dinâmicaange da máquina de medição do consumo de oxigênio. Preparação e colocação das concentrações corretas de substratos e estoques é de extrema importância. Sempre utilizar a forma de ácido de substratos / injecções e ajustar o pH com hidróxido de potássio ou HCl; buffers de sódio / soluções não são recomendados. Além disso, substratos ressuspensão / stocks em DMSO ou etanol 100% resultará em falha de medição ou erro. Certifique-se de usar etanol a 95% onde indicado. É comum para palmitoil carnitina para precipitar para fora do etanol a 95% após o descongelamento do lote congelado, causando, assim, uma grande variabilidade. Certifique-se de aquecer o estoque palmitoyl carnitina e vortex bem antes de usar. Além disso, uma altamente variável piruvato / malato resultado do ensaio pode ser devido ao ser da piruvato> 2 semanas de idade. Certifique-se de refazer alíquotas congeladas de piruvato a cada 2 semanas. A corrida ensaio foi modificado para 2 mínimo de medidas para assegurar planaltos estaduais mitocondriais. Se a observação de exaustão de ADP é desejado, o pesquisador podeestender o tempo de medição sob a guia "Protocolo" no âmbito do fórum "Assistente de Ensaio". Finalmente, uma grande variabilidade ocorre quando o banco de soluções e mitocôndrias mitocondrial mais substrato não são homogeneizadas totalmente antes do carregamento. Se variabilidade entre os poços é alta após o ensaio de funcionamento, certifique-se misturar completamente a solução de substrato antes do próximo experimento. Nunca vortex as soluções mitocôndrias / substrato, em vez agitar, mash, e triturar delicadamente com uma pipeta de ponta orifício alargado.
Existem algumas limitações desta técnica que são dignos de nota. Em primeiro lugar, o número de poços na placa de cultura de células utilizado para estes ensaios é relativamente baixa (isto é., De 24 poços e, pelo menos, 2 designado para poços em branco). Se for desejado para executar todos os 5 desses ensaios sobre um prato, o pesquisador só é capaz de analisar as respostas de um rato de cada vez. No entanto, deve notar-se que 96 de instrumentos também estão disponíveis para higher taxa de transferência. Em segundo lugar, há pontos fortes e fracos inerentes na avaliação da disfunção mitocondrial em mitocôndrias isoladas em comparação com 1 em células intactas. Algumas fraquezas incluem ter relevância fisiológica menos em comparação com células intactas e induzindo artefatos do processo de isolamento. Finalmente, o sucesso deste método depende da qualidade do processo de isolamento mitocondrial.
Embora alguns destes ensaios foram ambos desenvolvidos em sistemas diferentes ou ter sido validada em outros modelos animais, os métodos aqui apresentados são os primeiros a sintetizar todos os ensaios acima mencionados para a utilização óptima de um multi-poços máquina de medição do consumo de oxigénio utilizando rato músculo esquelético. Mais importante, todos os 5 desses ensaios podem ser realizados com a quantidade de mitocôndrias isoladas de ~ 75 – 100 mg de músculo esquelético do rato, proporcionando assim material de alto rendimento com um mínimo. De grande importância, a capacidade de multi-poçostecnologias de consumo de oxigénio para executar os ensaios com quantidades mínimas de mitocôndrias, combinada com um método de isolamento optimizado, permite ao investigador para executar uma multiplicidade de outras experiências com o resto do tecido do músculo esquelético (por exemplo., Western blots, RT-PCR, ensaios enzimáticos, etc.), que muitas vezes é uma luta com este modelo animal.
Em conclusão, os métodos aqui apresentados fornecem instruções passo-a-passo para a realização de uma coleção de ensaios em microplacas respirométricos usando quantidades mínimas de rato músculo esquelético. Mais importante, os métodos apresentados requerem quantidades mínimas de tecido e mitocôndrias. Uma vez dominado, as técnicas aqui descritas irão permitir que os investigadores a determinar um mecanismo potencial de um composto ou produto do gene mitocondrial no consumo de oxigénio em um modelo animal utilizado.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.
Materials
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | Store at room temperature |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | Store at room temperature |
| Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0% | Sigma Aldrich | P5379 | Store at room temperature |
| Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0% | Sigma Aldrich | M9272 | Store at room temperature |
| HEPES minimum 99.5% titration | Sigma Aldrich | H3375 | Store at room temperature |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | Store at room temperature |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | Store at 4°C |
| Acid Free- BSA | |||
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4°C |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | Store at room temperature |
| 99%, powder [TMPD] | |||
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20°C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20°C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8°C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20°C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20°C |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
References
- Brand, M., Nicholls, D. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
- Wang, H., Hiatt, W. R., Barstow, T. J., Brass, E. P. Relationships between muscle mitochondrial DNA content, mitochondrial enzyme activity and oxidative capacity in man: alterations with disease. European Journal of Applied Physiology and Occupational Physiology. 80, 22-27 (1999).
- Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. The mitochondrial genome in aging and senescence. Ageing Research Reviews. 18C, 1-15 (2014).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, 1145-1159 (2012).
- Dube, J. J., et al. Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance. Endocrinology and Metabolism. 307, E1117-E1124 (2014).
- Disease Control and Prevention Services. National diabetes statistics report: estimates of diabetes and its burden in the United States. , (2014).
- Guarino, R. D., et al. Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration. Biotechnology and Bioengineering. 86, 775-787 (2004).
- Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nature Protocols. 1, 2563-2572 (2007).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6, e21746 (2011).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, C125-C136 (2007).
- Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods (San Diego, Calif.). 26, 292-297 (2002).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Frisard, M. I., et al. Low levels of lipopolysaccharide modulate mitochondrial oxygen consumption in skeletal muscle. Metabolism. 64, 416-427 (2015).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Advances in Enzymology and Related Subjects of Biochemistry. 17, 65-134 (1956).
- Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and respiratory control. , (2007).
